Único

Abstract

O hypericin perylene quinona perihydroxylated tem sido relatada a possuir potente anti-metastático e atividades antiangiogênicas, gerada pela segmentação diversas cruzamento de processos de promoção de câncer através de mecanismos exclusivos. Hipericina é o único reagente exógeno conhecido que pode induzir forçado poli-ubiquitinação e degradação acelerada da proteína de choque térmico 90 (Hsp90) em células cancerosas. proteínas Hsp90 cliente são assim desestabilizada e rapidamente degradada. proteínas clientes Hsp70 pode potencialmente também ser afetada via prevenção da formação de complexos intermediários Hsp90-hsp70. Mostramos aqui que a hipericina também induz a degradação aumentada da hipoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) em duas linhas celulares de tumores humanos, U87-MG glioblastoma e carcinoma de células renais-C2VHL – /- carcinoma das células renais e no pigmento da retina não-maligna ARPE19 A linha de células epiteliais. A rotatividade acelerada-hipericina de HIF-1α, o precursor de regulação do factor de transcrição HIF-1, o qual promove o stress hipóxico e as respostas angiogénicas, supera a estabilização da proteína HIF-1α fisiológico que ocorre em células hipóxicas. O efeito hipericina também elimina os altos níveis de HIF-1α expressa constitutivamente na proteína de von Hippel-Lindau (pvhl) -deficient CCR-C2VHL – /- linha celular de carcinoma de células renais. Ao contrário da ubiquitina-proteassoma volume normal, dependente da via de HIF-α proteínas que ocorre em normoxia, o catabolismo de HIF-1α induzida por hipericina pode ocorrer independentemente dos níveis de oxigénio alveolar ou pvhl-promovido ligadura ubiquitina de HIF-1α. Ele é mediada por enzimas lisossomais catepsina-B com a actividade da catepsina-B a ser optimizado nas células através da redução mediada por hipericina do pH intracelular. Os nossos resultados sugerem que a hipericina podem potencialmente ser úteis na prevenção do crescimento de tumores em que o HIF-1α desempenha um papel central, e em pvhl ablated células tumorais, tais como carcinoma de células renais por meio de eliminação de conteúdos elevados de HIF-1α nestas células, da redução do excesso angiogênese, que caracteriza estes tumores

Citation:. Barliya T, Mandel M, Livnat T, Weinberger D, a degradação do HIF-1alfa sob hipóxia Combinado com indução de Hsp90 Polyubiquitination em células cancerosas por Hypericin Lavie G (2011): uma terapia original do cancro. PLoS ONE 6 (9): e22849. doi: 10.1371 /journal.pone.0022849

editor: Anil Kumar Tyagi, Universidade de Delhi, Índia |

Recebido: 30 de março de 2011; Aceite: 30 de Junho de 2011; Publicado: September 19, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Barliya et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado pelo Cancer Association Israel, Grant 20090033 (https://ica.cancer.org.il/english/) graças a uma contribuição de Rick e Rita Weinstein, e duas subvenções de Tel Aviv University: a Fundação Maratier eo Elsa e Leo Abramson Foundation, Tel Aviv University. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Dr. G. Lavie tem interesse financeiro no Hy Biopharma Corporation, que desenvolve a hipericina droga (aqui descrito) como um agente anti-cancro. No entanto, a empresa está em ensaios clínicos avançados e é improvável que ganhar nada com esta publicação. A pesquisa não foi financiada por esta empresa e não há outros tipos de remuneração a qualquer um dos autores. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A formação de metástases tumorais através da divulgação das células cancerosas e seu crescimento explosivo continua a ser a causa mais prevalente para falha do tratamento do câncer e morte. As células tumorais remodelar a matriz extracelular, modificar as propriedades de adesão celular, invadir os tecidos circundantes e transmigrar para órgãos distais para formar focos metastáticos. focos em desenvolvimento geram hipóxia e uma necessidade de neoangiogênese para apoiar o crescimento. A hipoxia estabiliza a tensão precursor de resposta do HIF-1α [1], que conduz à sua translocação para o núcleo através de um processo dependente hsp90 [2], [3] e heterodimerização com HIF-1β, gerando o factor de transcrição HIF-1 funcional. HIF-1 promove a transcrição de -100 proteínas-alvo resposta ao estresse, incluindo VEGF. O VEGF estimula a expressão aumentada do seu receptor VEGFR2 primária. Os complexos de VEGF-VEGFR2 forma que requerem associação com hsp90 para activar a sinalização a jusante que inicia a cascata neoangiogênicos, [4] e activa a quinase de adesão focal integrina-sinalização (FAK) -Src complexo. Ambos FAK e Src também são proteínas Hsp90 cliente, o que requer associação com este chaperona para manter as suas conformações funcionais [5], [6]. Estas funções incluem a formação de adesões focais associados com um aparelho contráctil F-actina, que estão ligadas à membrana celular e activar a maquinaria de migração através da interacção com a matriz extracelular [7]. Assim, a inibição de Hsp90 pode perturbar vários sites em cascatas de sinalização angiogênico e células de dispersão e interferir com a progressão do tumor.

