Abstract

Fundo

A angiogênese é considerado como um marco no desenvolvimento do câncer, e tratamento anti-angiogénico é actualmente utilizado em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). MicroRNAs (Mirs) são pequenas não-codificantes, endógena, único RNAs de cadeia que regulam a expressão do gene. Neste estudo teve por objetivo identificar miRs significativamente alterados relacionados com a angiogénese em NSCLC.

Métodos

A partir de uma grande coorte de 335 pacientes com NSCLC, amostras embebidos em parafina de 10 pacientes com uma curta doença específica sobrevivência (DSS), 10 com um tempo DSS e 10 controlos normais foram analisados. Os miRs foram quantificados por hibridação de micromatriz e miRs seleccionados foram validados por qPCR em tempo real. Os impactos de diferentes vias, incluindo angiogênese, foram avaliados por Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA) derivada de análise de proteínas através Evolutionary Relacionamento (Panther). Um dos marcadores candidatos mais interessantes, o miR-155, foi validado pela

In situ

hibridação (ISH) na coorte total (n = 335) e análises de correlação com vários marcadores angiogénicas bem conhecidas foram feitas.

resultados

128 miRs eram up- significativamente ou regulados negativamente; DSS normais versus tempo (n = 68) e /ou normais em comparação com DSS curto (n = 63) e /ou longa contra curto DSS (n = 37). A análise de caminho indica miRs relacionadas com angiogénese a ser envolvidos em NSCLC. Havia fortes correlações significativas entre a hibridização matriz e dados de validação qPCR. Os miRs relacionadas com angiogénese significativamente alterados de elevado interesse foram miR-21, miR-106a, miR-126, miR-155, miR-182, miR-210 e miR-424. miR-155 correlacionada de forma significativa com o factor de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) na coorte total (r = 0,17, P = 0,002), embora a maior parte proeminente no subgrupo com metástases nodais (r = 0,34, P 0,001).

Conclusões

Vários miRs relacionadas com angiogénese é significativamente alterada em NSCLC. Mais estudos para compreender as suas funções biológicas e explorar sua relevância clínica são garantidos

Citation:. Donnem T, Fenton CG, Lonvik K, Berg T, Eklo K, Andersen S, et al. (2012) MicroRNA Assinaturas em Tecido Tumoral Relacionado a angiogênese em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (1): e29671. doi: 10.1371 /journal.pone.0029671

editor: William C. S. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong

Recebido: 30 de Junho de 2011; Aceito: 02 de dezembro de 2011; Publicação: 25 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Donnem et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi exclusivamente financiado pela Noruega do norte Autoridade Regional de Saúde (Helse Nord RHF), que é responsável pelos hospitais públicos no norte da Noruega. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em homens e mulheres, e aproximadamente 80% são câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) [1]. Apesar das melhorias emergentes nas modalidades de diagnóstico precoce e tratamento, a sobrevida global em 5 anos é de parcos 15%. TNM (tumor, nós, metástase) estágio tem sido considerada a variável de prognóstico mais importante como doença em estágio precoce é um pré-requisito para a ressecção cirúrgica completa necessária para o potencial de cura. As respostas ao tratamento e os efeitos colaterais de novas opções de tratamento têm sido intimamente relacionado com diferentes entidades histológicos de NSCLC [2] – [4]. No entanto, terapias específicas dirigidas contra alterações celulares específicas requerem uma sub-classificação precisa das NSCLC que é em grande parte além das técnicas histopatológicas de diagnóstico de rotina [5] encenação de hoje e.

Os microRNAs (Mirs) são pequenos não codificante, endógeno, RNAs de cadeia simples que regulam a expressão do gene de [6] – [9]. Através da regulação da expressão de genes em nível pós-transcricional, miRs ter um grande impacto sobre uma ampla variedade de vias, incluindo diferentes vias relacionadas ao desenvolvimento de câncer. Vários estudos têm explorado a desregulamentação dos diferentes miRs em NSCLC e suas potenciais funções oncogênicos e supressores de tumor, bem como o seu impacto prognóstico [10] – [20].

