Abstract
A importância do RNA Piwi-interagindo (piRNA) via para a manutenção de células germinativas, a integridade do genoma, a metilação do DNA e controle retrotransposon levanta possíveis papéis desta via no câncer. Na verdade expressão aberrante de orthologs piwi humanos e
Maelstrom
tem sido observado em vários cancros. Neste estudo, nós exploramos a expressão ea função dos genes da via Pirna no cancro do ovário humano, baseado no nosso trabalho recente, que mostraram expressão generalizada de genes da via Pirna no mamífero. Nossos programas de trabalho que
PIWIL1
e
MAEL
expressão é aumentada significativamente em EOC maligna (n = 25) em comparação com tecidos tumorais benignas (n = 19) e tecido ovariano normal (n = 8) . A expressão de
PIWIL3
é menor em tecidos malignos e benignos quando comparado com ovário normal. A sequenciação de
PIWIL1
transcrito revelou que em muitos tumores deleção do exão 17 permite a introdução de um codão de paragem prematuro no domínio piwi, provavelmente devido a um erro de splicing.
In situ
hibridação em secções de tumor revelou que
L1
,
PIWIL1
,
2
e
MAEL
são especificamente expressos em epitelial células (células cancerosas) do EOC. Além disso,
PIWIL2
e
MAEL
são co-expressos nas células do estroma adjacentes a células tumorais. Desde
PIWIL1
e
MAEL Quais são-se regulamentada em EOC maligno e expressa nas células epiteliais, investigamos se estes dois genes afetam invasão de linhas de células de cancro do ovário que normalmente não expressam estes genes.
PIWIL1
e
MAEL
foram transitoriamente ao longo expressa na linha de células de cancro do ovário SKOV3, seguido de medições em tempo real de invasão celular. Surpreendentemente ambos
PIWIL1
e
MAEL
sobre a expressão diminuiu a capacidade de invasão das células SKOV3. Nossos resultados suportam um crescente corpo de evidência que mostra que os genes nesta via está regulada no cancro. No câncer de ovário mostramos pela primeira vez que
Piwil1
transcrição pode muitas vezes ser resultado anormal no produto não funcional. Ao contrário do que tem sido observado em outros tipos de células, descobrimos que
PIWIL1
e
MAEL
ter um efeito repressivo sobre invasão celular
Citation:. Lim SL, Ricciardelli C, Oehler MK, de Arao Tan IMD, Russell D, Grützner F (2014) sobre-expressão de genes piRNA Caminho no epitelial cancro do ovário. PLoS ONE 9 (6): e99687. doi: 10.1371 /journal.pone.0099687
editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América
Recebido: 16 Janeiro, 2014; Aceito: 19 de maio de 2014; Publicação: 16 de junho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Lim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Universidade de Adelaide. F.G. é apoiado por uma bolsa ARC (Australian Research Council). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de ovário é o câncer ginecológico mais letal, e a quinta causa de morte relacionada ao câncer entre as mulheres no mundo ocidental [1]. A taxa de sobrevivência relativa de cinco anos para as mulheres com câncer de ovário é de apenas cerca de 40% [1]. cancros do ovário são tumores heterogêneos que apresentam características morfológicas distintas, mutações genéticas e origens. Existem três tipos principais de câncer de ovário – epitelial, células germinativas e sexo tumores estromais cabo. tumores de células germinais do ovário e tumores do estroma da medula sexo compreendem 10% de cancros do ovário, e são derivadas de células germinais primitivas ou células mesenquimais do ovário no tecido derivado sexo-cabo do ovário, respectivamente [2]. EOCs representam mais de 90% das neoplasias malignas do ovário. Baseado em EOCs histologia são classificados em quatro subtipos principais (serosa, mucinoso, endometrióide e carcinomas de células claras) com mais de 70% dos casos diagnosticados como carcinomas serosos (SCs) [3].
