Sumário

presença citoplasmática de Hsp60, que é principalmente um chaperonin mitocondrial codificado em gene nuclear, tem sido frequentemente afirmado, mas o seu papel na sinalização intracelular é em grande parte desconhecido. Neste estudo, foi demonstrado que a Hsp60 citosólica promove a activação mediada por TNF-α do percurso de sobrevivência IKK /NF-kB através de interacção directa com IKKα /β no citoplasma. perda selectiva ou bloqueio da Hsp60 citosólica pelo oligonucleótido anti-sentido específico ou o anticorpo neutralizante diminuiu a activação IKK /NF-kB e a expressão de genes alvo de NF-kB, tais como Bfl-1 /A1 e MnSOD, que, assim, aumentada a produção de ROS intracelular e ASK1 morte celular dependente de, em resposta ao TNF-α. Por outro lado, a expressão ectópica da Hsp60 citosol-alvo maior ativação IKK /NF-kB. Mecanicamente, a Hsp60 citosólica maior ativação IKK via upregulating a fosforilação de serina dependente de ativação-in de modo independente de acompanhante. Além disso, o estudo rato transgénico mostrou que a Hsp60 citosólica suprimida a morte celular hepática induzida por dietilnitrosamina

in vivo

. A Hsp60 citosólica é provável que seja um componente regulador de IKK complexa e implica o primeiro factor de mitocondrial que regula a sobrevivência de células por meio de NF-kB via

citação:. Chun JN, Choi B, Lee KW, Lee DJ, Kang DH, Lee JY, et al. (2010) citosólico Hsp60 está envolvido na sobrevivência NF-kB-Dependente das células cancerosas através de regulamento IKK. PLoS ONE 5 (3): e9422. doi: 10.1371 /journal.pone.0009422

editor: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasil

Recebido: 02 de dezembro de 2009; Aceito: 18 de janeiro de 2010; Publicação: 23 de março de 2010

Direitos de autor: © 2010 Chun et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por 21C Frontier funcional Projeto Proteomics (FPR08-B1-190), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência Tecnologia e pelo KOSEF através do Centro de Sinalização Celular Drug Discovery Research (CCS DDR, R15-2006-020) a Ewha Womans University. Este estudo também foi apoiado em parte por uma concessão do R Programa D de Controle do Câncer, Ministério da Saúde Bem-estar (0.420.190). J. N. Chun, K. W. Lee, J. Y. Lee, B. A. Choi, e H. I. Kim foram apoiados pela Coreia do Cérebro 21 concessão do Ministério da Educação, Ciência Tecnologia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as células de mamífero expressam um certo número de genes de sobrevivência que desempenham os papéis na inibição da activação de caspase, remoção de radicais oxigénio prejudiciais, defendendo função mitocondrial, e a verificação do ciclo celular. Entre os factores de transcrição responsáveis ​​pela indução dos genes de sobrevivência, factor nuclear-kB (NF-kB) é um elemento chave que orquestra a resposta de sobrevivência de células complexo [1]. Em particular, os genes de sobrevivência de NF-kB-dependentes incluem genes anti-apoptóticos, tais como genes de salvaguarda mitocondriais, tais como a superóxido de manganésio-dismutase (MnSOD) e Bcl-2 membros da família C-IAP e c-FLIP, e [2] , [3], [4]. A cinase central na via de activação de NF-kB é o inibidor da kB-quinase (IkB cinase ou IKK) que fosforila a proteína IkB em dois resíduos de serina amino-terminal, que conduz à sua degradação ubiquitinação e proteossomal e a consequente libertação do NF-kB proteínas [5]. Os estímulos extracelulares para activar NF-kB via convergem para IKK [6]. Portanto, inúmeros esforços têm sido feitos para delinear a regulação da activação IKK. Em primeiro lugar, a regulação dependente da fosforilação de activação de IKK foi caracterizada [7]. A fosforilação de dois resíduos de serina (Ser 177 /Ser181 em IKKβ humana) na activação de T-ciclo é essencial para a activação, enquanto que a auto-fosforilação de serina agrupamento carboxilo-terminal desliga-se a activação. Muitas cinases foram implicadas para ser envolvido na fosforilação de activação de NF-kB induzindo-quinase (NIK) [8], [9], proteína quinase activada por mitogénio /quinases ERK-quinase 1 (MEKK1) [10], MEKK2 /3 [11], [12], de células progenitoras hematopoiéticas da cinase-1 (HPK1) [13], de linhagem mista quinase 3 (MLK3) [14], TGF-β quinase activada 1 (TAK1) [15]. No entanto, com exceção TAK1, não está claro como a quinase a montante ativa o complexo IKK. Em segundo lugar, a regulação dependente de ubiquitina de activação IKK tem sido estudado por muitos anos [15], [16]. Recentemente, a subunidade reguladora IKKγ (ou OMNE) do complexo IKK tem sido mostrado para ser ubiquitinadas, bem como para reconhecer cadeia polyubiquination Lys63-ligada em proteína de receptor-1 de interacção (RIP1) [17], [18]. Em terceiro lugar, a regulação da activação IKK através das proteínas que interagem tem sido caracterizada. Os melhores exemplos são proteínas de choque térmico. Por exemplo, Cdc37 e Hsp90 têm sido relatados para agir como componentes adicionais do complexo IKK que estabilizam o complexo de [19], [20]. Hsp27 foi mostrado para interagir com IKKβ de um modo dependente de TNF-α-[21]. Hsp70 também interage com IKKγ mas interfere com a activação de IKK [22]. Além do mais, a associação entre a proteína fosfatase 2Cβ (PP2Cβ) e o complexo IKK tem sido demonstrada [23], e ELKS também foi identificada como uma nova subunidade reguladora do complexo IKK que medeia o recrutamento de IkB do complexo [24]. No entanto, não há nenhuma indicação de uma proteína mitocondrial envolvida na activação IKK /NF-kB.