Alguns miRs parecem estar envolvidos na angiogênese [21] – [24]. A angiogénese é um processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir de pré-existentes, e desempenha um papel chave no desenvolvimento do tumor [25]. inibidores angiogénicos são utilizados no tratamento de NSCLC. O bevacizumab anticorpo monoclonal em combinação com a quimioterapia é aprovado pela FDA como uma opção de tratamento em pacientes com NSCLC não-escamosas metastáticos, e muitos inibidores da tirosina quinase alvo vias angiogênicas são promissores [3], [26].

A primeira evidência mostrando miRs na regulação da angiogénese veio de camundongos knockout Dicer. Dicer é uma enzima crítica na síntese de miR. Os ratos Dicer com déficit morreu cedo durante o desenvolvimento devido ao afinamento das paredes vasculares e desorganização severa da rede de vasos sanguíneos [27]. Além disso, outro estudo murino mostrou que um subconjunto de miRs alterados durante o interruptor angiogênico tornou-se opostamente regulada em resposta ao tratamento anti-angiogênico [23].

Em uma grande coorte NSCLC desmarcada temos previamente estudado o impacto prognóstico da vários factores angiogénicos chave de crescimento e receptores, bem como o papel de prognóstico de miR-155 e miR-126 por

in situ hibridação

[28] – [38]. Aqui, foram avaliados os perfis de expressão de miR em NSCLC usando tecidos de pacientes selecionados deste grupo. Nós teve como objetivo identificar interessantes relacionadas com angiogénese candidatos miR para mais potencial em grande escala e em profundidade estudos.

Resultados

Os pacientes

demográficos, clínicos e variáveis ​​histopatológicas os grupos de doentes (DSS longo, curto DSS e controlos) são mostrados na Tabela 1. o DSS mediana era 8,0 (6,5-9,9) meses de intervalo e 160,5 (intervalo 60,5-184,3) meses no grupo de baixa e alta DSS, respectivamente. Havia quatro adenocarcinomas e seis carcinomas de células escamosas em cada grupo.

análise de expressão RNA Micro

Fora de 281 miRs, A Figura 1 mostra o número ea distribuição de 128 miRs diferencialmente expressos significativas através de diferentes comparações no estudo (P 0,1 ajustado para a taxa de descoberta de falsas, FDR). O respectivo -up e regulada para baixo (-1,1) miRs são apresentados na Tabela S1. miR-182 foi o único miR alteradas em todos os três combinações; normal versus curto DSS, normal versus longo DSS e curto contra longa DSS. Uma análise de Componentes Principais (PCA) (Figura 2A) sobre a totalidade do conjunto de amostras de valores de expressão revelaram que o principal componente princípio da variação separa amostras normais a partir de amostras de NSCLC. Para realçar a diferença entre os grupos de amostras de tumores NSCLC um modelo de mínimos quadrados parciais (PLS) ponte foi usado para extrair um subespaço onde as diferenças entre os grupos são mais evidentes do que na PCA (Figura 2B). A Tabela 2 mostra os dez miRs com maior variação vezes estratificados em grupos de sobrevivência a longo versus controlo normal e curta sobrevivência versus controle normal. A Tabela 3 mostra os miRs com maior variação vezes na curta contra grupos de sobrevivência a longo

O diagrama de Venn mostra o número de todos os miRNAs diferencialmente expressos em diferentes comparações:. Tecido de pacientes com NSCLC com sobrevivência curta contra o tecido de pacientes com NSCLC com sobrevivência a longo, o tecido de pulmão normal versus tecidos de pacientes com NSCLC com a sobrevivência a longo e tecido de pulmão normal versus tecidos de pacientes com NSCLC com sobrevida curta. Fora dos 281 miRs avaliadas, o número de expresso diferencial miRs com FDR ajustado P . 0,1 (n total = 128) de cada comparação é indicado