Alterações da paisagem epigenética tais como hipometilação do DNA global e gene hipermetilação DNA específica são frequentemente relatados em células cancerosas [4]. hipometilação do DNA global afeta em grande parte das regiões intergênicas e intrônicas do genoma, especialmente repetir sequências e elementos transponíveis (TEs), que respondem por cerca de 55% do genoma humano [5], incluindo 17%
L1
repete [ ,,,0],6]. Em células somáticas, a metilação do DNA de EA é crucial para impedir a sua expressão, que pode pôr em risco a integridade do genoma. Durante o desenvolvimento de células germinativas, há um período transiente de hipometilação de DNA global, que resulta na activação temporária de EA [7].
A via piRNA é evolutivamente conservada em altamente metazoários e consiste de 21-26 nt que se ligam piRNAs piwi proteínas para mediar controlo pós-tradução da expressão de TE e desempenhar um papel na alteração epigenética (tais como a metilação do DNA), através de interacção com outras proteínas (tais como MAEL ou HP1) [8], [9]. Nos mamíferos existem vários
Piwi como
(
Piwil
) genes (três em ratos, quatro em seres humanos). Expressão de
Piwil
genes e Pirna via associada genes tem sido demonstrado em vários estágios de desenvolvimento de células germinativas em particular no testículo.
Piwil1
(
Miwi
) já havia sido identificado como um gene expresso exclusivamente no testículo do rato e essencial para a espermatogênese [10]. Mais recentemente a expressão de
Piwil1
também foi demonstrada em ratinhos e ovário humano [11]. A mutação do
Piwil2
,
Piwil4
e
Mael
no rato leva a fenótipos semelhantes, incluindo a eliminação de metilação do DNA TE e esterilidade masculina [8]. Existe agora crescente evidência de atividade piRNA também no ovário mamífero, no entanto nocautear experimentos do gene da via piRNA em ratos até agora só levou a esterilidade masculina [12] – [14].
evidência que existe de montagem da atividade da via piRNA em vários cancros. Expressão de
PIWIL1
e
PIWIL2
foi encontrado em uma ampla gama de cancros humanos, tais como estômago, mama, trato gastrointestinal e endométrio [15] – [18] e, recentemente, também no carcinoma do ovário [19]. expressão de
Aumento PIWIL1
está associada ao crescimento do tumor reforçada [20] graus aumento de tumor [21], os resultados de diagnóstico pobres [22] e mortalidade [23].
PIWIL2
é amplamente expresso em mama em estágio inicial e os cancros do colo do útero e células-tronco pré-cancerosas envolvidos na tumorigênese [18]. O padrão de expressão
PIWIL3
e
4
só foi estudada em cancros do cólon [24].
Maelstrom
(
MAEL
) é um gene do câncer de testículo conhecido [25].
A nossa descoberta de expressão em células somáticas ovarianos [11] juntamente com a diminuição da metilação do DNA em
L1 e região promotora associada com a progressão do câncer cervical e do útero [26] e mau prognóstico em carcinomas ovarianos [27] nos levou a investigar se os genes da via Pirna poderia desempenhar um papel na EOCs. Neste estudo, foi investigada a expressão de
PIWIL1 Restaurant –
4
e
MAEL
em 25 EOC, 19 amostras de tumores benignos e 8 tecidos ovarianos normais. Encontramos expressão significativamente elevada de
PIWIL1
e
MAEL
em EOC em comparação com tecidos de ovário benignos e normais. No entanto,
PIWIL1
transcrições em EOC pode não ser funcional devido a deleções identificados no domínio piwi desta transcrição. Além disso, a sobre-expressão de
PIWIL1
e
MAEL
sugere um papel desses genes na redução células de cancro do ovário invasão
in vitro
.
Materiais e Métodos
tecidos
total de RNAs de testículo humano e tecidos ovarianos pré-menopausa foram adquiridos de Stratagene (EUA). tecidos ovarianos malignos, benignos e normais (Tabelas 1 e S3) foram coletadas com consentimento informado por escrito do paciente e aprovação pela Comissão de Ética do Hospital Adelaide Royal Adelaide, South Australia.
celular linhas
linhas celulares de cancro do ovário humano SKOV3 e OVCAR3 foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, EUA), enquanto OVCAR5 foi obtido do Dr. Thomas Hamilton (Fox Chase Cancer Center, Filadélfia, PA) Johnson et ai câncer Res 57: 850-856 de 1997. As linhas celulares foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com L-glutamina (2 mM), penicilina-estreptomicina (100 U /ml, 100 ug /mL) (Sigma). células SKOV3 e OVCAR3 foram suplementados com FBS a 5% (Invitrogen), enquanto células OVCAR5 foram suplementados com FBS a 10% e 7,5 ug /ml de insulina. Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C numa câmara húmida com 5% de CO
2.
