Abstract

expressão elevada e actividade do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) /proteína quinase B (Akt) via de sinalização está associada ao desenvolvimento, progressão e resistência ao tratamento de câncer de cabeça e pescoço (CCP). Vários estudos têm demonstrado que microARN-7 (miR-7) regula a expressão do EGFR e da actividade de AKT numa gama de tipos de células de cancro através da sua interacção específica com a região de EGFR ARNm 3 ‘não traduzida (3’-UTR). No presente estudo, descobrimos que miR-7 regulada a expressão de EGFR e da atividade de Akt em linhas celulares HNC, e que esta foi associada com crescimento reduzido

in vitro

e

in vivo

de células ( HN5) que eram sensíveis ao erlotinib inibidor de EGFR de tirosina-quinase (TKI) (Tarceva). miR-7 actuou sinergisticamente com erlotinib para inibir o crescimento de células FADU erlotinib-resistentes, um efeito associado com o aumento da inibição da actividade de Akt. análise de microarray de HN5 e celulares FaDu linhas transfectadas com miR-7 identificou um conjunto comum de miR-7 genes alvo reprimidos, fornecendo informações sobre a função supressora de tumores de miR-7. Além disso, foram identificados vários alvo miR-7 mRNAs com um suposto papel na sensibilização de células FaDu ao erlotinib. Em conjunto, estes dados suportam a regulação coordenada de sinalização de Akt por miR-7 em células de HNC e sugerem o potencial terapêutico de miR-7 sozinho ou em combinação com TKI EGFR nesta doença

citação:. Kalinowski FC, Giles KM, Candy PA, Ali A, Ganda C, Epis MR, et al. (2012) Regulamento do Fator de Crescimento Epidérmico Receptor Signaling e Erlotinib Sensibilidade na Cabeça e células cancerosas pescoço por miR-7. PLoS ONE 7 (10): e47067. doi: 10.1371 /journal.pone.0047067

editor: Hidayatullah G. Munshi, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de maio de 2012; Aceito: 07 de setembro de 2012; Publicação: 24 de outubro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Kalinowski et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde e Pesquisa médica do Conselho da Austrália e da Research Fund Medical Comercialização da Austrália. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Head and neck cancer (HNC) é o sexto tipo de câncer mais comum, com cerca de 600.000 novos casos por ano em todo o mundo [1]. Apesar dos avanços nas modalidades de tratamento, o prognóstico para muitos pacientes HNC que se apresentam com doença avançada ou metastática continua pobre [2]. O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), um membro da família ErbB receptor tirosina cinase (RTK), é sobre-expresso em mais do que 80% de todas as HNCS e é um preditor independente de mau prognóstico [3]. sinalização de EGFR activa de uma rede de vias a jusante, incluindo a fosfoinositida 3-quinase (PI3K) /Akt [4], [5] e Ras /Raf /ERK1 /2 [6], [7] vias, que promovem a proliferação de células tumorais, invasão, metástase, angiogênese e resistência à apoptose. Por conseguinte, o EGFR tem emergido como uma importante alvo terapêutico em HNC.

Cetuximab é um anticorpo monoclonal (Acm) dirigido contra o EGFR que melhorou a sobrevivência dos pacientes tratados HNC em combinação com radioterapia ou quimioterapia [8], [ ,,,0],9]. TKI de molécula pequena, tais como gefitinib e erlotinib, também foram avaliadas em CCP avançado e ter tido algum efeito anti-tumor clínica num pequeno subconjunto de pacientes [10], [11]. Os ensaios clínicos em HNC avaliando a combinação de inibidores de EGFR com outras abordagens terapêuticas também tenham sido iniciadas, bem como estudos que investigam agentes nova geração de anti-EGFR, tal como o panitumumab anti-EGFR mAb e o duplo de EGFR /HER2 TKI lapatinib [12] . A resposta clínica pobre de HNC de terapias anti-EGFR é devido à resistência intrínseca e adquirida de células HNC a estes agentes, que se pensa ocorrer por vários mecanismos, incluindo mutações dentro EGFR e seus efectores a jusante que activam a sinalização (por exemplo. A perda de PTEN, mutação PI3K ou superexpressão), a sinalização de compensação através de outros RTKs (ex. outros membros da família ErbB, um receptor do factor de crescimento semelhante à insulina (IGF1R), ou c-Met), e a transição de um epitelial para um fenótipo mesenquimal ( EMT) [12], [13], [14]. Por conseguinte, novas abordagens são necessárias para inibir eficazmente as vias de sinalização a jusante oncogénicas que são activadas de um modo independente de EGFR em HNC inibidor de EGFR-resistente.