Temos recentemente identificada proteína de choque térmico 60 (Hsp60) como uma proteína que interactua com IKK. Hsp60 é a chaperonina mitocondrial que promove a dobragem da proteína importada para conformação nativa. No entanto, a existência e função de Hsp60 em compartimentos extramitocondrial tem sido frequentemente afirmado [25]. Por exemplo, Hsp60 pode ser um ligando para os receptores da superfície celular tais como o receptor? Toll-like [26]. Intracelularmente, Hsp60 foi mostrado para interagir com pró-caspase-3 ou Bax [27], [28], [29]. No entanto, a função de Hsp60 relacionados com a sinalização de sobrevivência da célula não foi relatada. Neste estudo, Hsp60 foi encontrado para mediar a sobrevivência de NF-kB-dependente de sinalização nas células. Especificamente, Hsp60 interagiram directamente com IKKα /β no citoplasma e, em seguida, promoveu a activação dependente da fosforilação da cinase em resposta ao TNF-α. Tal função de sinalização de Hsp60 foi independente da sua actividade de chaperona, que define Hsp60 para além de outras proteínas de choque de calor que funcionam por meio de estabilizar ou desestabilizar o complexo de sinalização [30]. Nós também mostrou

in vivo

evidências de que a expressão citosólica de Hsp60 protege as células hepáticas contra danos induzidos por químicos via melhorando a ativação IKK. Assim, este resultado representa a função pró-sobrevivência novela de Hsp60 citosólica e lançar uma luz sobre a compreensão da função da Hsp60 em compartimentos extra-mitocondrial [25].

Resultados

Hsp60 interage com IKK complexo no citoplasma

Para identificar um componente adicional, examinámos a composição molecular do complexo IKK latente usando uma técnica de purificação proteomic combinando imuno-afinidade e espectrometria de massa. Resumidamente, o complexo IKK foi precipitado a partir de lisados ​​de células HeLa S3 não estimuladas utilizando esferas de anticorpo anti-IKKα, e as proteínas co-precipitadas foram sequenciados por espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida. A identificação das subunidades de IKK e Hsp90 indicou que a imunopurificação de IKK complexo bastante trabalhado (Fig. 1A). Como consequência, este estudo proteómico identificada uma proteína de choque térmico, Hsp60, nos precipitados (Fig. 1A e 1B). A presença das subunidades de IKK e Hsp60 nos precipitados foi confirmada por imunotransferência (Fig. 1C). Então, decidimos investigar o significado biológico da interação IKK-Hsp60.