Os aumentos acentuados no conteúdo HIF-1α que ocorrem em muitos tipos de tumor implica HIF-1 na promoção da oncogênese. a progressão do tumor é acelerado através de mecanismos heterogêneos, incluindo gene VHL disfuncional /excluídos no carcinoma de células renais e hemangioblastoma [8], gene IDH1 inativada no glioblastoma [9], mutações em desidrogenases mitocondriais succ�icos em paraganglioma, e outros [10]. Na verdade, elevado HIF-1α intratumoral (ou HIF-2α) estão associados com a mortalidade acelerada paciente, evidente a partir de análises de imuno-histoquímica retrospectivas de parafina seções de biópsia de vários tumores [11]. é actualmente aceite que a diminuição dos níveis de HIF-1α tumorais podem incluir benefícios clínicos importantes, estimulando pesquisas intensivas para pequenas moléculas inibidoras de HIF-1α.

Reagentes com diversas atividades capazes de interferir com a proliferação de células tumorais, migração e neoangiogênicos sinalização são susceptíveis de inibir mais eficazmente a formação de metástases e beneficiar pacientes com cancro. Um desses reagentes potencialmente promissora é a quinona perylene perihydroxylated – hypericin. Descobrimos que hypericin inibe eficazmente a formação de metástases por mama murino e tumores de carcinoma espinocelular

in vivo

[12], aparentemente interferindo com vias de sinalização que promovem a angiogênese [13] e proliferação de células tumorais [14]. O denominador comum que liga estas atividades diferentes é uma capacidade única de hypericin para atuar como indutor exógeno de trabalho forçado poli-ubiquitinação de proteína de choque térmico 90 (Hsp90), desestabilizadora e rapidamente degradar uma infinidade de proteínas hsp90-cliente [14].

Aqui nós relatamos que hypericin pode degradar HIF-1α em células através de uma hipóxia única e mecanismo independente proteassoma. Embora HIF-1α é uma proteína cliente hsp90 [15] degradados por outros inibidores da hsp90 [16], o catabolismo de HIF-1α induzida por hipericina parece envolver um mecanismo dependente lisossómica catepsina-B único, activado num ambiente intracelular pH reduzido. Mostramos também que a cascata de sinalização angiogênico pode ser afetada por hypericin em vários locais, tornando esta molécula potencialmente promissora na terapia anti câncer.

Resultados

Forçado degradação HIF-1α sob hipóxia por tratamento com células com hipericina

com o intuito de decifrar o mecanismo para a actividade anti-angiogénica de hipericina [13], nós examinamos se a hipericina afecta estabilização adaptativa HIF-1α, que ocorre em condições de hipoxia na ausência de hidroxilação de prolina e asparagina [1 ] em três linhas de células humanas: células de glioblastoma U87-MG, CCR-C2

BVS – /- (C2

BVS – /-) células de carcinoma renal deficiente em pvhl, e ARPE-19 nas células epiteliais pigmentares da retina. As células foram primeiro expostas a hipericina durante 72 horas, o tempo necessário para efeitos de hipericina óptimas para o desenvolvimento e hipóxia gerado quimicamente com CoCl

2 e com uma atmosfera de baixo teor de oxigénio (0,5% S

2, 5% de CO

2 e 94,5% N

2) para os últimos 6 horas de tratamento para prevenir a citotoxicidade hipóxica. níveis de HIF-1a foram analisados ​​em fracções citosólicas e nucleares por Western blots. Os resultados, Fig. 1 mostram que a exposição a 10 uM e 30 uM de hipericina reduziu eficazmente os aumentos induzidos por hipoxia em níveis de HIF-1α de uma forma dependente da dose de hipericina em células ARPE-19 (Fig. 1A) e em células U87-MG (figura 1B. ). Reduções na HIF-1α foram mais pronunciadas nas frações nucleares de ambas as linhas celulares, particularmente quando hipoxia foi induzida quimicamente com CoCl

2.

