Abstract

Fundo

Ezrin é um membro da Ezrin, radixina, e da família moesin que fornece uma ligação funcional entre a membrana plasmática eo citoesqueleto de actina cortical. A correlação entre a superexpressão Ezrin e do comportamento agressivo câncer foi relatado recentemente em vários tipos de tumor. No entanto, seus papéis nos mecanismos subjacentes a progressão do carcinoma de células escamosas de língua (SCC) não são claras.

Método

Nós usamos SCC língua humana e microarrays de tecido não cancerosas para analisar imunohistoquímica o nível de expressão Ezrin e sua relação com a atividade proliferativa. A linha de células SCC língua humana HSC-3 foi usado para determinar os efeitos de interferência de ARN ezrina (RNAi) em células cancerosas durante MTT; ferida ensaios de cura e de invasão; imunofluorescência do citoesqueleto de actina; e western blot da caderina-E, N-caderina, β-catenina, eo ativo total e RhoA /Rac1 /Cdc42.

Resultados

Ezrin foi sobre-expresso em 46,4% dos tumores analisados em microarrays de tecido língua SCC humanos. Ezrin expressão foi correlacionada com o índice Ki-67. depleção Ezrin por RNAi nas células HSC-3 reduziu significativamente a proliferação celular, a migração, capacidade de invasão e perturbado e reorganização de actina durante a formação PODIA. Seus efeitos sobre RhoA /Rac1 expressão /Cdc42 não foram significativos, considerando que reforçada E-caderina e β-catenina expressão e diminuição da expressão N-caderina.

Conclusões

Ezrin é muitas vezes sobre-expressos em primária CCEs língua e pode ter um papel importante no seu crescimento, a migração, capacidade de invasão e possivelmente através da sua relação com o complexo caderina-e /β-catenina e o interruptor de caderina. Assim, Ezrin poderia ser um alvo terapêutico em SCC língua

Citation:. Saito S, Yamamoto H, Mukaisho K-i, Sato S, Higo T, Hattori T, et al. (2013) mecanismos subjacentes Cancer Progressão Causados ​​por Ezrin superexpressão em Tongue Carcinoma de células escamosas. PLoS ONE 8 (1): e54881. doi: 10.1371 /journal.pone.0054881

editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de setembro de 2012; Aceite: 17 de dezembro de 2012; Publicação: 24 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Saito et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma de cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) é atualmente o sétimo tipo de câncer mais comum, com 260.000 novos casos diagnosticados a cada ano e cerca de 128.000 mortes anuais em todo o mundo [1], [2]. A língua é um dos locais mais comuns de origem dos HNSCC no Japão [3]. Neck metástase ganglionar é um dos determinantes mais críticos de sobrevivência e fornece um bom guia para estratégias de tratamento [4] – [8]. No entanto, a qualidade de vida ea taxa de sobrevivência de cinco anos são baixos em cancros avançados da língua mesmo com a terapia multimodal atual e excisão cirúrgica acompanhada de quimioterapia e radioterapia. Para melhorar os resultados dos cancros avançados da língua, precisamos desenvolver novas terapias direcionadas com base em uma compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao comportamento agressivo de câncer de língua.