(A) APC bidimensional de miRs, derivado a partir de 20 pacientes com NSCLC e 10 amostras de tecido a partir de tecido pulmonar normal, mostrando a separação dos dois grupos de amostras. (B) O enredo retrata componentes 1 e 2 do modelo PLS que usou o tempo de sobrevida como critério de pontuação. A análise separa claramente os grupos de amostras de tecido para pacientes com NSCLC de curta e longa sobrevivência. Todas as amostras são codificados por cores de acordo com o grupo: Black: amostras normais de pacientes; verde: As amostras de pacientes com sobrevida curta; vermelho:. As amostras de pacientes com sobrevivência a longo

análise Pathway

A Tabela 4 mostra os resultados do GSEA. O conjunto gene ligado a 31 miRs relacionadas com angiogénese revelou a mais alta pontuação definir gene nominal de enriquecimento (NES = -1,17, nominal p-valor 0,28, FDR 0). A Figura 3 mostra o mapa de calor representando 31miRs ligados ao conjunto de genes angiogénicos.

A diferença na expressão de miR entre amostras de tumor de pacientes com NSCLC com longa (L) e (S) é mostrada curta sobrevivência. valores de expressão de miR são mostrados em um espectro onde regulada para baixo é azul e up-regulada é vermelho.

validação PCR

Gráficos de dispersão comparando a hibridização microarray e os dados qPCR de 28 miRs seleccionados são mostrados na Figura 4. A miRs incluídos, e os dados a partir de todas as três combinações (tanto de hibridação e qPCR) estão listados na Tabela S2. Havia correlação forte e significativa entre a hibridação e dados qPCR: Curto contra normal de r = 0,81, P 0,001; longo contra normais r = 0,85, P 0,001; short contra o tempo r = 0,85, P . 0.001

A comparação entre a hibridização microarray (dLMR, diferença nos níveis de expressão médias entre grupos de amostra, escala log2) e qPCR (ddCP, diferença nos níveis de expressão média entre os grupos de amostra, escala log2) de dados, o coeficiente de correlação R = (Pearson): (A) normal de baixo contra r = 0,81, P 0,001; (B) de altura em relação normal de r = 0,85, P 0,001; (C) alta versus baixa r = 0,85, P 0,001. Em vermelho; miR-150.

A análise de correlação entre os marcadores angiogênicos e miR-155

Temos publicado anteriormente sobre o impacto prognóstico do miR-155 em nossas grandes (335 pacientes) população NSCLC [ ,,,0],37]. Neste estudo nós exploramos a correlação entre o miR-155 e vários marcadores angiogênicos conhecidos. Os mesmos valores de corte como publicado anteriormente foram utilizados para FGF2 e miR-155 [33], [37]. Figura S1 mostra

in situ

análise de hibridação (ISH) de NSCLC que representam intensidades fortes e fracos para células tumorais expressão de miR-155, bem como controlos negativos e positivos. A Tabela 5 mostra a correlação entre os marcadores angiogénicos [factor de crescimento endotelial vascular – A (VEGF-A), factor de plaquetas derivado – B (PDGF-B), HIF-1α e factor de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2)] e miR-155. miR-155 correlacionada de forma significativa com FGF2 na coorte total (r = 0,17, P = 0,002), embora a maior parte proeminente no subgrupo com metástases nodais (r = 0,34, P 0,001). As tabelas de referência cruzada na Tabela 6 e Tabela 7 mostram a correlação e distribuição de alta e baixa expressão de FGF2 e miR-155.

Discussão

Para o nosso conhecimento , este é o primeiro estudo expressão profiling NSCLC miR que mostra um conjunto de genes ligado a miRs relacionadas com angiogénese, com o maior impacto na via de análise. Consistente com estudos publicados anteriormente observamos diferenças significativas nos perfis de miR entre tecido normal e tumoral e entre amostras de pacientes com um pobre contra um DSS favorável. Vários destes miRs alterados significativas estão associadas com a angiogénese e são marcadores candidatos interessantes para posterior avaliação. Ao validar um desses marcadores, miR-155, em uma coorte de 335 pacientes com NSCLC, encontramos esta miR pela primeira vez a ser significativamente associada com o bem conhecido FGF2 marcador angiogênico.

