Abstract
Cancro Segmentação Gene-Viro-Terapia (CTGVT) é construído através da inserção de um gene anti-tumoral em um vírus oncolítico (OV). Na verdade, é uma terapia OV-gene, que tem muito melhor efeito antitumoral do que qualquer terapia genética sozinho ou virotherapy sozinho em nossos artigos previamente publicados. Este estudo é uma modificação do CTGVT através da inserção de um cancro colo-rectal (CRC) gene supressor específico, ST13, para um vírus oncolítico específica CRC, o anúncio · CEA · E1A (Δ24), para construir o anúncio · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) para aumentar o tropismo direccionamento para cancro colorectal e foi brevemente nomeado como CTGVT-CRC. Embora tenham sido reportados muitos estudos sobre gene promotor e ST13 CEA mas nenhuma construção foi realizada para combinar os dois deles como uma nova estratégia para o tratamento específico do câncer colorretal (CRC). Para além da especificidade CRC, o efeito antitumoral de Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) também foi excelente e teve uma inibição quase completa (não erradicação) de CRC de xenoenxerto desde ST13 era um gene anti-tumor eficaz com menos toxicidade, e uma patente chinês (No. 201.110.319.434,4) estava disponível para este estudo. Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) causou apoptose celular através de p38 MAPK (isto é, P38), que upregulated CHOP e ATF2 expressão. A via de apoptose mitocondrial medicado foi activado pelo aumento da caspase 9 e caspase 3 expressão
citação:. Zhou X, Xie G, Wang S, Wang Y, Zhang K, S Zheng, et ai. (2012) potentes e específicos antitumoral Efeito de câncer colorretal pela CEA e Rb Duplo Regulado oncolytic adenovírus Harboring
ST13
Gene. PLoS ONE 7 (10): e47566. doi: 10.1371 /journal.pone.0047566
editor: Zhaozhong Han, da Universidade Vanderbilt, Estados Unidos da América
Recebido: 22 de maio de 2012; Aceito: 18 de setembro de 2012; Publicado: October 15, 2012 |
Direitos de autor: © Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciência de Zhejiang Sci-tech University (ZSTU), Grant No. 1.016.834-Y, o Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa) (No. 2010CB529901, No. 2011CB510104), a Fundação Nacional de Ciências Naturais de China (81172449), o Importante Science Tecnologia projeto específico da hepatite e hepatoma programa relacionado (2008ZX10002-023), e do Programa de Inovação Novo (2009-ZX-09102-246). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O cancro é uma das principais preocupações de saúde pública global. Um total de 1,529,560 novos casos de câncer e 569,490 mortes por câncer ocorreu nos Estados Unidos sozinho em 2010 [1]. O câncer colorretal é a segunda maior causa de morte nos EUA e é o quarto tipo de câncer mais comum em homens eo terceiro câncer mais comum em mulheres em todo o mundo [2]. Assim, é essencial para os cientistas e médicos a desenvolver novas estratégias para o tratamento de câncer de cólon. Uma estratégia que foi iniciada por nós em 1999 até 2011, denominado Cancer Segmentação Gene-Viro-Terapia (CTGVT), envolve a inserção de um gene anti-tumoral em um vírus oncolytic (OV) [3], [4]. Na verdade, é uma terapia OV-gene. O CTGVT (OV-gene) tem um efeito anti-tumoral potente, que é o resultado de os genes inseridos a ser replicado várias centenas dobra juntamente com a replicação do vírus oncolítico em células [5] cancerosas. Normalmente, a fim de melhor efeito anti-tumoral é por CTGVT (OV-gene) do que o efeito de OV e Ad-gene. Nós nos dedicamos a estudar a estratégia CTGVT (OV-gene) para mais de 10 anos e publicou cerca de 70 papéis relacionados, que sempre demonstrou muito maior actividade anti-tumoral do que a de Ad-gene [6], [7], [8]. O CTGVT (OV-gene) é oportuna se tornando um tema quente desde Amgen pagou 1 bilhão de dólares para comprar o OncoHSV-GM-CSF (OV do vírus do Herpes Simplex) a partir BioVex [9] eo OncoPox-GM-CSF foi publicado em Nature, 2011 [10].