Ezrin foi inicialmente isolado como um componente do citoesqueleto das microvilosidades intestinais, e que é conhecido por ser um substrato de tirosina-quinase [9]. Ezrin é um membro da família ezrina, radixina, moesina e proteína que liga a actina F à célula proteínas da membrana após fosforilação [10] – [13]. Esta função ligante sugere que a ezrina é essencial para muitos processos celulares fundamentais, incluindo a determinação da forma da célula, polaridade, estrutura superficial, adesão celular, motilidade, a citocinese, a fagocitose, e a integração de transporte da membrana através de vias de sinalização [14] – [17] . espera-se que estes aspectos funcionais da ezrina para promover a progressão do tumor. Com efeito, estudos recentes revelaram que a ezrina pode ter um importante papel na tumorigénese, desenvolvimento, invasão e metástase, provavelmente através da regulação das moléculas de adesão, participação em transdução de sinal celular, e a sinalização a outros canais da membrana celular no tumor [18] – [22]. Ezrin é um fator indispensável para a metástase das células tumorais em osteossarcomas [23], o cancro da mama [24], carcinoma de nasofaringe [25], e cancro da próstata [26]. Ezrin expressão também tem sido associada à sobrevivência pobre em vários cancros, incluindo carcinomas da mama [21], [27], do endométrio [28], e dos ovários [29]; cutâneas e uveal melanomas [30]; e sarcomas dos tecidos moles [31], [32]. No entanto, seus papéis em câncer bucal não são claras. Este estudo teve como objetivo esclarecer os papéis de Ezrin na progressão CCE de língua com interferência de RNA Ezrin (RNAi) em uma linha de células derivadas de SCC língua. Utilizou-se CCEs primários de língua para determinar a frequência da superexpressão da ezrina e as correlações de expressão ezrina com o índice Ki-67 e o índice apoptótico, que reflectem as contribuições de proliferação de células e perda de células, respectivamente, para o crescimento do tumor e agressividade. Nossos resultados sugerem que Ezrin pode ser adequado para a terapia de gene alvo de CCEs de língua.

Materiais e Métodos

coloração imuno-histoquímica de Ezrin e exame histológico

O tecido normal e tumor da língua microarrays de seres humanos usados ​​neste estudo foram obtidos a partir de US Biomax Company (MD, EUA). Das 79 amostras, 10 eram tecidos normais língua e 69 foram tecidos CCE de língua. US Biomax Companhia obteve os recursos de tecidos de bancos de tecidos que garantiram que todas as coleções de tecidos humanos foram realizados em hospitais certificados de acordo com os mais altos padrões éticos. Todos os tecidos humanos também foram coletadas de acordo com protocolos que cumpriram com o Health Insurance Portability e Accountability Act (HIPAA). Eles certificou que todos os bancos de tecidos que forneceram recursos de tecidos humanos cumpridas as seguintes exigências do Acordo de Transferência de Material humano: a identidade do doador foi anónimos e todos os tecidos e os dados foram rotulados com um código de identificação para proteger a identidade dos doadores de tecidos. O consentimento informado foi mantido em bancos de tecidos e não fornecido para US Biomax Company, protegendo assim a privacidade do doador

coloração imuno-histoquímica dos microarrays de tecido língua SCC humanos foi realizada utilizando um anticorpo de coelho anti-Ezrin (# 3145;. Cell sinalização, MA, EUA) e um monoclonal de ratinho anti-Ki-67 anticorpo (clone: ​​MIB-1; Dako, Glostrup, Dinamarca). A coloração foi realizada utilizando uma Descoberta XT automatizada IHC Stainer com um Kit de Detecção DABMap Ventana (No. 760-124; Ventana Medical System, AZ, EUA). Cada etapa do processo Ventana DABMap Kit de Detecção foi otimizado no instrumento Descoberta XT, sendo as condições predefinidas. recuperação antigênica das secções de tecido foi realizada por meio de calor

A intensidade da coloração de tecido língua SCC humana foi classificada como se segue:. 0, negativa; 1+, fraco; 2+, moderada; e 3+, intenso. Esta classificação utilizados os seguintes critérios: 1+ indicava uma intensidade semelhante ao encontrado no tecido normal de língua; 3+ indicado coloração intensa de membrana e citoplasma; 2+ indicava uma intensidade entre 1+ e 3+. Nós dicotomizadas as categorias durante a análise estatística. Assim, uma intensidade de coloração fraca a moderada indicou baixa expressão Ezrin, ao passo que uma intensidade de coloração intensa indicaram alta expressão Ezrin.