[A] ARPE19, [B] U87-MG, [C ] RCC-C2

BVS – /- e [D]. CCR-C2

(gene VHL reconstituída) BVS + linhas celulares foram expostas a 10? M e 30 hipericina durante 72 horas. As culturas foram submetidas a condições de hipóxia com 150 uM CoCl

2 (A B, dupletos painel superior) e com um baixo atmosfera de oxigénio (0,5% S

2, 94,5% N

2 e 5% CO

2) (a B, inferior do painel de dupletos) durante as últimas 6 horas de tratamento. Hipericina causou degradação do HIF-1α. O mediador de clivagem proteolítica HIF-1α foi caracterizado por inibição da degradação de HIF-1α com o inibidor B catepsina CA-074, com MG-132 e com inibidores de proteossoma de calpaina ALLN, administrados às culturas durante as últimas 6 horas de incubação com o células. Os extractos citossólicos e extractos nucleares foram preparados, separados em SDS-PAGE e Western blots desenvolvida com anti-HIF-1α. O carregamento igual foi confirmada com β-actina. [E]. Efeitos da hipericina no pH intracelular de U87-MG e C2

BVS – /- células. BCECF quantitativa, a fluorescência dependente do pH foi medido spectrofluorimetrically (FRU denota fluorescência unidades relativas). [F]. Análise do papel da redução do pH intracelular mediada pela hipericina na promoção da rotatividade HIF-1α sob CoCl

2 hipoxia, determinados após alcalinização citoplasmática com 20 mM de NH

4Cl aplicada durante as últimas 6 horas de incubação. alcalinização citoplasmática diminuiu o volume de negócios HIF-1α induzida por hypericin sob CoCl

2 hipóxia.

Para determinar como hipericina aumenta a degradação do HIF-1α foi utilizado o C2-excluído gene VHL

BVS- /- linha de células. pvhl, o reconhecimento do substrato e do módulo de ligação de um complexo de ligase de E-3 ubiquitina se liga a HIF-1α seguinte hidroxilação prolilo no domínio prolil-hidroxilase proteína-2 [17], ubiquitinating assim HIF-1α HIF-1α e mediando a degradação proteossómica de este fator de transcrição precursor estresse-resposta [18]. deficiência pVHL perturba essa resposta degradação dependente de oxigênio, levando ao acúmulo constitutivo da HIF-1α. Nós examinamos o conteúdo HIF-1α em C2

BVS – /- células seguintes 72 tratamentos de RH com hipericina. A constitutivamente elevado teor de HIF-1α em C2

BVS – /- células diminuiu após a exposição a hipericina (Fig. 1C exposições) de um modo semelhante com as reduções de HIF-1α observados em U87-MG e células ARPE-19 tratadas com hypericin sob hipóxia. eliminação de HIF-1α por hipericina em C2

BVS – /- células ocorreu independentemente de pvhl e verificou-se ser insensível a inibição com os inibidores MG132 ou ALLN proteossómica calpaina (Figura 1C.), excluindo, assim, o envolvimento da via da ubiquitina-proteassoma neste processo. degradação do HIF-1α por hypericin foi, no entanto efetivamente inibida pelo inibidor da catepsina-B CA-074 em C2

BVS – /- células (Fig 1C.) e não afetados pela CLI-III, um inibidor da catepsina-L (dados não mostrando). Estas observações indicam que o volume de negócios HIF-1α-hypericin reforçada é mediada através catabolismo por uma enzima do tipo catepsina-B independentemente da via da ubiquitina-proteassoma

transfecção estável da BVS em C2

BVS -. /- células restaurou a ubiquitina-ligase E3 funcionalidade complexa [19], incluindo HIF-1α proteossómica degradação sob condições de normóxia e de estabilização de HIF-1α sob condições hipóxicas (Fig. 1D). Neste hypericin configuração também acelerou a degradação HIF-1α sob hipóxia, que revoga a estabilização HIF-1α induzido por hipoxia em reconstituída-BVS RCC-C2

BVS + células (C2

BVS + células) (Fig. 1D). degradação do HIF-1α por hypericin em C2

células BVS + também foi inibida por CA-074 (Fig. 1D). Assim, a via catepsina-B continua a ser a principal via de degradação do HIF-1α por hypericin sob hipóxia seguinte pVHL reconstituição.