microARNs (miARNs) são curtos, endógenos, RNAs não codificantes que ligam-se à região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) de mRNAs alvo específicas para reprimir a expressão do gene, quer através de indução ou repressão de transcrição de translação degradação [15]. miRNAs pode regular muitos genes alvos, muitas vezes de forma coordenada dentro de uma via celular ou rede [16], e por isso eles controlam diversos processos celulares, incluindo o desenvolvimento, diferenciação, apoptose e progressão do ciclo celular [17]. expressão miRNA aberrante é uma característica de muitos cânceres, incluindo HNC, e esses miRNAs pode atuar como supressores tumorais ou oncogenes [18]. Por exemplo, a expressão let-7d é reduzida em muitos HNCS, fazendo com elevada expressão de RAS, o aumento do crescimento do tumor e reduziu a sobrevivência dos pacientes [19]. Em contraste, o miR-184 expressão é regulada positivamente em carcinoma de células escamosas da língua, que conduz a um aumento da expressão de o

c-Myc

oncogene, aumento da proliferação celular e o crescimento de tumores [20]. Relatórios recentes sugerem que miRNAs podem ter utilidade como novas terapias de câncer ou biomarcadores de diagnóstico /prognóstico [18], [21], [22].

Nós e outros demonstraram que o miR-7 inibe a expressão de EGFR e Akt jusante e ERK1 /2 em actividade do pulmão, da mama, cancro da próstata e glioblastoma [23], [24], que conduz à proliferação celular e sobrevivência reduzida. A regulação da expressão de EGFR envolve a interacção directa, específica de miR-7 com dois miR-7 locais alvo dentro do ARNm EGFR 3′-UTR. Além disso, o miR-7 regula a expressão de outras moléculas a jusante de EGFR em uma forma coordenada, incluindo RAF1, IRS1, IRS2, PAK1 [23], [24], [25], suportando uma função supressora de tumores de miR-7 nestas e outros tipos de câncer. No presente estudo, investigamos a função de miR-7 na sinalização de EGFR e crescimento na HNC

in vitro

e

in vivo

, com foco em linhas de células que são sensíveis ou resistentes ao EGFR erlotinib TKI. Nossa hipótese é que miR-7 iria inibir a expressão de EGFR e sinalização a jusante, e avaliada a sinergia entre erlotinib e miR-7 em células HNC erlotinib-resistente. Finalmente, foi realizada análise de microarray de duas linhas celulares HNC para identificar novos miR-7 alvos que iria elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à sua acção supressora de tumor no HNC. Nossas descobertas têm amplas implicações para o tratamento de HNC com terapias alvo-EGFR eo uso de miR-7 como um romance anti-HNC terapêuticos.

Resultados

sensibilidade diferencial de HNC celular Lines para inibidor do EGFR erlotinib

para determinar a sensibilidade relativa de HN5, FaDu, e as células SCC-25 HNC ao erlotinib inibidor de EGFR, foram realizados ensaios de titulação de células de células tratadas com uma ampla gama de concentrações (figura 1. ). Enquanto as células eram HN5 altamente sensível ao erlotinib (CE

50 = 0,6 uM), as células FADU eram resistentes à droga (CE

50 = 8,3 uM). SCC-25 células apresentaram sensibilidade ao erlotinib intermediário (CE

50 = 3,8 uM) HN5 células foram relatados para sobre-expressar EGFR através de uma amplificação de genes [26], e ser altamente sensíveis à inibição de EGFR

In vitro

e

in vivo

[27]. FaDu e as células SCC-25 exibem expressão de EGFR moderada e têm sido mostrados para exibir resistência ao inibidor de EGFR gefitinib [28]. Os nossos resultados são consistentes com estes relatórios, pelo qual as células são FaDu ~ 10 vezes mais resistente a erlotinib do que as células HN5. Tomadas em conjunto, as células HN5 são representativas de HNC sensível ao inibidor de EGFR, células FADU representam HNC que é resistente a inibição do EGFR, e SCC-25 representam células HNC com resistência EGFR-inibidor intermediário. Assim, podemos investigar a atividade supressora de tumor de miR-7 em cada uma dessas configurações.