Ki-67 é normalmente expressa no núcleo da célula. O índice Ki-67 (isto é, o número de células tumorais Ki-67-positivos dividido pelo número total de células de tumor × 100%) foi determinada por contagem do número de células tumorais em três campos de alta potência seleccionados aleatoriamente (× 400 ).

O índice apoptótico foi medida utilizando um in situ apoptose Detection Kit (Takara Bio, Otsu, Japão). Os procedimentos de coloração seguiram as instruções do fabricante. Após desparafinização rotina, o tecido foi digerido com proteinaseK (20 ug /ml em PBS) durante 15 min à temperatura ambiente e lavadas com PBS. As lâminas foram então incubadas em peróxido de hidrogénio a 3% durante 5 min e lavadas com PBS. TdT enzima e substrato foi pipetada para as secções, que foram então incubadas a 37 ° C durante 90 min. Após a lavagem, anti-FITC conjugado com HRP foi adicionada às lâminas durante 30 min. As lâminas foram lavadas, coradas com diaminobenzine (Nichirei, Tóquio, Japão), e contrastadas com hematoxilina. O índice apoptótico (o número de células tumorais positivas dividido pelo número total de células tumorais × 100%) foi determinada por contagem do número de células tumorais em três campos de alta potência seleccionados aleatoriamente (400x). As correlações entre a expressão Ezrin, Ki-67, eo índice de apoptose também foram avaliadas em tecidos língua SCC humanos.

cultura celular

A linha de células SCC língua HSC-3 foi comprado do JCRB Cell Bank e mantidas em meio modificado de Dulbecco de Eagle (DMEM; Nacalai Tesque, Quioto, Japão) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de solução de antibiótico-antimicótico (Invitrogen, CA, EUA) a 37 ° C numa atmosfera humidificada suplementado com 5% de CO

2.

pequeno RNA de interferência (siRNA)

Ezrin siRNA (5′-GAUUUCCUACCUGGCUGAAGCUGGA-3 ‘) e controle nonsilencing (NSC) siRNA foram adquiridos da Invitrogen . As células foram transfectadas utilizando o reagente Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Os Ezrin siRNA-transfectadas HSC-3 células (Ezrin-siRNA) e NSC-transfectadas 3-HSC células (NSC) foram utilizados em todos os

in vitro

experimentos.

transcrição reversa quantitativa reacção em cadeia -polimerase (qRT-PCR)

no qRT-PCR, o ARN total foi isolado a partir de linhas de células utilizando RNeasy (Qiagen, Tóquio, Japão) e o ADNc foi sintetizado a partir de 2 ug de ARN total. O ADNc foi submetido a PCR (LightCycler480, Roche, Tóquio, Japão), utilizando os iniciadores e SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio). Todos os iniciadores de PCR foram adquiridos a partir de Takara Bio e as suas sequências são mostradas na Tabela 1. A PCR foi realizada utilizando as seguintes condições: desnaturação a 95 ° C durante 30 s, seguido por 40 ciclos de PCR a 95 ° C durante 5 s, hibridação a 60 ° C durante 20 s, e alongamento a 72 ° C durante 10 s. Os níveis de expressão de ARNm foram normalizados contra os níveis do gene padrão interno desidrogenase gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) de expressão de ARNm.

Western blotting

células confluentes foram lisadas em tampão de lise (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, cloreto de sódio 150 mM, EDTA 0,5 mM, 0,09 unidades /ml de aprotinina, 1 ug /mL de pepstatina, fluoreto de fenilmetilsulfonilo a 10 mM, e 1 ug /mL de leupeptina). os lisados ​​de proteína (20 ug por pista) detectados no ensaio de proteína BCA foram separadas utilizando um gel de gradiente de SDS-PAGE a 12% 4% (NuPAGE, Invitrogen) e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Invitrogen). As membranas foram bloqueadas com 4% de leite desnatado seco em TBS-T (Tris-HCl a 20, pH 7,5, 8 g /L de cloreto de sódio, e 0,1% de Tween 20) antes da incubação com os anticorpos primários.