Hypericin provoca reduções no pH intracelular

A mudança do volume de negócios HIF-1α de o fisiológica mediada por pVHL degradação proteossómica a um mecanismo dependente de catepsina-B causada por hypericin nos levou a investigar se as mudanças nas condições intracelulares contribuiu para essa mudança. Desde induzidas pela luz atividades fotodinâmica do hypericin provocar reduções no pH intracelular (pH

i) de células tumorais [20], a hipótese de que hypericin também pode causar redução do pH intracelular no escuro através de atividades redox, optimizando as condições de enzima lisossómica atividade. pH

i foi medida em U87-MG e C2

BVS – /- células tratadas com 10 e 30? M hypericin durante 72 horas no escuro, monitorar pH clivagem esterolítica dependente do derivado de éster acetoximetilo de BCECF ( consulte Métodos para detalhes). Apesar rigorosa manutenção das condições escuras, registramos redução dependente da concentração de hipericina em pH intracelular em U87-MG e C2

BVS – /- células (Fig 1E.). O pH citosólico

i diminuiu em células U87-MG a partir de uma linha de base de 7,12 ± 0,08 para 6,75 ± 0,06 com 10 mM de hipericina (p≤0,05), e 6,45 ± 0,20 com 30 mM hypericin (p≤0.03). Em C2

BVS – /- células a pH

i diminuiu de 7,18 ± 0,04 para 6,85 ± 0,28 (p≤0.08) com 10 mM hypericin e 6,42 ± 0,2, com 30 mM hypericin (p≤0,05). Esses estudos mostram que hypericin também provoca reduções dependentes de concentração de pH celular

i no escuro.

Para determinar se pH reduzido

i é essencial para a catepsina-B mediada degradação HIF-1α por hypericin, efeito de alcalinização citoplasmática com NH

4Cl no conteúdo citosólica HIF-1α foi examinada nas células tratadas com hipericina. as células U87-MG foram expostas a hipericina durante 72 horas no escuro e 150 uM CoCl

2 hipoxia induzida durante as últimas 6 horas de incubação em meio suplementado com cloreto de amónio 20 mM para induzir a alcalinização citoplasmática. Os extractos citossólicos foram preparados e Western blots desenvolvida com anticorpo de HIF-1α. FIG. 1F mostra que a prevenção da intracelular redução do pH diminuiu a degradação HIF-1α por hypericin, porém na maior concentração hypericin 30 mM alguma degradação HIF-1α sob hipóxia ocorreu. Esta degradação parece ser menos sensível ao inibidor de catepsina B-CA-074 e pode reflectir o envolvimento de um mecanismo dependente de proteassoma.

Hipericina interfere com HIF-1α de ligação a VEGF e sequências de HRE promotor do gene GLUT1

a degradação hypericin reforçada HIF-1α e consequente HIF-1 deficiência de conteúdo nuclear, foram hipótese de diminuir HIF-1 interações com elementos de resposta a hipóxia (HREs) em promotores de genes de resposta ao estresse como VEGF e GLUT1. HIF-1 se ligar ao promotor do gene de VEGF humano HRE foi, por conseguinte, analisada em tratados com hipericina U87-MG, C2

BVS – /- e as células ARPE-19 utilizando fluorescência Ensaios Electromobility deslocamento (F-EMSA). As células foram expostas a hipericina durante 72 horas, preparou-se extractos nucleares e a DNA-proteína a formação do complexo com o promotor VEGF HRE sondas fluorescentes contendo elementos foram analisados ​​para SYPRO rubi fluorescência. Em C2

BVS – /- células que possuem alto teor basal de HIF-1, HIF-1 formados complexos DNA-proteína com a sonda HRE (Fig. 2A). Nenhuma sonda livre foi detectado (Syber verde coloração, painel esquerdo), refletindo uma sonda de DNA principalmente ligado. Após o tratamento com 30 uM de hipericina, HIF-1-HRE formação do complexo foi marcadamente diminuída com a maior parte das sondas de ADN não ligado restante (pista 2)