Os principais pontos fracos do o estudo na busca de novos marcadores candidatos são a população de estudo relativamente heterogéneo e o baixo número de pacientes incluídos na análise. Muitos dos resultados aqui apresentados são, portanto, apenas marginalmente significante (ou alguns apenas mostrando uma tendência) e mais de validação em um conjunto NSCLC maior, como se fez para miR-155, é um pré-requisito para conclusões mais firmes. Este é especialmente o caso quando se comparam as diferenças significativas entre os tecidos de tumor (tempo de sobrevivência em relação curta), como ali, em geral, são maiores as diferenças entre tecidos de tumor e os controlos normais. As mudanças de dobra estão em média mais elevado e os valores de p mais fortes na Tabela 2 (tecido tumoral em comparação com controlos normais) em comparação com a Tabela 3 (long contra sobrevivência curta). Do ponto de vista clínico, pelo menos quando se trata de miRs como potenciais marcadores prognósticos ou preditivos, miRs com expressão alterada entre o curto contra o grupo sobrevivência a longo são de especial interesse. Temos, portanto, explorou a literatura sobre quatro miRs relacionados angiogênese da Tabela 3 (miR-106a, miR-155, miR-182 e miR-424) e validado miR-155 em um grande conjunto de pacientes com NSCLC. Além disso, queria destacar o impacto potencial de miR-21, miR-126 e miR-210 a partir da Tabela 2, como não são convincentes relatórios que indicam essas miRs ter impacto potencial na angiogênese. Além disso, temos mostrado previamente miR-126 para ter impacto prognóstico em nossa coorte NSCLC [38].

O reforço nossos resultados são correlações fortes e significativas entre os dados de hibridização microarray e os mesmos miRs validados por qPCR. Além disso, as expressões miR alterados no tumor contra tecidos normais estão a uma grande grau consistente com estudos NSCLC miR anteriormente publicados [15] – [17], [20] e conforme discutido na seguinte lá estão constantemente nova literatura adicionado, apoiando nosso candidato miRs estar envolvido na angiogênese.

Poucos estudos exploraram o impacto de vias relacionadas com genes alvos RIM em NSCLC. A interpretação de tais análises não é tão simples como os resultados são altamente dependentes que têm como alvo os genes são ligados aos miRs e que miRs estão ligados aos diferentes caminhos. Além disso são muitas vezes miRs multifuncional e o mesmo pode ter como alvo o miR diversos genes em diferentes vias, e de um gene pode ser alvo de várias miRs. Apesar de não ser estatisticamente significativa, o GSEA variou angiogénese como a via mais importante em nossas amostras de NSCLC. Existem vários novos relatórios de ligação específicos para a angiogénese miRs apoiar os nossos achados [23], [24], [39] – [42]. Além disso, Raponi et ai. demonstraram que a via do factor de crescimento de fibroblastos relacionada com a angiogénese (FGF) teve um enriquecimento significativo em NSCLC gene escamosas [17].

Num estudo de murino abrangente, Olson et ai. assinaturas específicas identificadas miR expressão associada com etapas na tumorigênese e diferentes marcas de cancro, incluindo angiogênese [23]. miRs assinatura-inibição da angiogénese foram avaliados pela técnica de qPCR e definidos como aqueles miRs significativamente alterada em tumores primários normais versus tratamento com sunitinib em 1,3 vezes a mudança [23]. Sunitinib é um inibidor da tirosina-cinase do receptor de direccionamento vascular factor de crescimento endotelial (VEGFR), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR) e c-Kit. De acordo com nossos resultados de validação qPCR, os dados de PCR em geral, muitas vezes mostram um aumento da mudança vezes, em comparação com os dados de hibridização. Muitos dos miRs relacionadas com angiogénese observados por Olson e seus colaboradores também são alteradas significativamente no nosso material [23]. Entre os miRs relacionadas com angiogénese mais interessantes significativamente alterados em ambos os estudos, encontramos miR-126, miR-155 e miR-21 e miR-424.