Anti- anticorpo de coelho ezrina (# 3145) foi adquirido a Cell Signaling Technology. -Anti-actina β anticorpo monoclonal de ratinho (SC-47778) e o anticorpo de murganho anti-N-caderina (sc-7939) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (CA, EUA). anticorpo anti-E-caderina de ratinho (clone 36) e anticorpo de ratinho anti-β-catenina (clone 14) foram adquiridos na Becton Dickinson and Company (BD; NJ, EUA). De cabra conjugado com peroxidase anti-IgG de coelho (# L3012; Signalway Anticorpo, TX, EUA) e de cabra conjugado com peroxidase de IgG anti-ratinho (# AP124P; Millipore, MA, EUA) foram utilizados como anticorpos secundários. β-actina foi utilizado como controlo positivo interno. As proteínas foram visualizadas utilizando substrato de HRP (Millipore) e digitalizadas com um sistema de quimioluminescência aumentada (Las 4000; Fuji Film, Tóquio, Japão). As intensidades das bandas foram normalizados para a p-actina.

ciclo celular e apoptose ensaio

As células (1 x 10

5) foram semeadas em 75 cm

2 frascos e transfectadas com Ezrin ou controle negativo siRNA. As células foram colhidas três dias após a transfecção e preparados para análise de citometria de fluxo. As células foram fixadas durante 30 min em etanol a 70% e coradas com iodeto de propídio. As medições do conteúdo celular de DNA foram realizadas utilizando um FACSCalibur (BD).

O crescimento celular ensaio

Um ensaio MTT foi utilizado para avaliar o crescimento celular. As células foram semeadas em placas de 12 poços (1 × 10

4 células /poço), e a solução de MTT (0,25 mg /mL) foi adicionado ao meio após incubação durante 24, 48, 72, ou 96 h. cristais de formazan foram dissolvidos em DMSO, e a absorção foi medida a 570 nm usando um Infinito 200 leitor de microplacas (TECAN, Kawasaki, Japão).

A migração celular ensaio

A migração foi avaliada utilizando uma cicatrização de feridas ensaio. As células foram cultivadas em placas de 12 poços a um nível quase confluente em meio DMEM contendo 10% de FBS. estrias cruzadas foram feitas na cultura em monocamada utilizando pontas de pipeta de 200 mL. As células foram lavadas imediatamente com DMEM contendo FBS a 10% para remover as células destacadas. As células foram incubadas num meio contendo mitomicina (3 ug /mL; Nacalai Tesque) durante 1 h para inibir a proliferação. Assim, o aumento observado no número de células não era atribuível ao aumento da proliferação celular. A migração celular foi monitorizada durante 0, 12, 24, e 48 h, e as imagens foram capturadas em cada ponto de tempo utilizando uma câmara digital (Nikon, Tokyo, Japão) ligado a um microscópio de contraste de fase invertida (Nikon).

Invasion ensaio

Os ensaios de invasão usadas 24 poços BD BioCoat Matrigel câmaras de invasão com inserções de 8 de poro (BD). As células (5 × 10

4) suspensas em DMEM isento de soro foram semeadas nas inserções superiores, enquanto DMEM contendo 10% de FBS foi adicionado às câmaras inferiores como um quimioatractor. As células foram removidas a partir da superfície superior do filtro por raspagem com uma cotonete após 22 h em cultura. As células que se infiltrou através do filtro foram fixadas e coradas com hematoxilina-eosina (H /E). Os valores médios dos resultados obtidos com as três câmaras foram usadas na análise.