Encontrado em promotores de:. [A]. O gene de VEGF, analisadas por fluorescência Electromobility tecla Shift Assay (EMSA-F). As proteínas nucleares foram separados em 6% de SDS-PAGE, corado com Syber verde sonda marcada com DNA e a proteína não ligada detectada com fluorocromo ligação às proteínas SYPRO Ruby. Os géis foram digitalizados usando FL-5000 scanner baseado em laser. [B]. O gene GLUT1 analisada por imunoprecipitação da cromatina (ChIP). cromatina cortados foi imunoprecipitada com anticorpo anti HIF-1α e ADN isolado a partir desta cromatina foi amplificado com os iniciadores específicos para a região do promotor do gene GLUT1. [C]. Interferência de hipericina com a ativação do promotor VEGF em linhas de células tumorais. figura à esquerda – C2

BVS – /- células. Pista 1 – células não tratadas, pista células 2 tratados com 30 mM hypericin durante 72 horas. figura da direita – células U87-MG. Pista 1 – células não tratadas, a pista 2 – células submetidas a hipóxia (150? M CoCl

2 para últimos 6 horas), pista 3 – CoCl

2-hipóxia para últimos 6 horas e hypericin 30 � durante 72 horas, e faixa 4 -. hypericin, 30 mm para 72 horas

Nas células U87-MG norm�icas, HIF-1-HRE níveis complexos eram baixos e aumento em hipóxia não deixando nenhuma sonda de DNA livre detectável. induzido por hipoxia, a formação do complexo HIF-1-HRE foi revogada por tratamento com células hypericin (Fig. 2A, painel do meio), deixando a sonda de DNA em sua maioria não ligado. Em células de hipóxia ARPE-19 níveis complexos de proteína-HRE eram superiores às linhas de base norm�icas e hypericin efetivamente reduziu HIF-1 – sondar vinculativo. Da mesma forma, níveis baixos de sonda livre em células hipóxicas, aumentada a seguir à exposição a hipericina (Fig. 2A, painel da direita). O tratamento com hypericin de linhas de células com níveis devido a hipoxia ou pVHL defeito alta 1 HIF-(C2

BVS – /- células) resultou em redução de interações com elementos de resposta a hipóxia

HIF-1 interações com outros. resposta ao estresse ERC gene-promotor que o gene GLUT1 também foram afetados pela hypericin como mostrado por cromatina analisa imunoprecipitação. A cromatina de núcleos preparados a partir de células tratadas com hipericina e de controlo foi tosquiada e HIF-1 contendo fragmentos imunoprecipitados com anticorpo anti-HIF-1 do anticorpo. níveis de HRE-bound HIF-1 foram determinadas a partir de DNA extraído de amplificação por PCR utilizando sondas específicas do promotor GLUT1. Em U87 MG-exposição de células a hipoxia resultou em aumento de HIF-1 interacções com o promotor GLUT1 HRE (Fig. 2B painel do meio), ao passo que a exposição concomitante de hipericina reduziu as quantidades de promotor ligados a HIF-1 (pista 3). Reduções semelhantes ocorreram em células ARPE19 (Fig. 2B, painel da esquerda). Em C2

BVS – /- células, hypericin causou quedas dramáticas em GLUT1 promotor-bound HIF-1 (Fig 2B, painel da direita.). No geral, as reduções de conteúdo citoplasmático HIF-1α em células hipóxicas tratados com hipericina também resultou em 1 de HIF-actividades maduros reduzidos de promoção da transcrição nos núcleos das células, diminuindo interações HIF-1 com os VEGF e genes GLUT1 promotores.

hypericin interfere com a ativação do promotor do VEGF no tumor linhas celulares

as reduções da HIF-1 que se ligam a VEGF e promotores GLUT1 causadas por hypericin, solicitado análises dos efeitos de hipericina na ativação do promotor do VEGF. U87-MG e C2

BVS – /- células foram transitoriamente transfectadas com uma construção repórter contendo o elemento HRE do VEGF-A gene (pGL3P-1100). As células foram divididas em 30 grupos tratados uM hipericina (durante 72 horas) e grupo de controlo não tratado. A actividade de luciferase foi medida contra as células de controlo de vector de veículo pGL3P transfectadas desprovida da construção repórter. FIG. 2C (exposição esquerdo) mostra a expressão da atividade alta luciferase no controle sem tratamento C2

BVS – células transfectantes, que mostrou uma tendência para a atividade de luciferase suprimida em C2

BVS tratados com hypericin – – //- células em aproximadamente 40% , sugerindo que hypericin tende a interferir com a ativação do promotor do VEGF em C2

BVS – /- células, no entanto as diferenças não atingiram significância estatística (

P

= 0,06, Mann Whitney). os níveis de luciferase do plasmídeo veículo pGL3P eram baixos e semelhante nos dois grupos (não representado).