miR-126 foi recentemente revisto como um jogador importante no angiogénese [43] e Wang et al. mostraram, num modelo murino que aumenta as acções pró-angiogénico de VEGF e FGF, reprimindo a expressão de Spred-1, um inibidor da sinalização intracelular angiogénica [44]. miR-126 também foi localizada dentro do domínio tipo factor de crescimento epidérmico gene 7 (EGFL7). EGFL7 pode ter um papel importante na angiogénese através da promoção da sinalização de VEGF e a integridade vascular [45]. Além disso, temos relatado anteriormente que a expressão de miR-126 é significativamente associada com VEGF-A em NSCLC [38]. Além disso, observou-se que o impacto prognóstico da miR-126 está relacionada com subtipos histológicos e status nodal. Além disso, a expressão e os papéis de miR-126 pode ser diferente em várias malignidades [23].

miR-155 é um dos mais consistentemente miRs envolvidos na doença neoplásica [46], mas o nosso conhecimento, não sido relacionada com a angiogénese antes do estudo por Olson e seus colaboradores [23]. Tem sido relatado que ser regulada para cima em vários estudos NSCLC humano [15], [17], [20], e regulada para baixo em um modelo murino quando se utiliza o inibidor angiogénico sunitinib [23]. Nos nossos dados de matriz, o miR-155 tenderam a ser significativamente alterada entre os grupos de curto e longo de sobrevivência (Tabela 3) e foi significativamente sobre-expressos em tumores contra o tecido normal no conjunto de validação qPCR. Nós relataram o impacto prognóstico de miR-155 para ser associado com os subtipos histológicos e estatuto nodal, mas não se ligam a estes resultados marcadores angiogénicos [37]. Com base nestes novos dados que agora examinar se miR-155 correlacionados com parâmetros bem conhecidos angiogénicos /hipóxicos como VEGF-A, PDGF-B, HIF-1α e FGF2. Curiosamente, observou-se, pela primeira vez, o miR-155 para ser significativamente associado com FGF2 com o maior impacto no subgrupo N + NSCLC. Embora FGF2 tem várias funções, é um jogador importante na angiogênese. Na verdade, o miR-155 também tende a se correlacionar com VEGF-A no subgrupo N +. miR-155 foi uma das primeiras miRs a ser associada com o desenvolvimento e estudos posteriores NSCLC será importante, a fim de explorar o seu potencial função angiogénica.

Neste estudo, o miR-21 é significativamente regulada para cima no tumor contra o tecido normal (Tabela 2), apoiando relatórios anteriores NSCLC [15], [17], [20] e o observado a regulação negativa após o tratamento anti-angiogênico [23]. miR-21 também foi encontrada para ser altamente expressa em células endoteliais [24]. Em um estudo recente realizado por Liu et al., MiR-21 foi overexpressed por transfecção de pré-miR-21 em células cancerosas humanas da próstata e angiogénese tumoral foi testada usando frango membrana corioalant�ca [47]. Eles descobriram que a sobre-expressão de miR-21 em células DU145 aumentou a expressão de HIF-1α e o VEGF, e a angiogénese induzida por tumor. Eles concluem que o miR-21 induz a angiogénese do tumor através da segmentação de PTEN, que conduz à activação do AKT e vias de sinalização ERK1 /2, e aumentando, assim, o HIF-1α e a expressão de VEGF. As mesmas vias são descritas como importantes no desenvolvimento NSCLC também [48], e estudos adicionais para abordar esta relação com o miR-21 em cancro do pulmão seria de interesse.

O estudo indica Olson miR-424 para ser envolvidos na angiogénese como este miR foi regulada para baixo após o tratamento com sunitinib [23]. Além disso, Ghosh et ai. estudaram este miR e descrito que a expressão de miR-424 induzida por hipoxia em células endoteliais humanas regula isoformas HIF-α e promove a angiogénese [49]. Eles sugerem ainda miR-424 para desempenhar um papel fisiológico importante na angiogénese pós-isquémica. Em contraste, Nakshima et ai. relataram a sub-regulação de miR-424 para contribuir para a angiogénese anormal através de MEK1 e ciclina E1 em hemangioma senil, demonstrando o potencial do tecido e o estágio de impacto específica do mesmo miR [50]. No nosso estudo, o miR-424 não foi alterada quando se comparam tumor com o tecido normal, mas foi significativamente regulada para cima no tecido a partir de pacientes com mau prognóstico em relação a tecidos de pacientes com um bom prognóstico (Tabela 3). Não é a nosso conhecimento nenhum estudo publicado que explorou o impacto prognóstico da miR-424 em câncer. No entanto, como há um miR-424 significativo aumento da regulação no grupo de mau prognóstico seria de interesse para avaliar melhor esse marcador em um estudo NSCLC grande escala.