Imunofluorescência

Células cultivadas em lâminas de cultura de oito poços foram fixadas com formaldeído a 3,7% em PBS durante 30 min, permeabilizadas com 0,25% de Triton X-100 (Merck Calbiochem, Darmstadt, Alemanha), e bloqueadas com 1% de FBS em PBS. Actina foi corado com rodamina-faloidina (Invitrogen). imagens de imunofluorescência foram visualizadas utilizando um Olympus BX-61 microscópio de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão), e as imagens foram capturadas com uma câmera CoolSnap-HQ (NIPPON ROPER, Tóquio, Japão).

ensaio de atividade da família Rho

Rho activação família ensaio também foi realizada utilizando um Kit de RhoA /Rac1 /Cdc42 activação de combinação (Cell Biolabs, San Diego, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, as células foram lavadas, lisadas em tampão de ensaio, e centrifugou-se a 10000 ×

g

durante 1 min para remover os detritos celulares. Para determinar os níveis de expressão no total de RhoA /Rac1 /Cdc42 por transferência de Western, 20 uL de cada amostra foi armazenada a -80 ° C para análise separada. Um ligado celular contendo 500 ug de proteína total foi incubada durante 1 h a 4 ° C com rotação, com 40 ul de esferas de agarose a que se ligou, activados RhoA, Rac1, e Cdc42. esferas de agarose ligadas a RhoA activa /Rac1 /Cdc42 foram lavadas três vezes utilizando tampão de ensaio, ressuspenso em 40 ul de 2 x tampão de amostra LDS e cozidos a 70 ° C durante 10 min. O ativo níveis totais de proteína RhoA /Rac1 /Cdc42 (ligada a GTP) e em cada amostra foi determinada por western blot.

Análise estatística

Cada experiência foi realizada em triplicado. Todos os dados foram expressos como a média ± DP. A análise estatística foi realizada utilizando Excel (Microsoft, WA, EUA). As comparações entre os grupos foram realizadas usando o Student

t

-teste. A correlação dos níveis de expressão de Ezrin com SCC língua e metástase ganglionar foi analisada utilizando o teste exato de Fisher, enquanto as notas de palco e de diferenciação foram analisadas pelo método de comparação múltipla de Tukey. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a

P

. 0,05

Resultados

expressão Ezrin no câncer de língua e tecidos não cancerosos

Ezrin imunorreatividade foi observada no as membranas das células, ao mesmo tempo que era fracamente positiva no citoplasma da língua mucosa normal (Fig. 1A). Em contraste, amostras de CEC língua demonstraram coloração ezrina membranas e do citoplasma, e a coloração citoplasmática foi maior nestas amostras do que em amostras normais língua de mucosa (Fig. 1B). A Tabela 2 apresenta os resultados da coloração da ezrina. Em tecidos língua humana não cancerosas, todas as 10 amostras expressa Ezrin em níveis baixos. Em tecidos língua SCC humanos, no entanto, a alta expressão Ezrin foi detectada em 32/69 (46,4%) tumores, enquanto que a baixa expressão foi detectada em 37/69 (53,6%) tumores. a alta expressão de Ezrin foi significativamente mais comum em tecidos língua SCC humanos do que em tecidos não cancerosos (

P

= 0,0046). expressão Ezrin alta tendem a ser detectado com mais frequência nos casos com metástases em linfonodos (62,5%) do que com aqueles sem metástase linfática (44,3%), mas não houve correlação significativa entre os níveis de expressão de Ezrin e do grau de estágio, regional metástase linfonodal, eo grau de diferenciação (

P Art 0,05)

(a) expressão Ezrin foi baixa nos tecidos não cancerosos (ampliação 40 × e 200 ×).. (B) Ezrin foi altamente expressa em língua carcinomas de células escamosas (ampliação 40 × e 200 ×). Ezrin imunoreactividade foi aparente na membrana do epitélio da língua normal, ao passo que a coloração positiva para Ezrin foi principalmente no citoplasma ou na membrana e no citoplasma das células de carcinoma espinocelular da língua.