Em células U87-MG, o promotor de VEGF foi também fortemente activada em resposta a hipoxia (Fig. 2C), ao passo que o tratamento com células com 30 mM hypericin aboliu completamente a ativação do promotor induzido por hipoxia (

P

= 0,05) (3

coluna rd). Hipericina isoladamente sem hipoxia não teve nenhum efeito na activação do promotor (4

th coluna). pGL3P transfectantes vetor de controle de veículos foram baixas em todos os grupos (não mostrado). Assim, hypericin pode inibir a ativação VEGF-promotor em condições de hipóxia por meio da degradação HIF-1α em células U87-MG.

Hypericin modula a transcrição do gene VEGF em linhas de células tumorais

A regulação negativa da ativação do promotor do VEGF devido ao catabolismo HIF-1α induzida por hipericina em células hipóxicas solicitado investigação dos efeitos de o, o catabolismo de HIF-1α provocou-hipericina na transcrição do gene VEGF. U87-MG e células ARPE-19 expostas a hipericina (72 horas no escuro) foram submetidos a CoCl

2 hipoxia para as últimas 6 horas de tratamento. O ARN foi preparado e analisado por transcrição de VEGF semi-quantitativo de RT-PCR utilizando iniciadores que abrangem exon1 e exon8 do VEGF-A do gene. Estes iniciadores amplificam todas as seis variantes de VEGF de emenda e as análises semiquantitativas permitir perfil diferenciado análises dos níveis de cada transcrição VEGF emenda. Os resultados mostram que em células ARPE-19, hipoxia modulações nos perfis de transcrição de VEGF induzida variante de splicing. Quando hipoxia foi combinado com a exposição a hipericina, a transcrição de VEGF

189 e VEGF

165 isoformas que aumentaram drasticamente sob hipóxia diminuíram (Fig. 3A), em particular com a dose de 30 uM (Fig. 3A, pista 4). VEGF

145 expresso em células de controlo não tratados e suprimidas sob hipóxia foi re-expressa após o tratamento hypericin (Fig. 3A, pista 4).

A. Em ARPE-19 células, B. em células U87-MG e C. em C2

BVS – /-. Células

Nas células U87-MG níveis basais de algumas isoformas de VEGF sob normoxia, principalmente VEGF

189 foram elevados devido a mecanismos independentes de hipoxia espécies de oxigénio como reactivos [21], NÃO [22], fosfatidilinositol-3-cinase e activação da cinase MAP por meio da acção de mTOR [23], ou perda do gene IDH1 função no glioblastoma [9]. No entanto transcrição de VEGF isoformas principalmente VEGF

206, VEGF

165 e VEGF

121 aumentou após a exposição das células à hipóxia. A sua transcrição diminuiu após a exposição de células a 30 uM hipericina (fig. 3B, pista 3). Em C2

BVS – /- células que expressam constitutivamente HIF-1α, VEGF transcrição foi, portanto, muito elevado no início do estudo. Exposição a hipericina (72 horas) induziu reduções de VEGF

206, VEGF

189 e marginalmente também VEGF

165 (Fig. 3C). Curiosamente, quando as células tratadas com hipericina também foram expostos a CA-074 (100 ug /ml), o inibidor da catepsina-B, o que impediu a degradação de HIF-1α-hipericina reforçada, a transcrição do gene de VEGF foi também estimulada em comparação com as células tratadas com hipericina única (Fig. 3C). Em resumo, hypericin estimulado mudanças nos padrões de expressão VEGF variante de processamento mais notavelmente em células ARPE-19 (Fig 3A.) E também detectável em U87-MG e C2

BVS – /-. Células

Prevenção da expressão VEGFR2 /KDR em hypericin células tratadas

as modulações nos padrões de transcrição do gene VEGF induzidas por degradação acelerada HIF-1α mediada por hypericin, análises autorizadas de efeitos de hipericina em mediadores da angiogênese no nível de proteína. As possíveis correlações com actividade de Hsp90 também foram avaliados devido à polyubiquitination Hsp90, a inactivação e a degradação, que também são induzidos por hipericina [14], e os papéis de Hsp90 execuções em locais-chave da cascata angiogénica [2], [24].