Outro marcador up-regulamentado significativa no nosso material é o miR-210 (Tabela 2), que anteriormente tem sido relacionada com a angiogénese [41], [51], [52]. miR-210-regulação é acreditado para ser um elemento crucial da resposta da célula endotelial à hipóxia e, portanto, potencialmente importante na angiogénese tumoral. Este miR foi recentemente revista por Devlin et al. [51], concluindo-se que o miR-210 é um alvo robusta do factor indutível por hipoxia e que a sua sobre-expressão foi detectada em uma variedade de doenças cardiovasculares e tumores sólidos. Em linhas celulares de NSCLC, o miR-210 é relatado para mediar alterações mitocondriais associadas com a modulação da actividade de HIF-1 [52]. No entanto, grande parte do impacto funcional e prognóstico de miR-210 em NSCLC ainda permanece por resolver.

miR-182 está incluído na via de angiogénese no GSEA, em parte porque substrato receptor do factor de crescimento de fibroblastos 2 (FRS2) é um dos seus genes-alvo. FRS2 é um importante regulador da via do factor de crescimento de fibroblastos que nós e outros têm mostrado ser importantes na progressão NSCLC, potencialmente, estimulando a angiogénese [33], [53]. Curiosamente, o miR-182 foi o único miR significativamente alteradas em todos os três combinações, como mostrado no diagrama de Venn (Figura 1). Cabe-regulação no tumor (tanto pobres e favorável grupo de prognóstico, Tabela 2), quando comparado ao tecido normal, é consistente com o estudo prévio de Raponi et al. [17]. Além disso, o miR-182 é significativamente regulada para cima no curto DSS contra pacientes DSS longas (Tabela 3). No entanto, Barchack et ai. observaram maior expressão de miR-182 em tumores primários do que nos tumores metastáticos do pulmão, indicando que o miR-182 de expressão pode atingir um pico na fase inicial NSCLC.

Observa-se a mesma tendência para o miR-106a, que tem sido demonstrou ser regulado para cima durante a hipoxia em linhas celulares de cancro do cólon e da mama [40]. Como relatado anteriormente, o miR-106a foi regulado para cima em NSCLC [16], [17], [20]. Observamos, também, a sua expressão a ser significativamente aumentada em tumores quando comparados aos controles normais (Tabela 2). Como para miR-182, miR-106a foi ainda aumentada em tecidos de pacientes com uma curta sobrevivência em vez de tempo de sobrevivência (Tabela 3).

Como esperado, muitas miRs conhecidos por estarem associados com a angiogénese não foram significativamente alteradas em nosso estudo. Cluster miR-17-92 (miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a, miR-19a, miR-19b, miR-20a e miR92-1), deixe-7, deixe-7F, miR- 27b, miR-15b, miR-16, miR-92a, miR-99a, miR-130a, miR-214, miR-221, miR-222 e miR-296, bem como alguns dos miRs apresentados no mapa de calor ( Figura 3), não foi significativamente alterada ou eles exibiram apenas pequenas alterações de dobra [24], [39], [41], [42]. Esta ausência de alterações significativas pode ser devido a resultados falsos negativos uma vez que existem alguns doentes em cada grupo. Além disso, como muitas miRs parecem ser tecido e do estádio específico, alguns destes miRs pode, alternativamente, exercer um impacto limitado aos subgrupos de NSCLC ressecado ou podem ser importantes em outras malignidades.

inibidores angiogénicos em combinação com quimioterapia, são estabelecidos como tratamento de NSCLC, mas um maior conhecimento sobre a biologia, mecanismos efetoras e marcadores prognósticos e preditivos são garantidos. miRs são estáveis ​​e potencialmente mensurável em ambos os tecidos e soro. Vários miRs estão ligados a angiogénese e este estudo suporta a hipótese de que um número de miRs relacionadas com angiogénese são potencialmente importantes na progressão NSCLC. Propomos miR-21, miR-106a, miR-126, miR-155, miR-182, miR-210 e miR-424 para estar entre os candidatos mais interessantes. Desde miRs são frequentemente palco e tecidos específicos, estudos de grande escala são necessários para explorar ainda mais o seu impacto prognóstico e preditivo. Além disso o mesmo miR muitas vezes tem múltiplos genes alvo e funções diferentes. Portanto, estudos funcionais são altamente necessário para obter uma melhor visão de suas funções biológicas.