A. Um gel de poliacrilamida corado com prata resolver o complexo IKK purificada por afinidade. B. espectros MS /MS de [M + 2H]

2 + iões dos péptidos derivados a partir da banda de proteína que corresponde a Hsp60. C. Immunoblot (IB), análises de subunidades de IKK e Hsp60 no complexo purificado por afinidade. D. Interação da Hsp60 com complexo de IKK. complexo IKK foi imunoprecipitada (IP) a partir de lisados ​​de células HeLa (proteínas totais de 500 ug de cada) com IKKα, IKKβ, e anticorpos específicos para IKKγ. As subunidades IKKα /β /y, Hsp60, Hsp90 e foram coradas imunologicamente. WCL, lisado de células inteiras. E.-TNF-α independente interacção de Hsp60 e IKK complexo. F. Co-imunoprecipitação de Hsp60 e IKK complexo na fracção citosólica.

Painel superior

, sobrenadante pós-nuclear (PNS), citosol (Cyto) e mitocôndria (Mito) frações de células HeLa foram coradas imunologicamente. COX4 tubulina e foram usadas como marcadores mitocondriais e citosólicas, respectivamente.

Baixa painel

, Hsp60 foi imunoprecipitada a partir da fracção citosólica utilizando um controlo de IgG de cabra ou de anticorpos anti-Hsp60 (K-19 e N-20). borrões representativos são mostrados (

n

= 3).

O primeiro passo foi verificar a interação endógena de Hsp60 e IKKS por experiências de co-imunoprecipitação. Quando os complexos de IKK heterogéneas foram precipitados com anticorpos contra IKKα, IKKβ, e IKKγ, cada um dos anticorpos específicos para a subunidade de IKK semelhante precipitados Hsp60 (Fig. 1D). Além disso, a Hsp90 também foi co-precipitada com IKK complexo de [20], [21]. Esta interacção foi encontrado para ser afectado pelo tratamento TNF-α (Fig. 1E), indicando que a Hsp60 é uma proteína componente dos complexos de IKK heterogéneos. Uma imunoprecipitação reversa foi então levada a cabo com a fracção citosólica de excluir a contaminação mitocondrial. Os anticorpos anti-Hsp60 co-precipitado IKKγ com Hsp60, enquanto que a IgG de cabra de controlo não o fez (Fig. 1F), confirmando que a interacção de Hsp60 citosólica e IKK. A fim de visualizar a interação virtual de Hsp60 com IKKS em citoplasma, foi realizada a coloração imuno combinada com a microscopia electrónica (ME). Os complexos imunitários de Hsp60 e IKK com os seus anticorpos específicos foram detectados de forma diferente, utilizando anticorpos secundários marcados com 20 NM- e partículas de ouro 40 nm de diâmetro, respectivamente. Como resultado, as partículas de ouro Hsp60 de rotulagem foram distribuídos ao longo das estruturas celulares: não só na matriz e do espaço intermembranar das mitocôndrias, mas também no citoplasma e plasma de membrana (Fig. 2B). Em contraste, as partículas de ouro e IKKα- IKKβ de rotulagem foram detectados principalmente no citoplasma (Fig. 2C e 2D), enquanto o IKKα também foi detectado no núcleo, o que é consistente com os relatórios anteriores [31], [32] . Embora as subunidades do núcleo IKK foram mostrados para ser encontrado na fracção mitocondrial [33], os nossos dados mostram que as partículas de ouro-rotular IKK foram muitas vezes visto nas estruturas vesiculares, em vez de as mitocôndrias (Fig. 2C e 2D). Essa discrepância poderia ser devido ao estudo anterior feito com fracionamento subcelular. Quando a Hsp60 e IKKS foram co-corados, a ligação directa de 20 nm e 40 nm de partículas de ouro foi claramente detectada no citoplasma (Fig. 2E e 2F). Deve notar-se que nem todo o IKKα e IKKβ foram associados com Hsp60. Estes resultados indicam colectivamente que a Hsp60 interage directamente com o complexo IKK no citosol.

células HeLa foram imunorreagir com qualquer primária (A), anti-Hsp60 (B), anti-IKKα (C), anti-IKKβ (D), os anticorpos anti-Hsp60 /IKKβ (F) anti-Hsp60 /IKKα (e), e, em seguida, marcada com os anticorpos secundários correspondentes conjugados com 20 nm ou 40 nm de partículas de ouro, como descrito no Procedimento Experimental. A rotulagem foi avaliada por microscopia eletrônica de imuno-ouro. Os núcleos (Nu) e das mitocôndrias (M) são indicadas.