Efeitos do tratamento hipericina na expressão de VEGFR2 /KDR foram examinados nas três linhas celulares, incluindo ARPE-19 porque VEGFR2 também é expresso em células RPE [25]. O tratamento com hipericina induzida supressão marcada do teor celular de VEGFR2 em U87-MG e células ARPE-19 No entanto, os níveis de receptores não foram afectados em renal C2

BVS – /- células (Fig. 4A). Para determinar se a expressão reduzida de VEGFR2 resultou da produção de VEGF diminuída que completou o meio de crescimento de células U87-MG e ARPE-19 células com VEGF (10 ng /ml) com ou sem heparina (1 unidade /mL durante 48 horas) um dia após a hipericina administração e expressão de VEGFR2 analisados ​​nestas células. Estes tratamentos não modificou a expressão regulada negativamente hipericina VEGFR2 e não aumentou os níveis de VEGFR2 (dados não mostrados). Por isso, procurou determinar se hipericina modulado níveis de expressão de ARNm de VEGFR2 nestas células. O ARN foi preparado a partir de células de hipericina tratada (72 horas no escuro) e as análises de RT-PCR semi-quantitativa realizada com os iniciadores específicos do VEGFR2, usando como referência comparativa VEGFR1. Estas experiências revelaram que a transcrição do gene de VEGFR2 foi eficazmente e selectivamente inibida por hipericina em todas as três linhas de células, ao passo que a transcrição VEGFR1 foi menos afectada (Figura S1). Eles sugerem que a hipericina desencadeia efeitos epigenética downregulating selectivamente a expressão de vários genes de VEGFR2 e adicionais. No entanto, este grande tema ultrapassa o escopo deste manuscrito e será discutido em outro lugar.

[A]. análises de Western blot dos níveis de proteína VEGFR2 em extractos citosólicos de células não tratadas de controlo (C), ou células tratadas com 30 pM de hipericina durante 72 horas (HYP). [B]. A coloração das células U87-MG com faloidina-FITC. (1) As células não tratadas e (2) as células tratadas com hipericina 30 uM durante 72 horas. setas laranja mostram filamentos F-actina; setas amarelas retratam desabou glóbulos actina após a exposição a hipericina. [C]. VEGFR2-hsp90 a formação do complexo a seguir ao tratamento com a hipericina 30 uM durante 72 horas. Os resultados de imunoprecipitação com o anticorpo anti-Hsp90 e desenvolvimento de Western blots com anticorpo anti-VEGFR2. Hipericina diminuiu a formação do complexo VEGFR2-Hsp90. [D]. A indução de pct90 forçado poli-ubiquitinação de hipericina (30 uM durante 72 horas) em linhas de células cancerosas humanas. Painel superior – imunoprecipitação com anti-hsp90 e transferência de Western com anticorpo anti-Hsp90 (controlo); painel do meio – imunoprecipitação com anti-hsp90 e Western blot com anti-ubiquitina, e menor imunoprecipitação painel com anti-ubiquitina e Western blot com anti-hsp90. (I.p – imunoprecipitação; W. B. – Western blot).

VEGFR2 sinalização a jusante após a ativação por interações VEGF-VEGFR2 também requer associação com hsp90 [24]. envolvimento Hsp90 é relevante para nossas análises de efeitos anti-angiogénicos, porque nós relatado anteriormente na mama murino e células tumorais carcinoma espinocelular que hypericin induz polyubiquitination hsp90 e degradação acelerada, as proteínas Hsp90-cliente desestabilizadores e degradantes nestas células [14]. VEGFR2 sinalização a jusante activa alphavbeta3 e quinase de adesão focal (FAK) para formar adesões focais do citoesqueleto e polímeros F-actina [24]. FAK e Src também são proteínas Hsp90 cliente e, na verdade hipericina tratamento interfere com a polimerização F-actina (Fig. 4B). Por isso, investigou os efeitos de hipericina em associação VEGFR2 com hsp90, analisando VEGFR2 puxar para baixo após imunoprecipitação com o anticorpo anti-hsp90. FIG. 4C mostra que VEGFR2 co-imunoprecipitados com Hsp90, no entanto, este co-imunoprecipitação foi anulada após o tratamento com 30 uM de hipericina em todas as três linhas de células. Este achado aparentemente universal indica que VEGF-VEGFR2-Hsp90 formação do complexo diminui devido a ações de hipericina.