Materiais e Métodos

Ética declaração

O estudo foi aprovado pelo Conselho de Inspecção Nacional de Dados, The Comitê Regional de Ética em Pesquisa e Biobank Colecção Conselho de tecido. Informação e subsequente autorização por escrito dos pacientes ou parente mais próximo foi considerada, mas como este foi um estudo retrospectivo com mais de metade dos pacientes falecidos, alguns mais de dez anos atrás, o Comité Regional de Ética em Pesquisa dispensada especificamente a necessidade de consentimento.

pacientes e amostras de tecido

a partir de uma coorte NSCLC grande previamente bem descrito [30], vinte e (FFPE) amostras de tecidos tumorais embebidos em parafina foram obtidos de pacientes diagnosticados com a fase I fixado em formalina -IIIA no Hospital Universitário do Norte da Noruega (UNN) e Hospital Central Nordland (NLCH). Estes eram dez pacientes com uma curta sobrevida específica de doença (DSS) (NSCLC_01 – NSCLC_10) e dez pacientes com longa DSS (NSCLC_11 – NSCLC_20). Além disso, as amostras de sites normais tecido pulmonar em dez pacientes com NSCLC (NSCLC_01, NSCLC_02, NSCLC_06, NSCLC_11, NSCLC_12, NSCLC_13, NSCLC_15, NSCLC_16, NSCLC_18 e NSCLC_19) foram incluídos no estudo (NORM_01 – NORM_10). Quatro núcleos de amostras, cada uma com 0,6 mm de diâmetro, a partir de áreas de tumor viáveis ​​de cada tumor e amostra normais foram retiradas e reunidas antes do isolamento de ARN, a fim de obter uma amostra representativa de cada paciente. grupos DSS longas e curtas foram estratificadas a fim de obter uma distribuição igual do género e histologia. As amostras tumorais foram armazenados nos Serviços de Patologia da UNN e NLCH, encenado acordo com a classificação TNM da União Internacional Contra o Câncer (UICC), e histologicamente subtipadas de acordo com as diretrizes da Organização Mundial de Saúde [54], [55]. Todo o material do paciente foi avaliada por dois patologistas independentes e treinados (SAS e KAS). Nenhum dos pacientes recebeu quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. dados completos paciente foi obtida a partir de registros médicos, incluindo dados demográficos, clínicos, tratamento e evolução de dados.

isolamento do RNA

RNA foi isolado das amostras de núcleo recolhidos usando a Recuperar Todos ™ Total de Ácido Nucleico Kit de isolamento para FFPE tecidos (Ambion, Austin, TX), de acordo com as instruções do fabricante, com alguns pequenos ajustes. tratamento xileno foi aumentado de 3 min a 8 minutos, e o tratamento de protease foi aumentado de 3 horas a cerca de 20 horas. qualidade e quantidade de RNA foi avaliada usando a NanoDrop 1000 espectrofotômetro (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) e mais verificada por meio de um perfil Agilent 2100 Bioanalyzer.

procedimentos Microarray

RNA total (700 ng ) a partir da amostra de referência e foi marcado com Hy3 ™ e marcador fluorescente hY5 ™ usando a miRCURY

Tm LNA matriz kit de marcação de energia (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) seguindo o processo descrito pelo fabricante. O Hy3 ™ marcado com amostras e uma hY5 ™ marcado com amostra de RNA de referência (que contém uma alíquota igual de todas as espécies de RNA incluídos neste estudo) foram misturados por pares e hibridado com a miCURY