HN5 (vermelho), FaDu (azul) e SCC-25 células (verde) foram semeadas em placas de 96 poços e tratado com o inibidor de EGFR erlotinib (concentração final de 0-100 uM). A metade da concentração máxima eficaz (CE

50) de erlotinib foi determinada para cada linha de células após a medição do número relativo de células viáveis ​​por um ensaio celular título 3 d depois da adição de erlotinib. Os dados estão normalizados para a concentração mais baixa de erlotinib. As barras de erro representam os desvios padrão. Os dados são representativos de três experiências independentes.

miR-7 regula a expressão de EGFR e Akt Atividade em linhas celulares HNC

Anteriormente, nós e outros identificaram o mRNA EGFR 3′-UTR como um alvo específico do miR-7 em várias linhas de células de cancro diferentes, e demonstraram que o miR-7 é um potente inibidor de sinalização de EGFR e a viabilidade das células [23], [24]. Curiosamente, o miR-7 atenuada de sinalização de EGFR em U87MG inibidor de EGFR-resistente (glioblastoma) e as células A549 (cancro do pulmão de células não-pequenas) [23], [24]. Dado o importante papel do EGFR sinalização em HNC a tumorigénese e tratamento, foi investigada a capacidade de miR-7 para inibir a expressão do EGFR e a sinalização a jusante em linhas celulares de HNC. Nós transfectadas HN5, FaDu e linhas de células SCC-25 com miR-7 ou um controlo negativo miARN, miR-NC, e realizada transferência Western para determinar o impacto de miR-7 na expressão do EGFR e a actividade de Akt. miR-7 inibiu a expressão do EGFR e actividade (P-EGFR), bem como a actividade de Akt (P-Akt), um efector a jusante de EGFR chave (Fig. 2A). A redução da actividade de Akt causada por miR-7 foi associado com um aumento nos níveis relativos de Akt total (Fig. 2A), um efeito que possivelmente reflecte um mecanismo de feedback controlar a expressão de Akt em células de cancro da cabeça e do pescoço. Não foi observada inibição da sinalização de ERK1 /2 em cabeça e pescoço linhas celulares de cancro de miR-7 (dados não mostrados). , Um resultado consistente com os nossos estudos anteriores com miR; análise transcriptase reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR) de células HNC transfectadas com miR-7 demonstraram uma redução na expressão de mRNA EGFR (. Células FaDu, dados não mostrados células HN5, Fig 2B) reversa -7 em células cancerosas glioblastoma, do pulmão, da mama e da próstata [24]. A redução em ARNm de EGFR por miR-7 é também apoiada por um relatório recente sugere que a maioria dos miARNs reprimir a expressão do gene através da promoção de ARNm de decaimento [29]. Finalmente, confirmou-se a inibição direta da expressão do EGFR por miR-7 através de sua ação sobre o EGFR 3′-UTR utilizando ensaios de gene repórter em células HNC. A co-transfecção de células de HNC com miR-7 e um constructo de luciferase de pirilampo repórter contendo o comprimento total de EGFR ARNm 3′-UTR produziram significativamente mais baixa do que a actividade repórter com miR-NC (células FADU, Fig 2C;. Células HN5, dados não mostrados ), confirmando que o miR-7 interage com o EGFR específica locais alvo 3′-UTR [24] em células de HNC. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o miR-7 ARNm inibe a expressão do EGFR e de proteínas e de sinalização a jusante, pelo menos, em parte através da segmentação directa do ARNm EGFR 3′-UTR.

(A) análise de transferência de Western de EGFR, P-EGFR, Akt e níveis P-Akt em HN5 (painel esquerdo) e FaDu (painel central) e SCC-25 (painel direito) células 3 d após a transfecção com miR-7 ou miR-NC moléculas precursoras ou veículo (LF2000) só. β-actina é incluída como um controlo de carga. (B) Análise de RT-qPCR da expressão de ARNm de EGFR em células HN5 24 h após a transfecção com moléculas precursoras miR-7 ou NC-miR. Os dados foram normalizados para a expressão de ARNm de GAPDH e expressas em relação a células de miR-NC-transfectadas. (C) Ensaio de repórter de luciferase com células FADU co-transfectadas com miR-7 ou NC-miR moléculas precursoras, uma EGFR de comprimento completo ARNm 3′-UTR plasmídeo repórter de luciferase de pirilampo, e um