Arrows

indicam a adesão direta de Hsp60- e partículas de ouro marcado com IKK. Nenhum sinal imunorreactivo foi visto na amostra sem anticorpos primários (A). Os experimentos foram repetidos duas vezes com os mesmos resultados, e os resultados representativos são mostrados.

Hsp60 interagir diretamente com IKKα /β, não IKKγ

Em seguida, analisamos a interação molecular de Hsp60 e IKKS. Para fazer isso, construiu-se uma versão de destino-citosol de Hsp60 (Hsp60c), em que a sequência de sinal de direccionamento mitocondrial é suprimido,. Quando Hsp60c foi co-expressa com cada uma das subunidades do núcleo de IKK, Hsp60c interagiu com IKKα e, embora em menor grau, com IKKβ, mas não com IKKγ (Fig. 3A). Em seguida, um

in vitro

experiência de ligação com as proteínas recombinantes de glutationa-S-transferase (GST) -fused Hsp60 e (seu)

6-tag subunidades principais IKK foi avaliada por um GST pull-down ensaio. O resultado, mais uma vez, indica que o Hsp60 se liga directamente a IKKα e IKKβ, mas não para IKKγ (Fig. 3B).

. A ligação directa da Hsp60 e IKK subunidades. As células 293T foram co-transfectadas com Hsp60c (marcador de HA) e cada uma das proteínas de subunidade de IKK (marcador FLAG) durante 24 horas. B.

In vitro

associação de Hsp60 com IKKα e IKKβ. proteínas Hsp60 fundida com GST ligados aos glutationa Sepharose foi incubada com os lisados ​​de células de inseto Sf9 expressando suas proteínas IKK

6-tag. Hsp60 e IKKS foram detectados por immunoblotting para GST e HA marcas, respectivamente. diagrama esquemático, mostrando C. mutantes de deleção de Hsp60. Os putativos locais de fosforilação de quinases, incluindo PKA /PKG (1) e PKC (2), são indicadas. D e E. A interacção de Hsp60 de tipo selvagem (WT) e mutantes de deleção com IKKα-ectopicamente expressa em células 293T (D) ou ao complexo IKK endógeno em células HeLa (E). O vector de controlo (C) é indicado. borrões representativos e imagens são mostradas (

n

= 3). n.s., inespecífica.

A interação molecular de Hsp60 com IKK foi ainda caracterizada por experimentos de mapeamento de domínio. Uma vez que a deleção do terminal C dificultada a expressão ectópica, uma série de mutantes de deleção N-terminal de Hsp60c foi testado quanto à ligação a IKK através de co-expressão com IKKα Bandeira-marcado em células HEK293 (Fig. 3C). Os resultados mostraram que a parte N-terminal (~160 aminoácidos de N-terminal) da proteína Hsp60 foi mostrado para ser dispensável para a interacção (Fig. 3D). O mesmo resultado foi obtido quando o complexo IKK endógena foi imunoprecipitada a partir de células HeLa transfectadas com as construções de Hsp60c (Fig. 3E). Os resultados indicam bastante que o domínio de ligação de núcleo situa-se no meio da proteína Hsp60.

Hsp60 está envolvido na IKK /NF-kB activação

Em seguida, o efeito biológico de Hsp60- citosólica interacção IKK foi investigada em TNF-α-mediada via de NF-kB. Para atingir o objectivo, o passo essencial consiste em manipular o nível de Hsp60 citosólica sem afectar a uma deficiência de Hsp60 mitocondrial porque é conhecida por causar um defeito funcional mitocondrial [34], [35], [36]. Curiosamente, uma série de estudos tem relatado anteriormente que um oligodesoxinucleótido anti-sentido (AS-ODN) complementares a uma sequência em torno do codão de iniciação da estrutura de leitura aberta humano Hsp60 na verdade reduz o nível de Hsp60 citosólica [27], [37], [38] . Por isso, nós decidimos testar esta AS-ODN (designado como AS-1) para obter um efeito selectivo knockdown. A fim de excluir a possibilidade de uma acção não específica de uma sequência de ODN particular, nós escolhemos uma segunda AS-ODN (AS-2) que é complementar à região (+ 95~ + 110 a partir de codão de iniciação) próximo da extremidade 5 ‘ , mas após a sequência de sinal de direccionamento mitocondrial (MTS), de Hsp60 grelha de leitura aberta (Fig. S1A). O ODN sentido (S-ODN) complementares para o AS-1 foi utilizado como um ODN de controlo. Uma vez que o ODN anti-sentido é um bloqueador de translação moderada, ela não induziu a redução de nível total Hsp60 (Fig. S1B). No entanto, a transfecção de ODN-AS, de facto reduzidos selectivamente níveis Hsp60 citosólica em comparação com o controlo simulado ou S-ODN sem afectar o nível mitocondrial (Fig. 4A). Para entender esse fenômeno, temos a hipótese de que a meia-vida da proteína Hsp60 em dois compartimentos podem ser diferentes. Para provar isto, a meia-vida de Hsp60-alvo citosol (Hsp60c) foi avaliada após a inibição da síntese de proteínas. Surpreendentemente, o nível de proteína Hsp60 citosólica foi rapidamente reduzida (calculado