Correlações entre Ezrin expressão e os índices de Ki-67 e apoptose em tecidos CCE de língua humana

Foram avaliadas as correlações entre a expressão Ezrin eo Ki-67 e índices apoptóticos em tecidos língua SCC humanos. O índice Ki-67 foi de 33,0 ± 19,3% nos tecidos com baixos níveis de expressão Ezrin e 48,1 ± 15,0% nos tecidos com níveis de expressão elevada Ezrin (Fig. 2a). Houve uma correlação positiva entre os níveis de expressão Ezrin e o índice Ki-67 (

P

= 0,0003). O índice apoptótico foi de 0,60 ± 0,74% em tecidos com baixos níveis de expressão Ezrin e 0,70 ± 0,78% em tecidos com níveis de expressão elevada Ezrin (Fig. 2B). Não houve correlação significativa entre os níveis de expressão de Ezrin e o índice de apoptose (

P

= 0,5776).

(A) O índice Ki-67 foi de 33,0 ± 19,3% em tecidos com baixo Ezrin expressão e de 48,1 ± 15,0% em tecidos com alta expressão de Ezrin. Foram observadas diferenças significativas na correlação entre a expressão Ezrin eo índice Ki-67 (

P

= 0,0003). (B) Não houve correlação significativa entre a expressão de Ezrin e índices apoptóticos (

P

= 0.5776).

expressão do gene Ezrin na linha de células SCC língua humana HSC-3 depois de RNAi

para examinar os efeitos do tratamento ezrina ARNsi nas células HSC-3, foi utilizado qRT-PCR e transferência de western para medir a ezrina ARNm e os níveis de proteína, respectivamente, nas células SH-3 que foram transfectadas com siRNA. Como mostrado na Figura 3A, a expressão de ARNm de ezrina foi claramente inibido nas células ezrina-siRNA que nas células de NSC (0,10 ± 0,03 vs 1,06 ± 0,21;

P

0,05). A análise por Western blot demonstrou que a RNAi reduziu os níveis de proteína Ezrin (Fig. 3B).

(A), a expressão de ARNm Ezrin foi analisada utilizando PCR em tempo real, depois de RNAi. A inibição da expressão de ARNm de ezrina foi claramente observado na ezrina siRNA-transfectadas células HSC-3 em comparação com o que em HSC-3 células de controlo (0,10 ± 0,03 vs 1,06 ± 0,21;

P

0,05). a expressão da proteína (B) Ezrin foi detectada por transferência Western após RNAi. A expressão de Ezrin diminuiu drasticamente em células Ezrin siRNA-transfectadas HSC-3.

Efeitos de Ezrin RNAi sobre a progressão do ciclo celular e apoptose

Nós transfectadas células HSC-3 com Ezrin siRNA e recolheu-los depois de três dias para análise do ciclo celular. A citometria de fluxo mostrou que a fracção G0 /G1 aumentou de 37,7% ± 4,9% e 54,1% ± 0,5% (

P

= 0,0046) nas células HSC-3 depois de ARNi (Fig. 4). Em contraste, o S e as fracções G2 /M foram diminuídas nas células HSC-3 depois de RNAi. Em particular, as proporções de células em fase S diminuiu de 50,8% ± 1,6% e 36,6% ± 0,4% (

P

= 0,0018), enquanto que a proporção da fase G2 /M células diminuiu de 11,5% ± 3,3% para 9,3% ± 0,9% (

P

= 0,1155). Nenhuma célula preG0 /G1 ou corpos apoptóticos foram observados em células de controlo e transfectadas com ARNsi. Estes resultados sugerem que a ezrina siARN podem inibir a proliferação celular por interferência com a mitose celular e na progressão do ciclo celular.

A proporção de HSC-3 células na fase S diminuiu de 50,8 ± 1,6% para 36,6 ± 0,4% após a RNAi (

P

= 0,0018). A percentagem de células na fase G0 /G1 também aumentou de 37,7 ± 4,9% para 54,1 ± 0,5% após a RNAi (

P

= 0,0018). A apoptose não foi detectada.