Renilla

plasmídeo repórter de luciferase . a actividade da luciferase de pirilampo foi avaliada 24 horas pós-transfecção, normalizada para

Renilla luciferase,

medições e os dados foram expressos em relação ao veículo (LF2000) apenas as células transfectadas. As barras de erro representam os desvios padrão. Todos os dados são representativos de três experiências independentes. *, P . 0.001, miR-7 vs miR-NC

miR-7 inibe o crescimento de Erlotinib-sensíveis células HN5

in vitro

e

In vivo

células HN5 HNC são altamente sensíveis ao erlotinib e, portanto, representam um excelente modelo para avaliar o significado funcional de inibição de EGFR por miR-7

in vitro

e

in vivo

. Investigou-se o efeito de miR-7 em células sensíveis HN5-erlotinib, medindo a viabilidade das células com ensaios de titulação de células 5 d após a transfecção transiente de miR-7. Em comparação com veículo (LF2000) e miR-NC, miR-7 reduziu significativamente o crescimento de células HN5 (Fig. 3A e Fig. 3B).

(A) ensaio de titulação celular colorimétrico de células HN5 5 d, após a transfecção in placas de 96 poços com miR-7 ou moléculas precursoras miR-NC, ou veículo (LF2000) somente. (B) Representação gráfica de ensaio de titulação da célula de (A). Os dados representam o número relativo de células viáveis ​​HN5 normalizados para células tratadas HN5-LF2000. Análise (C) TaqMan RT-qPCR de miR-7 expressão em clones HN5 com expressão estável do miR-7 (clone 39) ou o miR-NC (clone 2). Os dados foram normalizados para U44 snRNA expressão e expressos em relação ao HN5 miR-NC clone 2. (D) Análise de transferência de Western dos níveis de EGFR, Akt e P-Akt em clones HN5 com uma expressão estável de miR-7 (clone 39) ou miR- NC (clone 2). β-actina é incluída como um controlo de carga. (E) contagem manual de células de células HN5 com expressão estável do miR-7 (clone 39) ou o miR-NC (clone 2). Os dados são expressos em relação ao miR-NC. ensaio (F) clonogenicidade de células HN5 com expressão estável do miR-7 (clone 39) ou o miR-NC (clone 2) 10 d após as células foram semeadas em placas de 10 cm. As barras de erro representam os desvios padrão. Todos os dados são representativos de três experiências independentes. *, P 0,01, miR-7 vs miR-NC; ** P 0,005, miR-7 vs miR-NC

Para avaliar o efeito de miR-7 no crescimento do tumor HN5

in vivo

, usamos a entrega lentiviral para. gerar células HN5 com superexpressão estável do miR-7 ou NC-miR. Usando TaqMan miARN RT-qPCR observou-se ~ 80 vezes supra-regulação de miR-7 em células HN5 com expressão estável de miR-7 (HN5 estável clone 39), em comparação com células com expressão HN5 miR-NC estável (HN5 clone estável 2) (fig . 3C). Análise da expressão do EGFR e de sinalização por transferência de Western revelou uma redução modesta (-15%;

ver Métodos 2.7

) nos níveis de proteína de EGFR em HNC com miR-7 expressão estável (Fig 3D.), Mas uma maior ( redução de ~ 25%) dos níveis de Akt fosforilada na serina-473 (P-Akt). Foram triados múltiplos HN5 /miR-7 clones e observado o miR-7 superexpressão e níveis semelhantes de EGFR e P-Akt em cada um dos clones (Fig. S1). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a diminuição da actividade de Akt mediada por miR-7 não é apenas devido à inibição da expressão do EGFR e em vez disso é provável que resulte de uma coordenada redução na expressão e actividade de múltiplas moléculas responsáveis ​​pela actividade de Akt.

Para determinar se estável expressão de miR-7 inibe o crescimento HN5

in vitro

, foi realizada a contagem manual de células de miR-NC HN5 clone estável 2 células e miR-7 HN5 clone estável 39 células. Estas experiências revelaram uma redução significativa na proliferação de células-7 miR HN5 estáveis ​​em comparação com as células estáveis ​​HN5 miR-NC (Fig. 3E). Para confirmar esse achado, foi avaliada a clonogenicidade das nossas linhas celulares estáveis ​​HN5. A expressão estável de miR-7 reduziu significativamente o número e tamanho das colónias formadas após 10 d em comparação com células com HN5 expressão estável de miR-NC (Fig. 3F). Juntos, estes resultados são consistentes com aqueles que foram obtidos com transiente miR-7 transfecção e indicam que o aumento para o dobro em -80 miR-7 expressão em HN5 miR-7 clone estável 39 leva à diminuição da actividade de Akt e reduz significativamente o