t

½ = 3,2 min), enquanto que o nível total de proteínas Hsp60 e IKKα endógenos não foi alterada (Fig. 4B). Além disso, esta redução foi completamente bloqueado pelo tratamento de um inibidor de proteassoma MG132 (Fig. 4C). Note-se que o tratamento MG132 também resultou no aumento notável do nível basal da proteína Hsp60c. Assim, este resultado, pelo menos em parte, explica por que o nível de Hsp60 citosólica era mais sensível ao tratamento com AS-ODN, e que, adicionalmente, sugere que o nível de Hsp60 citosólica pode ser controlada pelo proteassoma.

. Ablação de citosólica Hsp60 por ODNs de sentido inverso. As fracções citosólicas e mitocondriais preparadas a partir de células HeLa simulada ou ODN-transfectadas foram coradas imunologicamente. S, sentir ODN; AS-1 e AS-2, ODNs de sentido inverso. A fracção mitocondrial foi carregada a um volume de um quinto da fracção citosólica correspondente. Em particular, Prx III, que é uma enzima antioxidante presente na matriz mitocondrial, foi usado como marcadores mitocondriais para assistir a ruptura mitocondrial não específica. B. A meia-vida da proteína Hsp60c ectopicamente expressa (um marcador de HA) após a inibição da síntese de proteínas com ciclo-heximida. A intensidade da banda de HA foi medida e normalizada pela quantidade de banda IKKα. Os dados do gráfico são médias ± S.D. de dois experimentos independentes e montados em SigmaPlot 8,0 software. C. volume de negócios de proteassoma dependente de proteína Hsp60c citosólica. As células HeLa foram pré-tratadas com ou sem MG132 (5 ^ M) 30 minutos antes do tratamento com ciclo-heximida. D. TNF-α induzida por activação de IKK e JNK1 em células pseudo-transfectadas ou ODN. O

In vitro

actividade de quinase (KA) foi em média com os valores a partir de duas experiências independentes, e que é representado como um aumento para o dobro da actividade contra as células não estimuladas e transfectadas por simulação (pista 1). E. NF-kB activação da transcrição em células pseudo-transfectadas ou ODN. A concentração crescente de AS-ODN (100 nM ou 200 nM) foi testado. A actividade de luciferase foi normalizada relativamente à actividade β-galactosidase e os dados são médias ± S.D. de quatro experiências independentes (*

P Art 0,0001, **

P Art 0,001 versus células S-ODN-transfectadas estimulados).

O TNF induzida por activação -α IKK /NF-kB foi então examinada nas células aS-ODN-transfectadas. Um

In vitro

ensaio de quinase mostrou que a transfecção de ODN AS-sensivelmente reduzida a activação IKK em resposta ao TNF-α em 60% em comparação com a do simulado ou S-ODN (Fig. 4D). No entanto, os AS-ODN não teve efeito sobre a activação da MAP cinase em resposta ao TNF-α (Fig. 4D e a Fig. S1C), revelando o efeito específico do Hsp60 AS-ODN na activação IKK. Além disso, os AS-ODN aboliu quase completamente a activação transcricional de NF-kB em resposta ao TNF-α, enquanto que S-ODN não, em comparação com células falsamente tratados (Fig. 4E). Devido à sua eficácia knockdown, AS-1 é mais potente que o AS-2. No entanto, a transfecção de ODN em si não induziu basal da activação de NF-kB, indicando nenhum efeito fora do alvo de ODNs. Além disso, o efeito redutor de AS-ODN na actividade transcricional de NF-kB também era evidente em células 293T e A549 (Fig. S1D). Um experimento controle adicional mostrou que os AS-ODN não teve nenhum efeito outra activação do factor de transcrição, tais como AP-1, NF-AT, e CRE (Fig. S1E).