Efeitos da ezrina ARNi sobre o crescimento celular

Os efeitos da expressão da proteína Ezrin no crescimento celular foram ensaiados utilizando um ensaio MTT. A taxa de crescimento das células tratadas com siRNA ezrina diminuiu de uma forma dependente do tempo (Fig. 5). Os valores de absorvância do ensaio de MTT depois de 72 horas foram de 0,36 ± 0,02 e 0,30 ± 0,01 para o NSC- e células HSC-3 ezrina siRNA-transfectadas, respectivamente. Estes dados indicam que houve uma redução significativa no crescimento celular nas células ezrina siRNA-transfectadas do que nas células de controlo.

O crescimento das células transfectadas ezrina siRNA-HSC-3 diminuiu de um modo dependente do tempo. (24 h:

P

= 0,6727; 48 h:

P

= 0,5314; 72 h:

P

= 0,0122; 96 h:

P

= 0,0065).

Efeitos de Ezrin RNAi sobre a migração e invasão celular

para tratamento de feridas ensaios foram conduzidos para avaliar a motilidade celular do NSC- e células Ezrin siRNA-transfectadas. Uma ferida foi criado em uma monocamada de células, e de fecho de feridas foi avaliada em diferentes pontos de tempo. Ezrin silenciamento nas células HSC-3 prejudicada a sua capacidade para curar uma ferida em comparação com o que em células de controlo que expressam a ezrina (Fig. 6). ensaios de invasão também foram realizadas utilizando câmaras de cultura Transwell revestidas com Matrigel, e as células invasoras foram contadas após 22 h. As células ezrina siRNA-transfectadas exibiram uma dobra em quatro menor taxa de invasão de células do que as células transfectadas que NSC-expressa ezrina (564,7 ± 111,8 1969,8 ± 126,6 vs;

P

0,05; Fig. 7).

as células foram feridos por raspagem com uma ponta de pipeta, e mitomicina foi adicionado (3 mg /mL) ao meio durante 1 h para inibir a proliferação de células cancerosas. As células foram subsequentemente incubadas com DMEM durante 48 h. As células foram fotografadas por microscopia de contraste de fase. migração de células HSC-3 foi reduzida por tratamento ezrina siARN.

(A), as câmaras Transwell revestidas com Matrigel foram utilizados para analisar a invasão celular. As células que se infiltrou através do filtro foram fixadas e coradas, e campos representativos foram fotografados. (B) As células foram quantificados por contagem sob um microscópio de luz. Em comparação com as células controle HSC-3, as células Ezrin siRNA-transfectadas HSC-3 apresentaram redução significativa capacidade de invasão (1969,8 ± 126,6 vs 564,7 ± 111,8;

P Art 0,05).

efeitos de Ezrin RNAi no citoesqueleto de actina reorganização

Foram analisados ​​os efeitos da regulação baixa Ezrin na organização do citoesqueleto de actina. As análises de células coradas com faloidina mostrou que a formação de PODIA foi claramente inibido nas células ezrina siRNA-transfectadas (Fig. 8). Estes resultados indicaram que a ausência de Ezrin causou alterações morfológicas nas células cancerosas através da remodelação do citoesqueleto de actina.

NSC- e Ezrin siRNA-transfectadas células HSC-3 foram marcadas com um anticorpo contra actina. Ezrin depleção de células HSC-3 conduziu a níveis de proteína Ezrin reduzidas. Esta regulação negativa foi associada com a perda de saliências (setas).

proteínas da família Rho, E-caderina, N-caderina, e expressão β-catenina em células empobrecido-ezrina

Não havia diferenças nos níveis de proteína total de RhoA, Rac1, e Cdc42 (Fig. 9), e os níveis das suas formas activas foram demasiado baixos para ser detectada nas células NSC- ezrina e siRNA-transfectadas.

a expressão de e-caderina e β-catenina foi aumentada e a expressão de N-caderina foi reduzida em ezrina siRNA-transfectadas células HSC-3 em comparação com a que nas células NSC-transfectadas. Não houve diferença significativa nos níveis de proteínas totais de RhoA, Rac1 e Cdc42.