colorrectal tumorigénese é um processo complicado que é accionado por genes múltiplos e envolve numerosos passos. Pesquisas anteriores mostraram que
ras
mutações genéticas; supressões nos cromossomos 5q, 17q e 18q;
neu, c-myc,
ou
c-myb
amplificações; e rearranjos do
trk
oncogene estavam envolvidos em tumores colorretais [11]. No entanto, estas alterações moleculares não poderia explicar completamente todo o processo de tumorigénese colorectal. Em 1993, Zheng
et al
. identificaram um gene relacionada com o cancro colo-rectal, que foi regulada negativamente em cancro colo-rectal, supressão chamado de tumorigenicidade 13 (ST13) (GenBank N ° HSU17714), que foi clonado por rastreio de hibridação subtractiva entre o cDNA de tecidos de mucosas normais e o ARNm de carcinoma colorrectal tecidos [12], [13], [14], [15]. Assim, ST13 era um gene candidato supressor de tumor envolvido em carcinoma colorrectal [16], [17]. O aumento da expressão da proteína ST13 pode suprimir a proliferação e induzir a apoptose de linhas celulares colorrectais. A nossa investigação anterior verificou-se que a utilização de ZD55-ST13 (um adenovírus E1B de 55 kDa oncolítico exclusão) conduziu a um efeito inibidor de 100 vezes para o crescimento de células de tumor em comparação com Ad-ST13
In vitro,
e ZD55-ST13 igualmente exerceu um efeito antitumoral potente num modelo animal xenoenxerto SW620 do carcinoma colorrectal [18]. A eficácia antitumoral melhorada de outra construção adenovírus SG500-ST13 oncolytic sobre SG500 era aparente a partir de experimentos usando o HCT116 e linhas de células SW620
in vitro
, bem como a aplicação do modelo de xenotransplante HCT116
in vivo
[19]. Em todas as investigações ST13 acima, não há nenhum trabalho utilizando o promotor CEA de tipo específico de células a conduzir a expressão de E1A (Δ24) para controlar a replicação selectiva dos vírus para outras terapia específica CRC.
antigénio carcinoembrionário (CEA) é um marcador tumoral amplamente utilizado, especialmente na vigilância de pacientes com câncer colorretal [20]. Experiências recentes indicam que o CEA pode funcionar como uma molécula de adesão celular que pode desempenhar um papel importante durante a embriogénese e, possivelmente, durante o desenvolvimento de tumores [21]. Schrewe H
et ai., Descobriram que uma construção de promotor de gene de CEA demonstrou uma actividade anti-cancro que era nove vezes maior contra a linha celular de adenocarcinoma SW403 produzindo-CEA do que a linha de células HeLa não-CEA produtoras de [20]. O promotor CEA acoplado ao vírus herpes simplex timidina cinase (HSV-TK), apareceu para regular positivamente a expressão selectiva de HSK-tk na linha celular de carcinoma pancreático expressam CEA BxPC3, o que levou a efeitos antitumorais [22]. AdCEAp /Rep, em que a expressão de E1A foi conduzido pelo promotor CEA, efetivamente inibidos múltiplas metástases hepáticas do CEA-positivo câncer de cólon M7609 em um modelo de xenotransplante [23].
Neste estudo, foi inserido gene ST13 em um anúncio do vetor viral oncolytic · CEA · E1A (Δ24) que aplicada promotor CEA para controlar a expressão de E1A com uma deleção de 24 pb na região de E1A responsável por retinoblastoma ligação (Rb) proteína e sua replicação e esta construção foi referido como Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) (a ST13 na parênteses representa uma cassete de expressão). Este é uma modificação do CTGVT com cancro específico CRC Gene Targeting-Viro-terapia (brevemente CTGVT-CRC), que constitui uma nova estratégia que não foi previamente relatada. Os nossos dados indicam que o anti-tumoral de Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) foi maior que a de Ad · (EGFP) CEA · E1A (Δ24), ainda mais elevada do que a de ONYX-015
In vitro
e
in vivo
. Ad · (ST13) · CEA · E1A tratamento (Δ24) significativamente inibido, mas não completamente erradicado o crescimento de carcinomas colo-rectais xenotransplante SW620 em ratinhos nus, e o tempo de sobrevivência foi dramaticamente melhorada sem uma morte ratinhos nus no anúncio · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) grupo tratado. Estes resultados fornecem uma visão nova para o tratamento específico para o cancro colorectal clínica e uma patente tenha sido aplicada [201110319434,4].