In vitro

crescimento de células HNC HN5.

a seguir, procurou investigar o impacto da expressão estável miR-7 no

in vivo

crescimento de xenoenxertos tumorais HN5 em ratinhos nus. Após a injecção subcutânea de miR-7 HN5 clone estável 39 ou miR-NC HN5 clone estável células 2 no flanco de ratos nus femininos, os volumes dos tumores foram monitorizados durante um período de 29 dias. Uma redução significativa no crescimento do tumor foi observada por HN5 xenoenxertos com estável miR-7 em comparação com a expressão de miR-NC xenoenxertos HN5 estáveis ​​(Fig. 4A e Fig. 4B). Utilizou-se análise TaqMan miRNA qRT-PCR de miR-7 níveis para confirmar que o miR-7 superexpressão persistiu nos HN5 /miR-7 xenotransplantes para a duração do nosso estudo (Fig. 4C), e também observaram uma redução no P- níveis de Akt no clone HN5 /miR-7 39 xenoenxertos em comparação com o clone HN5 /miR-NC 2 xenoenxertos por western blotting (Fig. 4D e a Fig. 4E). Esta é a primeira demonstração de que o miR-7 pode reduzir o crescimento do tumor HNC

in vivo

, e é consistente com outros estudos recentes que demonstram que o miR-7 reduz o crescimento do câncer de fígado, câncer de pulmão e xenotransplantes schwannoma em ratos [ ,,,0],30], [31], [32]. Para confirmar a nossa descoberta e para excluir a possibilidade de um efeito clonal, realizou-se um ensaio de formação de tumores em que as células HN5 foram transientemente transfectadas em cultura com miR-7 ou miR-NC, e após 24 h injectados por via subcutânea no flanco de nu fêmea formação do tumor e ratinhos avaliada. Análise dos volumes do tumor em 10 d revelou uma inibição significativa da formação de tumor em ratinhos injectados com células HN5 transientemente transfectadas com miR-7 (HN5 /miR-7), em comparação com ratinhos injectados com células HN5 ou miR-NC-transfectadas tratados com veículo (HN5 /miR-NC) (Fig. S2). Estes dados suportam a nossa observação de que estável expressão de miR-7 inibe o crescimento de xenoenxertos de tumor HN5 (Fig. 4A e Fig. 4B) e a hipótese de que o miR-7 é um potente inibidor de sinalização de EGFR, a actividade de Akt, e tumorigenicidade em HNC.

(A) o crescimento de xenotransplante tumoral HN5 após a injecção subcutânea de estável HN5 miR-NC clone 2 (vermelho) ou miR-7 clone 39 (azul) células em camundongos nus. O volume médio do tumor (mm

3) é representada graficamente ao longo do tempo (d). (B) fotografias representativas de xenotransplantes tumorais para células com expressão estável miR-NC (clone 2, à esquerda) e estável expressão de miR-7 (clone 39, à direita). (C) Análise TaqMan RT-qPCR de miR-7 expressão em HN5 /miR-7 e HN5 /miR-NC xenotransplantes tumorais estável no ponto final experimental. Os dados foram normalizados para U44 snRNA expressão e os níveis de miR-7 são apresentadas em relação ao HN5 /miR-NC clone 2 tumores. (D) Análise de Western blot dos níveis de Akt e P-Akt entre HN5 /miR-7 e HN5 /miR-NC xenotransplantes tumorais estável. β-actina e Akt estão incluídas como controlos de carga. (E) análise de densitometria dos níveis de P-Akt entre HN5 /miR-7 (clone 39) e HN5 /miR-NC (clone 2) xenoenxertos de tumor por transferência de Western. níveis de P-Akt foram normalizadas para expressão Akt total. As barras de erro representam os desvios padrão. *, P 8,0 × 10

-5, miR-7 vs miR-NC; ** P 1,0 × 10

-8, miR-7 vs miR-NC; ***, P = 0,06, miR-7 vs miR-NC.