Isolamento de ARN e ADNc síntese |
O ARN foi isolado a partir de tecidos e linhas de células usando o reagente TRIzol (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. O ARN foi ressuspenso em água livre de nuclease, e armazenado a -80 ° C. O ARN foi tratado com ADNase I (New England Biolabs) antes da transcrição reversa. 1 ug de ARN foi utilizado para obter ADNc utilizando o sistema III Super Script primeira cadeia de síntese (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, o ARN foi incubado com 1 ul de 50 | iM de oligo (dT)
20 e 1 ul de dNTPs 10 mM durante 10 minutos a 65 ° C. Após incubação, foram adicionados 4 ul de tampão 5x RT, 2 ul de ditiotreitol (DTT, 0,1 M), 1 ul de RNaseOUT (40 U /mL) e 1 uL de enzima Super Script III RT (200 U /ul) e incubou-se durante 50 min a 50 ° C. A reacção foi terminada a 85 ° C durante 5 minutos. Os cDNAs foram armazenadas a -20 ° C.
análises de expressão génica
RT-PCR foi realizada para determinar o nível de ARNm para os genes piRNA cinco vias (Tabela S1) e beta actina (
ACTB
) em 52 amostras de doentes e 3 linhas celulares de cancro do ovário. Cada reacção continha 25 ul de 200 ng de ADNc, 5ul de 5x Vai Mistura de Taq verde mestre (Promega), 1 uL de solução de dNTP 5 mM (Roche), 0,5 � de cada iniciador (20 pmol /uL) e 0,5 � polimerase de ADN de Taq. As condições de PCR foram as mesmas para todos os genes, excepto a temperatura de emparelhamento (Tabela S1), e foram como se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 30 segundos, emparelhamento a temperatura específica do gene durante 30 segundos ( tabela S1), extensão a 72 ° C durante 1 min, 32 ciclos. PCR de
ACTB
controlo foi realizada com 27 ciclos, seguido de 5 min de extensão final a 72 ° C. Os produtos de PCR foram visualizados num gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio. intensidade da banda foi medida (quantidade Um programa, versão 4, Bio-Rad), e a intensidade relativa de cada gene foi normalizado para a de
ACTB
. Os produtos de PCR foram confirmados por sequenciação (kit de sequenciação de ciclo v3.1 Big Dye Terminator, Applied Biosystems). RT-PCR foi realizada em triplicado para cada par de iniciadores.
Análise estatística da expressão do gene
Os dados são apresentados como a expressão relativa mediana (quartil primeiro a terceiro quartil). O nível de transcrição de cada gene foi normalizado contra o
ACTB
. testes de Shapiro-Wilk de Kolmogorov-Smirnov e sugeriram que o nível de cada um dos genes a partir de todas as 52 amostras de expressão não é normalmente distribuída. Assim, um teste de Kruskal-Wallis, que utiliza um método não paramétrico, foi utilizado para comparar a expressão de genes a partir de grupos malignos, benignos e normais. teste de correlação de Spearman foi realizado para investigar a correlação entre a idade do paciente e consequente expressão do gene. R-valor mais próximo de 1 indica uma correlação positiva, enquanto que um valor r mais perto de -1 mostra uma correlação negativa mais forte. Nos testes de Kruskal-Wallis e Spearman, um valor P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
RNA
hibridização in situ
As sondas foram marcadas com digoxigenin-. 11-UTP (Roche Diagnostics), de acordo com o protocolo do fabricante. Fixadas em formalina secções de tecido embebidas em parafina foram deparaffinised em xileno e subsequentemente lavado em etanol graduado. Todas as soluções foram preparadas de dietilpirocarbonato (DEPC) tenha sido tratada com H