Também confirmamos aqui que hypericin induz polyubiquitination hsp90 em linhas de células humanas. Imunoprecipitação de U87-MG e C2

BVS – /- lisados ​​celulares com anti-hsp90 puxado para baixo ubiquitina após a exposição hypericin e vice-versa: immunoprecipation com anti-ubiquitina puxado para baixo hsp90 (Fig 4D.)

. Hsp90 poli-ubiquitinação interfere com o transporte nuclear de HIF-1α antes para a degradação do HIF-1α

para determinar se a desestabilização mediada por hipericina de HIF-1α também depende do poli-ubiquitinação induzida por Hsp90 de hipericina realizamos avaliações dependentes do tempo dos efeitos de hipericina em hsp90 poli-ubiquitinação e contemporaneamente no conteúdo celular de HIF-1α associada-hsp90 em células U87-MG sob hipóxia. As células foram expostas a 10? M e 30 de hipericina durante 48 horas, altura em que a Hsp90 poli-ubiquitinação se tornou detectável e durante 72 horas quando o acompanhante foi degradada [14]. A hipoxia foi induzida com CoCl

2 para as últimas 6 horas do experimento, as células lisadas e foram preparados ambos citosólica e extractos nucleares. Hsp90 foi imunoprecipitado com o seu anticorpo correspondente e borrões ocidentais desenvolvidos com anticorpos anti-HIF 1α para monitorar a HSP-90 ligado HIF-1α e com anti-hsp90 como controle (Fig. 5A). níveis de HIF-1a ligados a hsp90 foram comparados com total de HIF-1α analisados ​​em Western blot diretamente do citosólica todo e frações nucleares. Os resultados mostram que após a exposição a hipericina durante 48 horas hsp90 tornou-se poli-ubiquitinada, ainda chaperona degradação foi observada principalmente na dose mais elevada de 30 uM de hipericina (Fig. 5A, imagem da esquerda). Citosólica HIF-1α começou a ser degradado no ponto de tempo de 48 horas, apenas após o tratamento com 30 uM de hipericina (Fig. 5B, painel superior esquerdo). No entanto, o transporte nuclear HIF-1α foi mais fortemente revogada por ambos os níveis de dosagem de hipericina (Fig. 5B, 48 hr de tempo ponto 2

nd painel, fração nuclear). Isto foi devido à elevada dependência do transporte nuclear HIF-1α sobre a actividade de Hsp90 acompanhante intacta [26]. Hsp90 poli-ubiquitinação por hypericin causou perda de atividade chaperone e impediu a trans-migração HIF-1α fisiológica para o núcleo onde normalmente se dissocia do hsp90 [27]. HIF-1α ligado a hsp90 e co-imunoprecipitada com anticorpo anti pct90 também foi mais fortemente degradada devido à ubiquitinação hsp90 após 48 horas (Fig. 5B, painel inferior esquerdo). Às 72 horas Hsp90 citosólica foi altamente degradado para abaixo do nível de detecção (Fig. 5A, imagem à direita) e afetou tanto a co-imunoprecipitada HIF-1α e HIF-1α transportado para o núcleo (Fig. 5B, terceira e quarta imagens). O conteúdo HIF-1α citosólica total no momento point-72 hr também foi fortemente degradado, mas alguma proteína HIF-1α permaneceu detectável. Assim, citosólica HIF-1α associado com hsp90 diminuiu com poli-ubiquitinação de hsp90 aumentou (Fig 5A . 5B), mas correlacionados menos com a degradação hsp90 real

células U87-MG foram expostos a 10 30 mM hypericin por 48 horas (painéis à esquerda) e 72 horas (painéis da direita), sob condições de hipóxia (150? M CoCl

2) e expressão hsp90 e atividades chaperones foram analisados. Os extractos citossólicos foram imunoprecipitados com anticorpo anti-Hsp90 e Western blots desenvolvida com: [a] anticorpos anti-hsp90. [B] anti HIF-1α. FIG. FIG.