Syngergistic Ação de miR-7 e Erlotinib em FaDu e SCC-25 células HNC

in vitro

como miR-7 pode inibir a expressão de EGFR, bem como a atividade da Akt, a hipótese de que poderia aumentar a eficácia da terapêutica anti-EGFR com células HNC; isto é, a combinação de miR-7 e erlotinib pode sinergicamente inibir o crescimento de células de HNC. Para investigar isto, utilizou-se células FADU que são resistentes ao erlotinib (CE

50 = 8,3 uM; ~ 10 vezes mais elevada do que as células HN5). células FADU foram transientemente transfectadas com apenas o miR-7, miR-NC, ou veículo, e tratou-se em 3 d após a transfecção com um sub-CE

50 e clinicamente relevante [33] da dose (7,5 uM) de erlotinib ( ou veículo). Após mais 4 d, a viabilidade celular foi avaliada por ensaio de titulação da célula (Fig. 5A). miR-7 sozinho (sem erlotinib) e erlotinib sozinho (veículo só; LF2000) cada produziu uma pequena inibição ainda estatisticamente significativa do crescimento celular FaDu. No entanto, a combinação de miR-7 e erlotinib produziu uma redução ainda maior do crescimento celular, um efeito que foi determinada pelo modelo aditividade Bliss [34] para ser sinérgica, em que E

Bliss = E

miR-7 + e

erlotinib-e

miR-7 × e

erlotinib = 0,15 + ,18-,15 × 0,18 = 0,30, e a inibição fraccionada observado experimentalmente (e

observado) com miR-7 mais erlotinib foi de 0,61. Observamos também a sinergia entre miR-7 e erlotinib em SCC-25 células HNC (Fig. S3), onde E

Bliss = E

miR-7 + E

erlotinib-E

miR-7 x e

erlotinib = 0,61 + 0,35-0,6 x 0,35 = 0,75, e a inibição fraccionada observado experimentalmente (e

observada) com miR-7 mais erlotinib foi de 0,84.

(a) titre celular a análise das células FADU que foram transfectadas apenas com veículo (LF2000), miR-7, ou de miR-NC por 3 d, e, em seguida, tratada com erlotinib (7,5 uM) ou veículo (DMSO) durante mais 4 d. Os dados são expressos em relação ao veículo-transfectadas, células FADU tratados com veículo (LF2000 menos erlotinib, na primeira coluna). (B) Análise de transferência de Western de EGFR, P-EGFR, Akt e os níveis de P-Akt em células FADU que foram transfectadas apenas com veículo (LF2000), ou o miR-7 ou miR-NC durante 3 d e depois tratou-se ± erlotinib (7,5 ^ M) durante 24 h. β-actina é incluída como um controlo de carga. (C) análise de densitometria dos níveis de P-Akt de western blotting entre as células transfectadas com FADU miR-NC ou o miR-7 e, em seguida, tratados com erlotinib (7,5 uM) durante 24 h. Os dados são mostrados em relação a células de miR-NC-transfectadas. As barras de erro representam os desvios padrão. Todos os dados são representativos de três experiências independentes. *, P 0,05, miR-7 menos erlotinib vs miR-NC menos erlotinib, e LF2000 mais erlotinib vs LF2000 menos erlotinib; **, P 0,01, miR-7 mais erlotinib vs miR-NC mais erlotinib. † indica sinergia entre o miR-7 e erlotinib, tal como definido pelo modelo Bliss aditividade [34].

Em estudos paralelos, utilizou-se transferência Western para avaliar o impacto de miR-7, erlotinib, eo combinação de miR-7 e erlotinib na expressão de EGFR /actividade e a actividade de Akt em células FADU (Fig. 5B). Observou-se a inibição da fosforilação do EGFR (EGFR-P) com ambos erlotinib e miR-7, enquanto que o miR-7 também reduziu a expressão do EGFR basal. Importante, a combinação de miR-7 e erlotinib produziu uma maior redução da expressão da P-EGFR do que foi observada com quer erlotinib ou miR-7 sozinho, e densitometria confirmou que os níveis de P-Akt foram mais baixas com a combinação de miR-7 e erlotinib do que com miR-NC e erlotinib (

consulte Métodos de 2,7

, Fig. 5C). Tomados em conjunto, estes dados indicam que a combinação de miR-7 e erlotinib funciona sinergisticamente em células de HNC, para inibir simultaneamente a expressão do EGFR e actividade, a actividade de Akt, e o crescimento celular.