Materiais e Métodos
Os plasmídeos, vírus e Reagentes
A pMD18-T do vector foi comprado da Takara, Ltd., e o plasmídeo pBHGE3 foi comprado de Microbix Biosystems Inc. (Toronto). A almofada · E1A (Δ24), Simple-HCMV-MCS-poliA (SV40) e pXC2-CEA plasmídeos pMD18-T foram previamente construído pelo nosso grupo. O pCA13-ST13, ONYX-015 e vírus Ad-WT foram mantidas em nosso laboratório.
A. construção esquemática de anúncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) e Ad · (EGFP) · · CEA E1A (Δ24). O nativo
E1A
promotor foi substituído pelo promotor CEA para controlar a expressão do
E1A
gene com uma deleção de 24 pb. foi inserido um ST13 ou cassete de express de EGFP sob o controlo do promotor de hCMV entre a sequência de sinal ψ embalagem e o gene E1A. B. Identificação do gene promotor CEA e ST13 na almofada · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) por PCR. Pista M: DL2000 Marcador; Pista 1: promotor CEA; Pista 2: gene ST13. C. Detecção de E1A (Δ24) e os níveis de expressão ST13 quando as células SW620 foram infectadas com Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · · CEA E1A (Δ24) ou o vírus oncolytic típica ONYX- 015 a um MOI de 5 durante 48 horas. análise de Western blot foi realizada para detectar E1A (Δ24) e proteína ST13 níveis.
Os anticorpos contra caspase-3, caspase-9, Fas, Bcl-XL, CHOP, E1A, p38, Phospho-p38 A MAP quinase, ATF-2 e fosfo-ATF-2 foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, Inc. Os anticorpos de PARP-1/2 e p-actina foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA), anti-ST13 e anticorpos anti-hexon foram adquiridos a Epitomic, e a IgG anti-coelho de burro IRDye® 680 anti-rato IgG e IRDye® 680 burro foram adquiridos a partir de LI-COR.
a viabilidade das células tumorais infectadas com diferentes MOIs dos vários adenovírus oncolíticos. Três linhas de células tumorais CRC (SW620, HCT116 e HT29), e três linhas CEA-negativas celulares (Bcap37 cancro da mama, carcinoma CNE Nasopharynageal e HeLa de carcinoma cervical) e duas células normais (QSG7701 e WI38) estavam infectados com qualquer anúncio · (ST13 ) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), ou o vírus oncolítico típico ONYX-015 a uma gama de MOI (0,1, 1, 5 ou 10 MOI), 4 dias, de células a viabilidade foi determinada utilizando um ensaio MTT. As células não infectadas foram considerados como sendo 100% viáveis. As barras representam as médias ± DP (n = 6). B. A influência da infecção viral na viabilidade celular em diferentes momentos. Três linhas CEA celulares positivas (SW620, HCT116 e HT29) e três linhas CEA-negativas celulares (Bcap37, CNE e HeLa) e duas células normais (QSG7701 e WI38) foram infectadas com a ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), ou Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) a uma MOI de 10. Depois de 24, 48, 72, e 96 horas, a viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio MTT. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão de experiências em triplicado. C. A viabilidade das células tumorais infectadas com diferentes MOI de Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24). linha de células de cancro do cólon CEA-negativo (Colo-320) e CEA-positivos linha de células de câncer não-pontos (A549, MCF-7) foram infectados com Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) a uma gama de MOI ( 0,1, 1, 5 ou 10 MOI), 3 dias, a viabilidade celular foi determinada utilizando um ensaio MTT. As barras representam as médias ± DP (n = 6).