2O para inativar a atividade RNase. nucleoproteínas ligado a ARNm foram removidos por incubação com proteinase K (1.2μg /ml) (Roche Diagnostics), durante 30 minutos a 37 ° C. As lâminas foram lavadas com PBS 1x e acetilada (1 M trietanolamina /0,178% de HCl /0,25% de anidrido acético). As lâminas foram prehybridised a 65 ° C durante 2 horas com tampão de pré-hibridação (solução a 50% de formamida desionizada /2x SSC /1x de Denhardt /0,005 M de tampão fosfato a 10% de sulfato de dextrano /1 mg de ARN //ml de levedura totais /1 mg /ml de esperma de salmão ADN) e hibridado com cerca de 200 ng de sonda de ARNc em tampão de pré-hibridação durante a noite a 50 ° C numa câmara húmida. As lâminas foram lavadas em 2X SSC, 1x SSC, 0,5x SSC e 0,1x SSC durante 15 minutos cada, a 50 ° C. Para remover as sondas de ARNc não ligados, o tecido foi submetido a RNase A (150μg /ml) a digestão durante 30 minutos a 37 ° C. As sondas de ARNc especificamente ligados foram detectados utilizando um anticorpo anti-DIG acoplado a fosfatase alcalina com cloreto de nitrobluetetrazolium /X-fosfato-5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (NBT /BCIP) (Roche Diagnostics) como substrato cromogénico.
Clonagem e construir preparação para a invasão analisa
o
MAEL
(CCDS1257) e sequências de cDNA
PIWIL1
(CCDS9268) foram obtidos a partir do banco de dados do NCBI CCDS. sequência de ADNc de comprimento completo foi amplificado utilizando o sistema Expand High Fidelity PCR (Roche) de acordo com o protocolo do fabricante e clonado num vector de expressão de mamífero pcDNA3.1. Os DNAs de plasmídeo incluindo pcDNA 3.1 (Invitrogen) ou vectores vazios pEGFP-N1 (Clontech) foram transfectados em células SKOV3 LTX utilizando Lipofectamina (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. células SKOV3 foram selecionados devido ao seu endógena
L1
níveis de expressão e o fato de que eles não mostrou nenhuma expressão gênica via piRNA (Fig. 1C). Para cada transfecção, 8 × 10
4 SKOV3 células foram semeadas numa placa de 24 cavidades 14 horas antes da transfecção e foram cultivadas em RPMI 1640/5% de FBS sem penicilina-estreptomicina. O plasmídeo de ADN (500 ng) foi diluído em 100 ul de meio Opti-MEM (Invitrogen) e incubou-se com 0,5 � Além disso reagente (Invitrogen) e 2 ul de Lipofectamina LTX (Invitrogen) durante 30 minutos antes de serem adicionados a cada cavidade. Após 6 horas, o meio de cultura das células foi substituído por um novo RPMI 1640/5% de meio FBS e as células foram incubadas durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO
2 antes da colheita para
In vitro
invasão analisa. A transfecção de pEGFP-N1 vectores vazios em células SKOV3 permitiram a eficiência de transfecção de ser medido, como as células transfectadas com sucesso expressa a proteína GFP. O vector pEGFP-N1 foi sujeito às mesmas condições de crescimento e transfecção como descrito acima, para determinar a eficiência da transfecção que foi de aproximadamente 70% após 24 horas.
análises de RT-PCR de
PIWIL1-4
e
expressão MAEL
em (a) EOC maligno, cancros benignos do ovário (B) e ovários normais (C), linhas celulares de cancro de ovário. Esta é uma representação de 4 das 25 EOC maligno e 19 tecidos de câncer de ovário benignos. Aumento da expressão de
PIWIL1, 2, 4
e
MAEL
, mas não
PIWIL3
, são encontradas em cânceres malignos em comparação com tumores benignos. Todos os ovários normais mostrar
PIWIL2
e
PIWIL4
expressão, mas apenas alguns têm
PIWIL1, 3
e
MAEL
expressão. Sem endógena
PIWIL1, 2, 4
e
MAEL
expressão é detectada em células OVCAR3 e SKOV3. Ova * indica tecido de um jovem de 20 anos ovário pré-menopausa, enquanto outros ovários são de indivíduos com idade entre 44-76 anos de idade.