Tm LNA matriz versão 5

ª geração (Exiqon, Dinamarca), que contém sondas de captura dirigidos a todos os miRNAs humanos registados na miRBase versão 14.0 do Instituto Sanger. A hibridação foi efectuada de acordo com o manual de matriz miRCURY ™ LNA usando uma estação de hibridação Tecan HS4800 (Tecan, Áustria). Após a hibridação os diapositivos de microarray foram digitalizados e armazenados em um ambiente livre de ozono (nível de ozono inferior a 2,0 ppb), a fim de impedir que o potencial de branqueamento dos corantes fluorescentes. As lâminas de matriz de microarray miCURY ™ LNA foram digitalizadas utilizando o G2565BA Microarray Scanner de sistema Agilent (Agilent Technologies Inc., EUA) e a análise de imagem foi realizada utilizando o software Imagene 8,0 (BioDiscovery Inc., EUA). Os sinais quantificados foram fundo corrigida com valor de deslocamento 10 e normalizada usando o Lowess global (Scatterplot localmente ponderada Smoothing) algoritmo de regressão [56].

envio de banco de dados de dados de microarray

Os dados de microarranjos foram preparadas de acordo com informações mínimas sobre um experimento de microarray (Miame) recomendações [57], e depositados no banco de dados GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). O número de acesso GEO para a plataforma é GSE27705 eo estudo pode ser visto em:. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27705

Quantificação de miRNAs maduros por em tempo real qPCR

Um ou vários dos seguintes critérios foram utilizados na selecção miRs para validação de PCR; P-valor significativo, mudança alta dobra e /ou miRs relacionadas com angiogénese. Cinco amostras de cada grupo com o tumor suficiente miR remanescente após a análise de matriz foram usadas na validação de PCR. Fora dos 41 miRs testados, 28 miRs foram detectadas em 7 ou mais amostras e analisados. A estabilidade dos miARNs detectadas em todas as amostras foi testada por EXlocalizado usando o software Normfinder. miR-423-5p foi um dos miARNs referência recomendados em conjunto com o miR-150, miR-423-5p e miR-300. miR-300 foi excluído devido a níveis muito baixos detectados. Além disso Normfinder encontraram grande variação no miR- 150, no entanto o miR-423-5p verificou-se ser a mais estável de miARN no conjunto de dados e, consequentemente, utilizados como referência. Todos em tempo real experimentos qPCR foram realizadas por Exiqon, Vedbaek, Dinamarca. RNA de 10 ng foi transcrito de modo reverso em 10 ul reacções usando o miRCURY LNA ™ Universal PCR RT miR, poliadenilação e de cDNA kit de síntese (Exiqon); cada amostra foi processada em triplicado. O ADNc foi diluída × 100 e 4 ul foi utilizado em reacções de PCR de 10 ul de acordo com o protocolo para miRCURY LNA ™ Universal PCR RT miR; cada miR foi ensaiado uma vez por qPCR no ADNc triplicado. A amplificação foi realizada num LightCycler® 480 Real-Time PCR System (Roche) em placas de 384 poços. (11,5 versão) LinRegPCR software foi utilizado para determinar a eficiência de amplificação qPCR. A eficiência média de amplificação foi utilizado para corrigir os valores Raw Cp.

Pathway análise

Os impactos dos diferentes percursos foram avaliados por Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA) derivada de análise de proteínas através do relacionamento evolucionário (PANTERA). O sistema de classificação PANTHER é um recurso único que classifica os genes pelas suas funções, usando evidências experimentais científicos publicados e relações evolutivas para predizer a função, mesmo na ausência de evidência experimental direta. O conjunto gene foi retirado do banco de dados MirDB (https://www.mirdb.org) (https://rnajournal.cshlp.org/content/14/6/1012.full), que compilou listas de genes de vias de curadoria em o banco de dados PANTHER.

Uma lista completa está disponível no https://mirdb.org/cgi-bin/pathway.cgi. miRNA anotação é baseado em miRBase versão 13 (https://www.mirbase.org/). análise GSEA foi realizada utilizando a linguagem estatística R (www.r-project.org) eo pacote GSEA para R disponíveis em https://www.broadinstitute.org/gsea/downloads.jsp.

Dados