Construção de diferente promotor adenovirusesThe CEA recombinante a partir pXC2-CEA foi subclonado em pAd · E1A (Δ24) para formar pAd · · CEA E1A (Δ24 ) que transporta o gene de E1A de adenovírus serotipo 5 com uma deleção de 24 pb a partir de 923 pb a 946 pb. A cassete de expressão ST13 todo foi ainda inserida no pAd · · CEA E1A (Δ24) para formar pAd · (ST13) · · CEA E1A (Δ24). O método de construção para a geração de DAP · (EGFP) CEA · E1A (Δ24) foi semelhante ao de DAP · (ST13) CEA · E1A (Δ24)
. A sequência de cada uma das construções de plasmídeo foi confirmada utilizando digestão com enzimas de restrição, PCR e sequenciação de ADN. O vírus oncolytic anúncio · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) e Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) foram gerados por recombinação homóloga entre DAP · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) ou uma almofada · ( ST13) · · CEA E1A (Δ24) com o plasmídeo de empacotamento de adenovirus pBHGE3 (Microbix Biosystems) em células HEK293 utilizando o reagente de transfecção Effectene (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Cada adenovírus recombinante foi seleccionado depois de três ciclos de purificação de placa em células HEK293 e foi separadamente identificados por PCR. A purificação final de vírus foi realizada por cloreto de césio centrifugação em gradiente de densidade.
observações morfológicas de células tumorais e células normais infectadas com os diferentes adenovírus oncolíticos como detectado por microscopia. As células foram infectadas a uma MOI de 10, e as alterações morfológicas nas células foram observados por microscopia após 72 horas de infecção. B. Detecção de apoptose em células SW620 por FACS. células SW620 foram infectadas quer com ONYX-015, Ad · (EGFP) · · CEA E1A (Δ24) ou Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) a uma MOI de 10. Após 48 horas, as células foram colhidas e coradas com anexina V-FITC (por apoptose em estágio inicial), ou PI (para a apoptose em estágio final) e foram examinadas por citometria de fluxo. C. A percentagem de células apoptóticas foi calculada utilizando o software celular Quest. Os dados são apresentados como os (as barras de erro) média ± DP de experiências em triplicado. (** P 0,01; *** p 0,001)
Linhas Celulares e Cultura de Células
HEK293 (linha celular de rim embrionário humano), as células, A549 (adenocarcinoma do pulmão humano. linha), Colo-320 (linha celular de cancro do cólon humano), e MCF-7 (linha celular de cancro da mama humano) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA). HeLa (linhagem celular de carcinoma cervical humano), células SW620, HT29 e HCT116 (linhas celulares de cancro colorrectal humano), WI38 (linha celular humana normal de fibroblastos de pulmão fetal), e QSG-7701 (linha de células de fígado humano normal) foram adquiridos a partir da célula banco no Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). células SW620 foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY) que foi suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 4 mM, penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /mL). Todas as outras linhas celulares foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 10%. Todas as culturas de células foram mantidas a 37 ° C com 5% de CO
2 numa incubadora humidificada. Células numa fase de crescimento logarítmica, foram usadas para as experiências.
Células SW620 por western blot. células SW620 foram infectadas quer com ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) ou Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24) a um MOI de 5, durante 48 h, as proteínas relacionadas com a apoptose foram analisados por western blot.
Análise western blot
para explorar melhor os mecanismos moleculares responsáveis pela morte celular induzida pelo adenovírus recombinante, foram realizadas análises de western blot. células SW620 e HCT116 foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 5 x 10
5 por poço e cultivadas durante a noite, e foram, em seguida, tratadas com ou sem o vírus durante 48 h. Tanto as células aderentes e flutuantes foram colhidas em tampão de lise [Tris-HCl 62,5 (pH 6,8), 2% de dodecilsulfato de sódio (SDS), glicerol a 10 mM, e 1,55% de ditiotreitol]. As concentrações de proteína foram determinadas utilizando um ácido bicinconínico (BCA) Kit de ensaio de proteína (Thermo Scientific, Rockford, EUA). Quantidades iguais de proteínas foram separadas por 12% SDS-PAGE e foram, em seguida, transferidos para nitrocelulose (NC) membranas. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% e, em seguida, incubadas com anticorpos primários e anticorpos secundários fluorescentes apropriados. A imunodetecção foi visualizada utilizando um sistema de imagem de infravermelhos Odyssey (LI-COR Biosciences Inc., Estados Unidos).