Um estudo semelhante foi realizado através do bloqueio da Hsp60 citosólica utilizando um anticorpo específico (Hsp60N), que foi utilizado para imunoprecipitação e immunostaing de Hsp60 (ver Fig. 1). A transdução de anticorpos foi realizada por um sistema de entrega mediada por proteína de péptido [39]. A IgG controle de cabra e anticorpo Hsp60N foram encontrados para ser entregue com êxito para o citoplasma, como não se fundiu com Mitotracker (Fig. 5A), e Hsp60N, mas não o controle IgG, obrigado a Hsp60 (Fig. 5B). Este resultado indica que o anticorpo entregou pode actuar como um bloqueador de função. Em seguida, a activação IKK /NF-kB foi examinado em células transduzidas com anticorpo. O anticorpo Hsp60N evidentemente reduziu a activação IKK em resposta ao TNF-α por 50% do nível obtido com o controlo de IgG (Fig. 5C). Em contraste, a activação de JNK induzida por TNF-α não foi afectada, o que prova mais uma vez que o papel de Hsp60 é específico para a activação de IKK. Consistentemente, o anticorpo Hsp60N reduziu significativamente a actividade transcricional de NF-kB (Fig. 5D). Os dados colectivamente concluir que promove a Hsp60 citosólica sinalização IKK /NF-kB induzida pelo TNF-α.

. Transdução de anticorpo Hsp60-neutralizante (Hsp60N) para o citoplasma das células HeLa. MitoTracker Red (Molecular Probes, EUA) e DAPI indicam mitocôndrias e núcleos, respectivamente. B. O anticorpo Hsp60N transduzidas obrigado a Hsp60 endógena. Após a transfecção de anticorpo, os lisados ​​de células HeLa foram sujeitos a precipitação utilizando Proteína-A Sepharose. As proteínas precipitadas foram imunotransferidas para Hsp60. C. IKK e JNK1 activação em resposta ao TNF-α em IgG de controlo ou células HeLa transfectadas com anticorpo Hsp60N. O

In vitro

actividade de quinase (KA) foi em média com os valores a partir de duas experiências independentes, e que é representado como um aumento para o dobro da actividade versus a não estimulado e células de controlo de IgG-transfectadas (pista 1). NF-kB activação transcricional induzida por FNT D.-α em células transfectadas com anticorpos (*

P

0,01 versus células transfectadas IgG-estimuladas).

A expressão ectópica de citosol -targeted Hsp60 promove suficientemente IKK /NF-kB activação

por outro lado, o papel da Hsp60 citosólica na IKK /NF-kB via foi dirigida por sobre-expressão de Hsp60c-alvo citosol. O Hsp60c ectopicamente expressa-se encontrado a associar ao complexo IKK (Fig. 6A) e marcadamente aumentou a activação de IKK e NF-kB em resposta ao TNF-α (Fig. 6B e 6C). Deve notar-se que a expressão ectópica de Hsp60c marginalmente induzida a IKK basal e activação NF-kB. O efeito da expressão Hsp60c na activação de NF-kB foi completamente abolida em células IKKβ-deficiente (Fig. 6d), indicando que a actividade de regulação da Hsp60 citosólica é dependente de IKK. Além disso, a expressão ectópica de Hsp60c não melhorar, quer a activação de JNK ou a activação de outros factores de transcrição, tais como AP-1, CRE, e de NF-AT (Fig. S2). Este resultado indica que o aumento do nível de Hsp60 citosólica aumenta IKK /activação de NF-kB induzida pelo TNF-α.

As células foram transfectadas quer com controlo (CGN) ou plasmídeo que codifica Hsp60c (marcador de HA) durante 24 horas e em seguida, tratado com TNF-α. A. Incorporação de Hsp60c ectopicamente expressa (HA tag) no complexo IKK. B. TNF-α induzida por activação em células HeLa IKK. C TNF-α induzida por activação do NF-kB em células HeLa (

N

= 4, *

P

0,0001 contra o homólogo não estimulado). activação de NF-kB induzida pelo TNF D.-α no transfectadas IKKβ

– /- 3T3 (

N

= 4, *

P

0,001 versus estimuladas CGN-transfectadas células, não ND detectado).