In vitro
analisa invasão com xCelligence
invasão celular foi testado com monitoramento em tempo real ensaio de invasão usando dispositivos da CIM e do sistema xCelligence DP (Roche Diagnostics) [28]. Resumidamente, 4 horas antes do ensaio de invasão, uma placa de CIM (Roche) foi revestida com factor de crescimento diluído 1:20 matriz reduzida Matrigel da membrana basal (~450μg /ml) (BD Biosciences). Então 40.000 células, untransfected ou transfectadas com vector vazio (Ev) ou
MAEL
ou
PIWIL1
vetores, foram semeadas em cada poço revestido. actividade celular foi seguido ao longo de um período de tempo de 72 horas, medindo o sinal de impedância na placa CIM. A actividade das células foi registada a cada minuto nas primeiras 12 horas e a cada 5 minutos durante as 12 horas seguintes. Em seguida, a partir de 24 horas em diante, até ao final da experiência, a actividade das células foi registada a cada 30 minutos. Em cada placa CIM, triplicatas de cada grupo foram realizados para obter a média eo desvio padrão. O experimento foi repetido três vezes.
PIWIL1
transcrição sequenciamento
O domínio piwi de
PIWIL1
transcrito foi amplificado por PCR e foram clonados produtos de diferentes tamanhos em pGEM-T Easy vector (Promega). Um total de 30 colónias positivas de diferentes bandas de PCR foram seleccionado a partir de cada reacção de ligação e os ADN plasmídicos foram purificados utilizando métodos padrão de lise alcalina (Qiagen) [29]. 200 ng de ADN de plasmídeo foram sequenciados (Big Dye Terminator v3.1 Kit Cycle Sequencing, Applied Biosystems) usando SP6 e primers universais T7.
Resultados
A expressão de genes da via Pirna é aumentada em maligno EOC em comparação com tumores benignos ou tecidos ovarianos normais
genes da via Pirna são consistentemente expressos no ovário mamífero [11]. A fim de investigar um possível papel desta via em EOC, foi realizada semi-RT-PCR quantitativa para investigar a expressão de
PIWIL1
,
PIWIL2
,
PIWIL3
,
PIWIL4
e
MAEL
em estágio avançado serosa EOC (n = 25), tumores de ovário benignos (n = 19) e tecido ovariano normal (n = 8) (Tabela 1, Tabela S3 e A Fig. 1A, B). análise semiquantitativa revelaram que os níveis de expressão relativa de
PIWIL1
e
MAEL
foram significativamente maiores no EOC maligna em comparação com tecidos benignos e normais (Fig. 2A, B). Os níveis de expressão relativa
PIWIL2
e
PIWIL4
em grupos malignos não foram significativamente diferente em tecidos ovarianos benignos ou normais (Fig. 2C, D). No entanto, a expressão de
PIWIL2
e
PIWIL4
são significativamente mais baixos em comparação com tumores benignos de tecido normal do ovário, sugerindo uma alteração da expressão do gene durante a progressão de EOC. A expressão relativa de
PIWIL3
é diferente de outro
PIWIL
genes de tal modo que a expressão desse gene é significativamente mais elevada no ovário normal, quando comparado com ambos os tecidos benignos e malignos (Fig. 2E) . Além disso, a expressão relativa de
PIWIL3
em células de ovário normal é positivamente correlacionada com a idade do paciente nos tecidos normais de ovário (n = 8) (r = 0,750, P = 0,05) (Tabela 2). Em contraste com
PIWIL3
,
PIWIL1
expressão está negativamente correlacionada com a idade dos pacientes (r = -0,737, P = 0,037).
PIWIL1
é expressa no crescimento folículos nos ovários antes da menopausa, mas dessa metade do estudo dos ovários testados eram de mulheres com menos de 50 anos de idade e que sejam susceptíveis de pré-menopausa.
Semi-quantitativa análise RT-PCR da expressão de ARNm (em relação a
ACTB
) de (a)
PIWIL1
, (B)
MAEL
, (C)
PIWIL2
, (D)
PIWIL4 Comprar e (e)
PIWIL3
. (M) P-valor de cada grupo de comparação. EOC maligno (n = 25), tecidos de cancro do ovário benignos (n = 19) e os ovários normais (n = 8). Teste de Kruskal-Wallis foi realizado para comparar o nível de expressão do gene entre dois grupos. dot preenchido indica média de cada grupo. * Indica 0,001 P 0,05; *** Indica P 0,001; NS, não significativo.