Ensaio de viabilidade celular
As células foram dispensadas em placas de 96 poços e tratadas com ONYX-015, ad · (EGFP) · · CEA E1A (Δ24), ou ad (ST13) · · CEA E1A (Δ24) nos pontos mois e hora indicadas. Um ensaio de MTT foi realizado para determinar a viabilidade das células após o tratamento com os vários adenovírus. Quatro horas antes do final da incubação, 20 ul de solução de MTT (5,0 mg /mL) foi adicionada a cada poço. Os cristais resultantes foram dissolvidos com 150 uL de DMSO /bem, por agitação durante 10 min. A densidade óptica (D.O.) foi medida a 570 nm utilizando um leitor de microplacas de DNA (modelo GENios; Tecan, Mannedorf, Suíça). A percentagem de sobrevivência de células foi calculada utilizando a seguinte fórmula:% de sobrevivência celular = (valor de absorvância de células tratadas /valor de absorvância de células não tratadas de controlo) × 100%. Seis amostras replicadas foram avaliados para cada concentração.
Os tumores foram estabelecidos por injecção de células SW620 por via subcutânea no flanco direito de ratinhos nus. Quando os tumores atingiram 100-130 mm
3, os ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos (n = 8) e foram tratados diariamente com injecções intratumorais consecutivos quatro vezes de ONYX-015, Ad · (EGFP) · · CEA E1A ( Δ24) ou Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) a 5 × 10
8 UFP /dia e PBS. A. O tamanho do tumor foi medido com compassos de calibre, e o volume do tumor foi calculado utilizando a seguinte fórmula: Volume do tumor (mm
3) = 0,5 x comprimento x largura
2. B. A curva de sobrevivência para os animais durante o período de observação. Os dados são apresentados como a média ± DP (barras de erro). Um teste de log-rank foi usado para analisar as taxas de sobrevivência nos diversos grupos. A significância estatística: A, p 0,001, comparado com PBS; b, p 0,01, comparado com ONYX015; c, p 0,05, comparado com o Ad * (EGFP) * * CEA E1A (Δ24). C. hexon e expressão ST13
in vivo. Secções de tumor
derivados de PBS ou diferentes drogas adenovírus tratados 4 dias foram analisadas para hexon e expressão ST13 por imuno-histoquímica. 400x ampliação original.
análise de fluxo Citometria
células SW620 câncer colorretal humanos foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 5 × 10
5 por poço e foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO
2 numa incubadora humidificada. Após cultura durante a noite, as células foram tratadas com ambos os ONYX-015 ou Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) a um MOI de 5. As células foram tripsinizadas e colhidas 48 h após o tratamento. As células foram então coradas com anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC) e iodeto de propídio (PI) em um tampão de ligação, tal como descrito no anexina V-FITC protocolo do kit de detecção de apoptose (BioVision, Palo Alto, CA). Após a coloração, as células foram analisadas quanto a apoptose utilizando células activadas por fluorescência. (FACS; Becton Dickinson)
Declaração de Ética e Experimentação Animal
Homem ratinhos BALB /c nu (4-semana- idade) foram mantidas, e utilizadas em uma sala de luz e temperatura controlada em uma instalação AAALAC credenciados, e receberam água e comida de laboratório
ad libitum.
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de Shanghai Instituto de Bioquímica e Biologia celular sob o protocolo IBCB-SPF0029. camundongos xenoenxerto foram usados como um sistema modelo para estudar os efeitos citotóxicos de células SW620 (Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China)
in vivo
. células SW620 (5 × 10
6/100 mL) foram injectados subcutaneamente no flanco direito inferior de ratos nus femininos para estabelecer o modelo de xenotransplante tumoral. O volume do tumor (V), que foi baseado em medições de calibre, foi calculada utilizando a fórmula V (mm
3) = comprimento (mm) x largura (mm)
2/2. Após os tumores atingiram 100 e 130 mm
3 em tamanho, os murganhos foram divididos aleatoriamente em grupos de controlo e de tratamento (n = 8). Os grupos de tratamento foram administrados intratumoral nas doses diárias consecutivas de 5 × 10
8 unidades formadoras de placas (UFP) /100 l de ambos os ONYX-015, Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24), Ad ( ST13) · · CEA E1A (Δ24) durante quatro dias. O grupo de controlo foi tratado com injecções intratumorais consecutivos quatro vezes com o mesmo volume de PBS
secções de tumor de HCT116 CRC foram analisados para a necrose por hematoxilina-eosina (H E). Coloração, para a apoptose por TdT mediada dUTP-biotina rotulagem nick-terminal (TÚNEL), e por observações morfológicas análise por microscópio electrónico de transmissão (TEM). (B1), a apoptose em células tumorais. (B2), Para maior clareza, foi observado um único tumor para a apoptose.