Hsp60 regula a fosforilação IKK na activação T-circuito

Para compreender o mecanismo subjacente à acção reguladora da Hsp60 na ativação IKK /NF-kB, várias abordagens experimentais foram tentadas. Para determinar se é necessária a actividade de chaperonas Hsp60, os dois resíduos de aminoácidos que são conhecidos por ser crítico para a actividade de chaperonas Hsp60 foram consideradas. Um deles é um resíduo de lisina (K28), que está envolvido na oligomerização de proteínas Hsp60 [40], [41]. O outro é um resíduo de aspartato (D423), que é um resíduo do local activo para a actividade de ATPase [42], [43]. Assim, os mutantes Hsp60c, em que K28 e D423 são substituídos com glutamato e alanina, respectivamente, foram construídos. A experiência de co-transfecção mostrou que ambos os mutantes interagiu com IKKα IKKβ e tão bem ou talvez ainda melhor do que o tipo selvagem (Fig. 7A). A activação IKK em resposta ao TNF-α nas células que expressam Hsp60 mutante era semelhante ao do tipo selvagem (Fig. 7B), o que indica que estas mutações de perda de função não afectou a actividade de aumento de IKK. Além disso, induzida por TNF-α de transcrição NF-kB foi ainda reforçada nas células que expressam mutantes Hsp60 em cerca de 4-6 vezes maior do que no controlo de vector (Fig. 7C). O efeito de aumento dos mutantes foi claramente IKKβ-dependentes, como testado novamente em células 3T3-IKKβ deficiente. Assim, este experimento utilizando os mutantes de perda de função sugerem fortemente que as funções citosólicas Hsp60 independentemente da actividade acompanhante na ativação IKK /NF-kB.

a. Associação de Hsp60c do tipo selvagem (WT) e mutantes com IKKα e IKKβ. As proteínas indicadas foram co-expressos em células 293T, como mostrado na Fig. 3A. B e C. IKK (B) e a activação de NF-kB transcricional (C) em células que expressam Hsp60c de tipo selvagem e mutantes a chaperonas inactivos. As actividades de quinase e repórter foram analisados ​​como descrito na Fig. 4 (para o ensaio repórter,

n

= 6, *

P Art 0,0001 contra contraparte não estimulada). D.

In vitro

actividade de quinase de IKK, na presença de proteína Hsp60 recombinante. O complexo IKK foi imunoprecipitada a partir de lisados ​​de células HeLa e incubou-se com ou sem as proteínas GST indicadas (20 ug de cada) em tampão de reacção de cinase durante 10 min antes da reacção de quinase. E. Serina fosforilação de IKKα /β em células HeLa transfectadas com ODN AS-1. Os dados do gráfico são médias ± S.D. (

n

= 3, *

P Art 0,02, *

P Art 0,001). F. fosforilação em serina de IKKα /β em células HeLa Hsp60c-expressão. Um blot representativo é mostrado (

N

= 3).

Uma das proteínas interactuantes IKK, alces, foi mostrado para mediar o recrutamento de IkB a IKK complexo [24] . Para testar este modo de acção, a proteína Hsp60 recombinante foi adicionado directamente na reacção de quinase de IKK, onde o complexo IKK activada é incubada com IkB de comprimento completo humano como um substrato. O

In vitro

actividade de quinase de IKK activado para IkB não foi afectada pela presença de proteína Hsp60 (Fig. 7D), indicando que a Hsp60 não está envolvida na interacção de IKK e o seu substrato de IkB.

por último, um envolvimento directo das Hsp60 citosólica na ativação IKK foi analisada em função da fosforilação de serina dependente de ativação-in da T-loop ininterrupto de IKKα /β. A transfecção de ODN AS-marcadamente suprimida a fosforilação induzida por TNF-α de IKK em Ser178 /181, indicando que a activação dependente de IKK-fosforilação foi diminuída (Fig. 7e). Por outro lado, a expressão ectópica de Hsp60c resultou em um aumento da fosforilação de IKK (fig. 7F). No geral, os dados indicam que o Hsp60 citosólica está envolvido na activação dependente de IKK-fosforilação, em vez de a estabilização dependente do acompanhante do complexo IKK.