L1 Comprar e Pirna genes da via são mais expressos em células EOC
Para analisar o padrão de genes da via Pirna expressão e
L1
em EOC, RNA
in situ
hibridação foi realizada em EOC maligna (n = 5) e tumores do ovário benignos (n = 2) (Tabela 3, Fig. S1). Encontramos forte expressão de
L1
nas células epiteliais, mas
L1
estava ausente nas células estromais em todas as amostras (Fig. 3A, E). Além disso observou-se que a expressão de
L1
é variável em pacientes diferentes (Fig. 3a). forte expressão de
PIWIL1
foi encontrado nas células epiteliais em todos os tecidos EOC (Fig. 3B, F), enquanto
MAEL
e
PIWIL2
mostraram forte expressão nas células epiteliais e células do estroma de todos EOC examinados (Fig. 3C, G e D, H, respectivamente).
A análise in situ
de (A, A ‘, e)
L1
, (B, B ‘, F)
PIWIL1
, (C, C’, G)
MAEL
, (D, D ‘, H)
PIWIL2
em dois EOC maligna (AD de SC3 enquanto EH de SC2). (A’-D ‘) A amplificação de uma imagens-D, respectivamente. forte expressão de genes da via Pirna e
L1
foi encontrado no escamosas-se cubóide como células epiteliais de ambos EOC maligna, exceto
PIWIL1
que só expressa em SC2 mas não SC3.
L1
tem expressão irregular em algumas EOC de tal forma que algumas células epiteliais parecem ter expressão
L1
mais forte em comparação com outros.
MAEL
e
PIWIL2
mas não
PIWIL1
também são expressos nas células do estroma, tanto EOC. (E’-H ‘) Os controlos negativos com sonda sentido de
L1
,
PIWIL1
,
MAEL
e
PIWIL2
respectivamente. Ep = células epiteliais; S = células estromais. Barra de escala = 50 um.
Multiple
PIWIL1
transcrição existem variantes em EOC maligna
A amplificação por PCR do domínio piwi de EOC cDNAs produziu duas bandas distintas em comparação com cDNAs de testículo normal ou ovário (Fig. 4), sugerindo a presença de múltiplos
PIWIL1
transcrição variantes em EOC maligno. Os produtos de PCR a partir de testículos e EOC maligno foram extraídos, clonado e sequenciado. Vários alinhamentos de sequências do clone mostrou muitas modificações dentro do domínio piwi ao nível dos nucleótidos quando comparada com a dos testículos e publicada
PIWIL1
sequência de ADNc. alterações único par de bases foram identificados em
PIWIL1
transcrições de EOCs malignas (Tabela S2). Além disso, a maioria destes clones têm deleção do exão e intrões não excisado que introduzem os codões de paragem prematuro. É importante salientar uma deleção de 75 nt que composto por todo o exão 17 foi encontrada na maior parte dos clones sequenciados em 5 dos 28 pacientes do EOC (Fig. 4B). Além disso, alguns clones mostrou splicing parcial de intrões 15 e 16 (Fig. 4B) de tal forma que 17 pb e 20 pb a partir da extremidade 5 ‘do intrão 15 e 16, respectivamente, são não excisado. A fim de confirmar que as mutações são devidas a splicing, o DNA genómico de amostras de tumores foram isolados e sequenciados na região correspondente. Não foram identificadas mutações entre exons 15-18 (onde os erros de splicing ocorreram) na genômica
PIWIL1
sequência (Fig. S2). A fim de prever se as alterações pós-transcricionais acima afectar a função PIWIL1, sequências foram traduzidas e em comparação com o controlo (ADNc de testículos) e a sequência de péptido de publicada (AAC97371.2). A perda de todo o exão 17 (eliminação de 73 nt) em 11 clones introduziu um codão de paragem prematuro no domínio piwi (Fig. S3). De modo semelhante, os codões de paragem foram encontradas em clones que possuem intrões não excisado (não mostrado).