imuno-histoquímica e histopatológicos Experimentos
Para a avaliação imuno-histoquímica, dois ratos por grupo foram selecionados aleatoriamente 4 dias após viral administração. Sob condições assépticas, os tecidos de tumor foram colhidos e cortados em pedaços de aproximadamente 1 milímetro cúbico de tamanho. O tecido fresco foi imediatamente imersa em 4% de paraformaldeído, em que foi mantido durante 48 horas à temperatura ambiente e, em seguida, incorporado em parafina. Depois disso, as amostras foram cortadas em secções de 4 um de espessura. A imuno-histoquímica foi realizada com um hexão ou anti-ST13 anticorpo anti-adenoviral (Biodesign International, Saco, ME) utilizando um estojo de imuno-histoquímica de acordo com o protocolo do fabricante. Além disso, as alterações patológicas no tecido do tumor foram examinadas após hematoxilina e eosina (H E). Coloração e coloração TUNEL, bem como por microscopia de transmissão eléctrico (MET)
Análise estatística
Todos dados são apresentados como a média ± SD e foram processadas utilizando o software estatístico SPSS 10.1. Cada experimento quantitativa foi realizada pelo menos três vezes, ea significância estatística foi designado para valores de P ≤0.05.
Depois de anúncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) infecção, por um lado, o fosforilada P38, ATF2 e supra-regulação de expressão foram detectados CHOP. Por outro lado, carrasco caspase-3 foi ativado.
Resultados
Construção e Caracterização de anúncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24)
o anúncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) vector foi construído com sucesso, substituindo o promotor E1A nativa com o promotor CEA específico para o cancro colorectal, a exclusão de 24 pb no anúncio · E1A (923-946 pb) e abrigando o ST13 antitumoral do gene, como mostrado na Fig. 1A. A identificação de ST13 e expressão de CEA por PCR foi mostrado na Fig. 1B. Para determinar a E1A (Δ24) e expressão ST13 dos vários vírus, a linha de células de CRC SW620 foi infectado com qualquer um anúncio · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) CEA · E1A (Δ24), ou o vírus oncolítico típico ONYX-015, a uma MOI de 5. as análises de Western blot foram usadas para detectar E1A (Δ24) e proteína ST13. Os resultados mostraram que o anúncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) vector de expressão induzida ST13 específica e a expressão de E1A maior (Δ24) (Fig. 1C) em células de CRC detectáveis.
antitumoral CRC-específica efeito do anúncio · · · CEA E1A (Δ24)
in vitro
linhas celulares de CRC CEA-positivos (SW620, HCT116 e HT29), e célula cancerosa (ST13), três CEA-negativo linhas (cancro linha de células Bcap37 mama, linha de carcinoma de células CNE Nasopharynageal e carcinoma cervical linhagem de células HeLa) e duas linhas de células normais (QSG7701 e WI38) foram infectadas com a Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · ( EGFP) · · CEA E1A (Δ24), ou ONYX-015, no MOI indicado (0,1, 1, 5, ou 10). Após 96 h, a viabilidade celular foi analisada utilizando o ensaio de MTT.
Como se mostra na Fig. 2A, o efeito oncolítico de Ad (ST13) · CEA · E1A tratamento (Δ24) demonstrou um efeito antitumoral superior do que o fez o tratamento com Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) ou ONYX-015, a uma MOI de 5 ou 10. Além disso, a inibição era dependente da dose. O Bcap37, células HeLa CNE e mostrou um nível mais baixo de inibição do que as três linhas de células de CRC, e não houve nenhuma inibição nas linhas celulares normais ou QSG7701 WI38.