Microarray Analysis de miR-7-regulada os genes em células e HN5 FaDu HNC

Para obter mais conhecimentos sobre o mecanismo de acção de miR-7 em ambos HN5 e células FADU, foram realizadas análises de microarray em paralelo de ARN total isolado a partir de células e HN5 FADU que eram transfectadas com miR-7 ou miR-NC. Nós eleito para a colheita de ARN para a análise de micro-arranjo às 24 h pós-transfecção com miARN, para maximizar a sensibilidade e especificidade, com base na nossa experiência anterior com miR-7 transfecção de células A549 [24] e um relatório sugerindo que a regulação negativa de miR-124 indirecta -alvo mRNAs em células de câncer de fígado HepG2 início às ~32 h após transfecção [35]. Após a normalização dos dados, concluiu que diretos miR-7 genes alvo em HN5 e células FaDu seria significativamente subregulado seguinte miR-7 transfecção. Nós refinado estas listas de genes através da atribuição de um corte para a regulação baixa de pelo menos -1,5 vezes e com uma significância de p 0,05 (Fig. 6A), e realizada análise de agrupamento dos genes resultantes que foram significativamente reprimidos por miR-7 em relação ao miR-NC ou HN5 em células FADU (Fig. 6B). Isto revelou sobreposição nos genes regulados negativamente por miR-7 entre as duas linhas celulares. Cento e setenta e nove mRNAs foram significativamente regulada negativamente por miR-7 em células HN5 (Tabela S1), 357 mRNAs foram significativamente regulada negativamente em células FADU por miR-7 (Tabela S2), e 103 mRNAs foram geralmente regulada negativamente em ambas as células FADU HN5 e (Tabela S3). Um diagrama de Venn consistindo dos miR-7 genes regulados negativamente para cada linha celular (Fig. 6C), salienta a intersecção de miR-7 mRNAs downregulated entre HN5 e células FADU, o que representa uma assinatura de destino miR-7 em células de HNC. análise de gráfico de dispersão indicaram uma forte correlação (r

2 = 0,435, P 0,001) entre a dobra-diminuição na expressão dos 103 genes em resposta a miR-7 entre HN5 e células FADU (Figura 6D.). Nós também utilizamos a análise de RT-qPCR para confirmar a regulação negativa da RAF1 e fator transformador de crescimento alfa (TGFA) mRNA por miR-7 no nosso microarray análises, tanto de células FaDu (Fig. S4) HN5 e. Estas observações sugerem que o miR-7 tem a capacidade para direccionar o EGFR, suas vias a jusante e também um ligando de EGFR, tais como TGFA.

(A) parcelas vulcão que representam as sondas de matriz entre HN5 (esquerda) e FaDu (direita ), as células 24 horas após a transfecção com moléculas precursoras miR-7 ou miR-NC. Atribuindo um limite de ± mudança de 1,5 vezes (miR-7 vs miR-NC) e p 0,05, sondas significativamente reprimidos estão em sondas verdes e significativamente upregulated estão em vermelho. (B) A análise de agrupamento de genes de miR-7-reprimidos em HN5 e células FaDu, onde sombreamento verde e vermelho corresponde a genes reprimidos e regulados positivamente, respectivamente. (C) diagrama de Venn de genes miR-7-reprimidos em HN5 e células FaDu. (D) Gráfico de dispersão dos genes comuns a células FaDu HN5 e miR-7-subregulado (R

2 = 0,435, p 0,001).

Para validar nossa abordagem de combinar a miR- 7 conjuntos de genes regulados negativamente para HN5 e células FaDu para identificar mRNAs alvo comuns, usamos Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para avaliar a proporção de genes que foram significativamente reprimidos por miR-7 e estavam moderada ou alta confiança previsto, ou comprovada, miR metas -7. IPA identificou 91/179 (54%) subregulado HN5 mRNAs como estando previsto ou comprovada miR-7 metas, 113/357 (32%) subregulado FaDu mRNAs como estando previsto ou comprovada miR-7 metas, e 57/103 (55%) mRNAs comuns a ambas as células HN5 e FaDu reprimidos como sendo supostos ou reais miR-7 metas, enfatizando o enriquecimento do gene subregulado miR-7 combinada estabelecida com putativos ou validadas miR-7 mRNAs alvo e sugerindo que ele representa um alvo miR-7 assinatura em células HNC.