(A)
expressão PIWIL1
em tecidos de controlo (testículo humano, ovário normal (OV) 1, 2) e EOC SC1 tecido e 2. no controlo positivo, uma banda de 500 pb foi amplificado, mas em SC1 maligno, foram obtidas duas bandas. alinhamento múltiplo (B) de cDNA (parcial) que mostra que a maioria dos clones têm uma deleção do exão 17 (ΔΔ3) e 3 clones têm o splicing do intrão parcial 15 e 16 (). PIWIL1_ccds: publicada cDNA de
PIWIL1
(CCDS9268); Testículo C1: testis clone transcrição 1; B1-3, B6, B9-B14, C6, C8, C9, C10-C15, D1-D10: clones com
PIWIL1
transcrições
Mais de expressão de genes da via Pirna. reduz a capacidade de invasão
in vitro
a fim de investigar o possível papel dos genes da via Pirna na progressão do cancro, full-length
PIWIL1
ou
Mael
transcrições foram clonados e transfectada de forma transiente na linha de células do cancro do ovário SKOV3 e ensaiadas quanto à capacidade de invasão depois de 24 horas de transfecção. RT-PCR foi realizada para validar a inserção de plasmídeos para estas células. RT-PCR confirmou
GFP,
PIWIL1
ou
MAEL
sobre-expressão (Fig. S4A). Expressão de
MAEL
e
PIWIL1
construções manteve-se elevada nas células transfectadas 50 horas após a transfecção (Fig. S4A).
MAEL
,
PIWIL1
e de vector vazio (EV) células transfectadas e não transfectadas células SKOV3 foram aplicadas ao sistema xCELLigence para investigar o seu efeito na capacidade invasiva de células [30]. Surpreendentemente, a invasão de
MAEL
e
PIWIL1
células transfectadas foi menor em comparação com células vetor untransfected ou vazias (Fig. 5). invasão celular a partir de cada grupo começaram a atingir um patamar após 30 horas, portanto, apenas a actividade das células das primeiras 30 horas é mostrada. Nossos resultados sugerem que a superexpressão de
PIWIL1
e
MAEL
ter um efeito repressivo sobre invasão celular SKOV3.
PIWIL1
e
MAEL
células transfectadas têm menor capacidade de invasão em comparação com células não transfectadas e
Ev
células transfectadas. Em cada experimento, cada grupo foi realizado em triplicado e esta experiência foi repetida três vezes. Esta é uma representação gráfica de dados combinados de três experiências independentes para todos os grupos. As barras de erro representam o desvio padrão.
WT
indica células SKOV3 untransfected; vector vazio (Ev),
MAEL
e
PIWIL1
indicam células transfectadas com
MAEL
ou vetores
PIWIL1
.
Nenhum
indica bem sem células.
Discussão
A via piRNA é importante para TE silenciamento, regulação epigenética e células-tronco auto-renovação em uma ampla gama de organismos [31], [32]. hipometilação do DNA global e TE desrepressão, como
L1,
é uma característica comum dos genomas do câncer [33], [34] em seres humanos
PIWIL1
e
2
superexpressão tem foi observada em tumores a partir de vários tecidos [15] – [18], [21] – [23]. No entanto, ainda não é claro se os genes da via PIRNA são expressos diferencialmente no cancro do ovário ou ter um papel na progressão do tumor do ovário. Foi examinada a expressão de genes da via Pirna
PIWIL1 Restaurant –
4
,
MAEL
e
L1
em EOC maligno, tumores benignos e tecidos de ovário normais, e também investigou possíveis papéis de
PIWIL1
e
MAEL
em linhas celulares de cancro do ovário
a expressão de
PIWIL1 Restaurant -.
2
foi investigado em vários tecidos cancerosos [15] – [18], [21], [23], [35], mas não
MAEL
,
PIWIL3
e
. Embora a expressão de
PIWIL2
e
4
apareceu elevada em amostras de tumor esta não foi significativa, provavelmente devido ao fato de que
PIWIL2
e
PIWIL4
foram fortemente expressos em tecidos normais de ovário (Fig. 1B) e a sua expressão entre os tecidos malignos é altamente variável. A expressão de
PIWIL1
e
MAEL
no entanto é significativamente aumentada em EOC maligno quando comparado com tumores benignos.