Como se mostra na Fig. 2B, um curso de tempo para o tratamento com os vírus recombinantes foi também testado. As células foram infectadas com qualquer anúncio · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) ou ONYX-015 a uma MOI de 10 para diferentes comprimentos de tempo (24, 48, 72 , ou 96 h), e a viabilidade das células após a infecção foi determinada utilizando o ensaio de MTT. Os resultados indicaram que a inibição celular era dependente do tempo. O efeito anti-tumor seguindo Ad (ST13) · CEA · E1A tratamento (Δ24) foi superior ao que se segue Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) e tratamento ONYX-015 em cada uma das linhas celulares examinadas (Fig. 2B) . Após 96 h, a viabilidade de anúncio · (ST13) · · CEA células E1A (Δ24) infectados diminuiu significativamente. Mais uma vez a citotoxicidade do anúncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) em três cancros colo-rectais apresentaram maior efeito anti-tumoral do que a de cancro três CEA-negativa, enquanto nenhuma citotoxicidade em duas células normais.
Estes resultados indicou que Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) exerceu um maior efeito antitumoral específica sobre células de câncer colorretal três CEA-positivos do que a de três câncer CEA-negativo.
Para confirmar ainda mais se o efeito antitumoral de Ad (ST13) · CEA · E1A (Δ24) era específico-CEA ou específica do cólon, nós comparamos o seu efeito sobre negativo CEA linha de células de cancro do cólon linha de células de câncer não-pontos (Colo-320) e CEA-positivo (A549 , MCF-7), como mostrado na Fig. 3C. Os nossos resultados sugerem que o Ad (ST13) · · CEA E1A (Δ24) foi mais específico sobre as células cancerosas CEA-positivas.
alterações morfológicas e a apoptose induzida por tratamento vírus e alterações eytometryMorphological fluxo ensaiados nas células de tumor e normal células tratadas com vários vírus a uma MOI de 10 após 72 horas foram observados por microscopia. Como mostrado na Fig. 3A, foi observado um efeito citopático nas células do câncer colorretal CEA-positivas infectadas com Ad · (ST13) · CEA · E1A (Δ24), Ad · (EGFP) · CEA · E1A (Δ24) ou ONYX-015 em comparação com o células HeLa CEA-negativas. Os resultados indicaram que houve mais alterações morfológicas significativas no anúncio · (ST13) · · CEA células E1A (Δ24) câncer infectado do que em Ad · (EGFP) · · CEA E1A (Δ24) infectados ou ONYX-015-células infectadas , tais como encolhimento celular e o aparecimento de pequenos fragmentos celulares. Além disso, não há alterações morfológicas foram observadas na linha celular hepática normal QSG7701. Estes resultados foram confirmados pelos resultados de ensaios MTT.
Para determinar se a apoptose estava envolvido no anúncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) a morte celular induzida, a apoptose foi avaliada por meio de citometria de fluxo de ensaio. células SW620 foram infectadas quer com ONYX-015 ou Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) a um MOI de 5 durante 48 h. As células foram então sujeitas a coloração com anexina V para identificar-fase inicial da apoptose e PI coloração para identificar fase final de apoptose por análise de citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 3B, as percentagens de anúncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) células tumorais infectados em início de carreira e em estágio final apoptose foram 7,13% e 22,22%, respectivamente. As somas das percentagens de células para a apoptose precoce e fase tardia, que são mostrados na FIG. 3C, foram 29,35% para Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24), 8,85% para ONYX-015 e 3,9% para as células falsamente infectadas. Estes dados revelaram que Ad (ST13) · · CEA E1A tratamento (Δ24) poderia eficientemente induzir a morte de células cancerígenas por induzir especificamente apoptose.
A apoptose detectada pela caspase Enzyms conexos
A apoptose é comumente acompanhada de mudanças drásticas nos níveis de enzimas e proteínas relacionadas com a caspase. Pesquisas anteriores tinham mostrado que o tratamento ZD55-ST13 apoptose induzida pela via mitocondrial [18]. Assim, várias proteínas relacionadas com a apoptose de células SW620 foram analisados utilizando Western blot. Como mostrado na Fig. 4A, o nível da proteína anti-apoptótica de Bcl-XL foi diminuída, o que suporta o papel da apoptose mitocondrial. Além disso, caspase-9, caspase-3 clivada e a clivagem de PARP, foram todos significativamente aumentada em Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) células infectados. Ficou claro que Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) tratamento apoptose induzida de forma mais eficaz do que o tratamento com Ad · (EGFP) CEA · E1A (Δ24) ou ONYX-015.