Hsp60 citosólica afecta a expressão do gene alvo e sobrevivência celular de NF-kB

Para determinar a importância da regulação mediada por Hsp60 citosólica da via IKK /NF-kB, foi examinada a expressão de genes alvo de NF-kB em células transfectadas-ODN. Quando a expressão de genes anti-apoptóticos foi pesquisada através de um ensaio de protecção de RNase [44], a expressão de TRAF1, C-IAP1 e C-IAP2 não foram afectados pelo ODN AS-transfecção (fig. 8A). Este foi inesperado, mas levou-nos a postular a possibilidade de que alguns genes alvo selecione relacionadas com a protecção mitocondrial podem ser afetados. Para testar isso, olhamos para a indução de vários genes-alvo, incluindo proteínas antioxidantes (cadeia de ferritina pesado e MnSOD) e Bcl-2 membros (Bcl-2, Bcl-X

L, Bfl-1 /A1). Curiosamente, o AS-ODN diminuiu significativamente a indução de apenas MnSOD e Bfl-1 expressão /A1 em resposta ao TNF-α (Fig. 8B). O anticorpo Hsp60N também reduziram significativamente a indução destes genes (Fig. 8C). foi novamente confirmado que a indução da expressão de c-IAP2 não foi afectado em nenhum dos casos. Assim, os resultados indicam que a regulação da activação IKK por Hsp60 citosólica influencia a expressão de genes selecionados alvo NF-kB.

A. ensaio de protecção de ARNase para a indução de genes anti-apoptóticos em células transfectadas-ODN. O autorradiograma é mostrado um representativos de três experiências independentes. B e C. QPCR para a indução de genes endógenos alvo de NF-kB em células transfectadas-ODN (B) e células transf ectadas com o anticorpo (C) (

N

= 3, *

P 0,01, **

P Art 0,001). produção de ROS D. celular de TNF-α mediada em células transfectadas-ODN. As imagens representativas são mostrados. Os dados são médias ± S.D. de aumento vezes contra células simuladas não tratadas da fluorescência relativa DCF (

n

= 4, *

P Art 0,05, **

P Art 0,001). E. activação de JNK e p38 MAPK em células transf ectadas-ODN. borrões representativos são mostrados. Os dados nos gráficos são médias ± S.D. das intensidades de fosfo-JNK (p46) ou bandas de fosfo-p38 que foram normalizados pelos correspondentes não-fosfo-bandas (

N

= 3, *

P

0,05, **

P Art 0,001). F. ASK-1 activação em células transfectadas com ODN. A actividade de quinase (KA) foi em média com os valores a partir de duas experiências independentes, e apresentado como um aumento para o dobro da actividade contra as células não estimuladas e transfectadas por simulação (pista 1). G. TNF-α induzida morte celular em células HeLa simulada ou ODN-transfectadas. Os dados são médias ± S.D. (

n

= 3, *

P Art 0,01). H. TNF-α induzida morte celular de células de carcinoma do cólon transfectadas com ODN. O nível de Hsp60 em frações subcelulares é mostrado (

Alta

). Os dados do gráfico são médias ± S.D. (

n

= 3, *

P Art 0,05, **

P Art 0,01). A morte celular foi analisada por FACS após coloração com iodeto de isotiocianato e propídio anexina V-fluoresceína.

A seguir, se perguntou se essa regulamentação de selecionar genes-alvo tem um impacto sobre a sobrevivência da célula. Uma vez que existe uma possibilidade de que MnSOD e função Bfl-1 /A1 para suprimir as espécies derivadas de mitocondriais reactivas de oxigénio (ROS) [2], [45], o nível de ROS celular foi examinada nas células ODN-transfectados utilizando um oxidation- fluorescência de corante sensível, CM-H

2DCFDA. A transfecção AS-ODN induziu um aumento acentuado de ROS celulares em resposta ao tratamento com TNF-α de uma maneira dependente do tempo, em comparação com (Fig. 8D) simulada ou S-ODN transfecção. Uma vez que o nível de ROS aumentada está associada à morte celular através da activação de JNK sustentada [46], a activação sustentada de proteína-quinases activadas pelo stress, JNK e p38 MAPK, examinou-se. Inesperadamente, a activação de ambas as JNK e p38 MAPK foi encontrado para ser claramente sustentado em células AS-ODN-transfectadas (Fig. 8E). O MAP3K ASK-1 é conhecido por ser responsável pela activação sustentada de JNK e p38 na morte celular mediada por ROS [47]. Como mostrado na Fig.