PIWIL1
e
MAEL,
mas não
PIWIL2
e
4,
foram significativamente-se regulada quando comparado com ovários normais. Em contraste com a
PIWIL2
e
4
que são expressos em todos os tecidos ovarianos normais examinados, a expressão de
PIWIL1
e
MAEL
é encontrado apenas em um subconjunto de tecidos ovarianos normais de pacientes com menos de 50 anos de idade. Em células de ovário normal,
PIWIL1
e
MAEL
são expressos nas células do cumulus de folículos em crescimento em humanos [11]. Os tecidos ovarianos normais testados são de indivíduos com idade entre 44-76 anos de idade, e metade destas amostras foram derivadas de indivíduos com menos de 50 anos de idade. Assim, a expressão variável da
PIWIL1
e
MAEL
nos ovários normais poderia ser explicado pela diferença na abundância de folículos em crescimento, que expressam genes da via Pirna através das amostras.
MAEL
é conhecido como um gene de cancro /testículos, uma vez que é expresso nos testículos e um número de linhas de células de cancro [36]. Aqui nós identificamos pela primeira vez a expressão aumentada de
MAEL
em EOC maligno e tumores do ovário benignos. Semelhante a piwi, MAEL é essencial para assegurar a diferenciação de células-tronco de linha germinativa apropriada em
Drosophila
e outros vertebrados [37]. A sobre-expressão de genes de vias PIRNA em EOC pode indicar que algumas características de células estaminais estão presentes em células tumorais ou que a via piRNA foi activado, por exemplo por actividade de retrotransposões. A expressão destes genes pode também ser uma assinatura da presença de células estaminais do cancro do ovário [38].
A expressão de genes de vias PIRNA em ovário normal e certos tipos de EOC pode oferecer uma nova perspectiva sobre a origem de cancro do ovário. células somáticas do folículo a maturação pode entrar em contacto com o epitélio da superfície do ovário durante a ovulação ou podem estar presentes no quisto inclusão que se pensa desempenhar um papel na origem de cancro epitelial do ovário [3], embora a presença de cistos de inclusão parece não é per se aumenta o risco de desenvolvimento de cancro do ovário [39]. A hipometilação do
L1 e região promotora está correlacionada com o aumento da
L1
expressão de mRNA, em tecidos de cancro da mama malignos e linhas celulares [40], [41]. A expressão de
PIWIL
genes e
MAEL
em ambos os ovário normal e EOC maligna correlacionam-se com o aumento da expressão de elementos de repetição e levanta a possibilidade de que a via piRNA pode ter sido desencadeada pela expressão TE. No entanto, percebemos que
L1
expressão estava ausente nos tumores malignos fase anterior (n = 6), mas consistentemente presentes em todas as amostras de tumores estágio 3c. Isto proporciona algumas evidências circunstanciais de que a activação de genes de vias podem preceder PIRNA
L1
expressão durante a progressão tumoral. Isto é consistente com o trabalho em outros tumores que se correlacionam
expressão L1
com a progressão do câncer [42].
Maelstrom
nocautear resultados na metilação do DNA diminuiu em gônadas, mas não no tecido somático. Em gónadas isto conduz a um aumento dramático na expressão de elemento transponível nas células germinativas [43]. Nossa observação de
MAEL
superexpressão na ausência de detectável
expressão L1
em amostras de tumores em fase inicial levanta a possibilidade de que a não-funcional
MAEL
pode desempenhar um papel na diminuição DNA metilação promover a expressão
L1
subsequente.
Apesar de
PIWIL1
transcrição nível foi significativamente aumentada em EOC maligna em comparação com tecidos benignos e normais, clonagem e sequenciamento destas transcrições sugeriu que estes transcrições podem produzir proteínas PIWIL1 aberrante e não funcional. Múltiplas mutações foram encontradas em
PIWIL1
transcrições incluindo introns não excisado, perda de exons, bem como par mudanças de base única. Individuais de pares de bases alterações talvez um resultado de edição de ARN [44].