O p38 via de transdução de sinal, uma via de proteína cinase activada por mitogénio (MAPK), desempenha um papel essencial na regulação de diversos processos celulares, incluindo a inflamação, a diferenciação celular, crescimento celular e morte. Além disso, a p38 também transduz sinais para outros componentes celulares para a execução de várias respostas celulares. ATF2, um substrato para a p38, pode formar heterodímeros com os membros da família Jun de factores de transcrição e desse modo pode associar directamente com o local de ligação a AP-1 [24]. CHOP, um membro da família de C /EBP de factores de transcrição, é também referido como gene danos induzível paragem de crescimento e de ADN 153 (GADD153) e está envolvido na regulação do crescimento e diferenciação celular [25]. Como mostrado na Fig. 4B, a expressão da p38 fosforilada foi significativamente aumentada após · · tratamento anúncio · (ST13) CEA E1A (Δ24). Enquanto isso, p38 activado aumentou o nível de ATF2 fosforilada ea expressão de CHOP. Estes resultados indicaram que a p38 pode estar envolvida numa via apoptótica que foi induzida pelo adenovírus abrigando ST13 oncolítico específica CRC (CTGVT-CRC). Os resultados semelhantes sobre proteínas relacionadas à apoptose foram detectados em colorectal célula cancerosa linhas HCT116 humano. (Fig. S1).
antitumoral Eficácia do anúncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) em ratinhos nus
O modelo de xenotransplante SW620 dos tumores colorretais humanos foi criada em ratinhos nus atímicos para avaliar a potencial eficácia antitumoral de Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24)
in vivo.
Como mostrado na Fig. 5A, os tumores cresceram rapidamente no grupo tratado com PBS, enquanto que vários graus de supressão do crescimento do tumor foi observada no ONYX-015-, Ad · (EGFP) · · CEA E1A (Δ24) – e Ad (ST13) · · CEA E1A (Δ24) tenha sido tratada com grupos. O volume médio do anúncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) tenha sido tratada com SW620 tumores foi de aproximadamente 170 mm
3 a 30 dias após o tratamento, o que representou um aumento de apenas 40-70 mm
3, em comparação com o volume do tumor inicial de 100-130 mm
3. O volume final do tumor do grupo tratado com PBS foi de aproximadamente 2,500 milímetros
3, o que indica que houve aproximadamente uma taxa de inibição do crescimento tumoral de 98% nestes animais, o que sugere que uma inibição quase completa foi observada nos animais tratados experimentalmente . Esta inibição potente e específico da CRC usando a estratégia CTGVT-CRC anteriormente não haviam sido notificados.
Além disso, a sobrevivência dos animais foi monitorada até 54 dias após o tratamento, e todos os ratos sobreviveu em Ad · (ST13) · CEA · grupo de E1A (Δ24). Nos demais grupos, as taxas de sobrevivência foram significativamente menores em diferentes graus, como o anúncio · (EGFP) · CEA · E1A grupo (Δ24) foi% de sobrevivência de 50, o grupo ONYX-015 foi de 37,5% de sobrevivência, eo PBS-tratada grupo tinha apenas uma taxa de sobrevivência de 12,5% (Fig. 5B). Estes resultados sugerem que a estratégia CTGVT-CRC usando Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) poderia melhorar a eficiência as taxas de sobrevivência de ratos.
Para estudar o mecanismo de anúncio · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) ação, o estudo imuno-histoquímico para a expressão hexon do adenovírus e o nível de expressão do gene ST13
in vivo
foram realizadas. Como mostrado na Fig. 5C, no Ad · (ST13) · · CEA E1A (Δ24) tenha sido tratada com grupo, o nível de proteína hexon era maior do que nos grupos tratados com o vírus do tipo selvagem, e ST13 foi semelhante altamente expresso. Como mostrado na Fig.