para identificar o significado funcional do gene alvo miR-7 set comum a HN5 e células FaDu, usamos IPA para atribuir funções aos 103 genes que foram reprimidos por miR-7 em ambos linhas de celular. Um subconjunto de 103 genes – dos quais mais de metade foram preditos ou validados miR-7 metas – foi associada com as funções que representam uma ampla gama de processos envolvidos no crescimento e progressão tumoral, incluindo a “proliferação celular”, “o desenvolvimento de células”, “tumorigénese”, “síntese de proteínas”, “angiogénese”, “morte celular”, “ciclo celular”, e “o movimento celular” (Fig. 7). Esta descoberta destaca a capacidade de miR-7 a coordenadamente regular vários processos oncogénicas em células cancerosas.

genes comuns a ambas as células FADU HN5 e (103) de miR-7-regulada negativamente foram designados para cancro associada anotada processos utilizando software IPA. Estes incluíram “ciclo celular”, “movimento celular”, “proliferação celular”, “desenvolvimento de células”, “tumorigênese”, “síntese de proteínas”, “angiogénese” e “morte celular”. símbolos oficiais de genes são usados ​​para cada gene miR-7-reprimidos e um círculo azul indica que um gene é um previsto ou validado alvo de miR-7 por análise IPA.

Para obter mais conhecimentos sobre o função de miR-7 como regulador de sinalização de EGFR e a actividade de Akt – com a capacidade de sensibilizar as células HNC ao erlotinib – foi utilizado IPA para atribuir ao grupo de genes regulados negativamente por miR-7 em células HN5 e células FADU ao “PI3K canónica /Akt sinalização “via (Fig. 8). Enquanto PIK3CD, PAK1, IKK e NF-kB foram reprimidos por células miR-7 em HN5 mas não FADU, a maioria de miR-7 genes regulados negativamente associados com a via PI3K /Akt foram reduzidos em ambas as células FADU HN5 e, o que sugere que eles representam um miR-7 assinatura-alvo definitivo associada com PI3K /Akt de sinalização a jusante de EGFR. Nós supomos que a sinergia entre o miR-7 e erlotinib é, pelo menos, em parte devido a uma regulação negativa miR-7-mediada de múltiplas moléculas associadas com a actividade de Akt em células de HNC.

Representação esquemática das moléculas no EGFR /via de sinalização de Akt que são inibidas por miR-7 em HNC. software IPA foi usado para mapear genes de miR-7-subregulado comuns (mostrados em verde) em células FaDu e HN5 para o PI3K canônica /Akt. A densidade do sombreado representa o downregulation dobrável alteração de um gene de miR-7. círculos azuis indicam que um gene é um alvo do previsto ou validado de miR-7 por análise de IPA. Vários genes pertencentes à via PI3K /Akt, que foram reprimidos por miR-7 em células HN5 só são sombreadas em azul claro.

Discussão

No presente estudo, demonstramos que miR-7 regula a expressão de EGFR e sinalização a jusante em HN5 e celulares FaDu HNC linhas que têm sensibilidade diferencial ao erlotinib EGFR TKI. Descobrimos que miR-7 inibe o crescimento de células HN5 sensível ao erlotinib

in vitro

e

in vivo

, e que miR-7 pode sensibilizar células FaDu erlotinib-resistente a erlotinib. Microarray Analysis HN5 de miR-7-transfectadas e células FADU identificada uma assinatura gene alvo comum para o miR-7, fornecendo informações sobre a sua actividade supressora de tumores, no contexto de várias funções associadas a cancro, tais como a proliferação das células e o movimento celular. Finalmente, a análise dos nossos dados de microarray sugeriu que o miR-7 sensibiliza células HNC resistentes EGFR-inibidor para erlotinib, regulando coordenadamente expressão de várias moléculas associadas com a actividade de Akt, um efector a jusante crítica de EGFR e um alvo terapêutico emergente no cancro.

a principal conclusão do estudo é que o miR-7 tem a capacidade de sensibilizar as células HNC erlotinib resistente ao erlotinib, com a combinação de erlotinib e miR-7 exibindo uma redução sinérgica na proliferação celular em comparação com erlotinib ou miR- 7 sozinho. Esta observação é importante, dado que a resistência de HNC com inibidores de EGFR é comum e um problema clínico importante [12]. Nossos dados também construir em um relatório recente da Rai e colegas de trabalho em que a entrega de miR-7 para EGFR células de câncer de pulmão inibidor resistente suprimiu o crescimento

in vitro

e

in vivo

, um As barras de erro representam os desvios padrão. As barras de erro representam os desvios padrão. As barras de erro representam os desvios padrão.