Nós testamos se os níveis de E-caderina, N-caderina e β-catenina expressão foram afetados pela depleção Ezrin nas células HSC-3 com a quantificação de expressão utilizando transferência de western. Como mostrado na Figura 9, E-caderina e expressões β-catenina foram aumentadas, enquanto que a expressão de N-caderina foi reduzida nas células ezrina siRNA-transfectadas do que nas células NSC-transfectadas. Estes resultados indicam que a supressão da expressão da proteína Ezrin induzida a regulação positiva de E-caderina e β-catenina, mas a regulação negativa de N-caderina nas células HSC-3.

analisa Discussão

Tissue microarrays mostrou que a alta expressão de Ezrin foi significativamente mais comum nos tecidos língua SCC humanos do que os tecidos não cancerosos (

P

= 0,0046). Houve também uma correlação positiva entre a expressão de Ezrin eo índice Ki-67 neste estudo. O antigénio Ki-67 é expressa por células em proliferação durante a G1, S, G2, e as fases de M, mas não durante a fase G0 (células em repouso) [33]. Ki-67 é utilizada como um marcador de proliferação do tumor e a agressividade, e pode ter um efeito importante no prognóstico de pacientes com carcinoma epidermóide [34]. expressão Ezrin alta tendem a ser detectada mais frequentemente em casos com metástases em linfonodos (62,5%) do que naqueles sem metástases em linfonodos (44,3%). Nosso

in vitro

experimentos utilizando a linha de células SCC língua humana HSC-3 com e sem tratamento RNAi também detectou uma associação entre a superexpressão Ezrin e comportamento mais agressivo, enquanto que não houve correlações significativas entre os padrões de expressão de Ezrin e TNM encenação em tecidos língua SCC humanos. Nicolas et ai. também relataram nenhuma diferença significativa na expressão de Ezrin em tumores mais avançados e inferiores estágio TNM, enquanto que altos níveis de Ezrin e moesina expressão foram associados a menor sobrevida câncer [35], [36]. Estes achados sugerem que Ezrin superexpressão pode ser usado como um marcador de prognóstico independente do estadiamento TNM.

O

in vitro

papéis de Ezrin no comportamento celular não foram avaliadas em CCEs de língua. Nossos experimentos RNAi detectado forte supressão do crescimento celular, motilidade e invasão nas HSC-3 células língua SCC. A análise do ciclo celular revelaram que a depleção de ezrina aumentou a fracção G0 /G1, mas diminuiu a fracção G2-M, interferindo com a mitose celular e na progressão do ciclo celular. Estes resultados concordam com os relatados por Zhang et al. no carcinoma hepatocelular [37]. Eles também indicam que a ezrina poderia aumentar o crescimento de células cancerosas, apoiando a divisão celular e a progressão do ciclo celular da fase G0 /G1 para a S e G2 /M fases. Isto concorda com os resultados da micromatriz de tecido Ki-67. Observou-se também que o crescimento celular inibido depleção ezrina num ensaio MTT.

A migração celular e invasão são processos essenciais para a metástase das células cancerosas. células cancerosas migratórias passam por uma série de alterações morfológicas através reorganização de moléculas de adesão e as fibras de actina [38]. é agora amplamente aceito que o processo de migração de células de câncer envolve quatro passos principais-formação e extensão dos filopodios e lamellipodia na vanguarda, a criação de novos locais de adesão na frente, a contração do corpo celular e descolamento de aderências na traseira [39]. Observou-se que a depleção Ezrin diminuição da motilidade célula cancerosa e capacidade de invasão e formação PODIA inibido. Estes resultados indicam que a inibição da ezrina perturbado remodelação do citoesqueleto de actina, o que reduziu a motilidade e invasividade das células HSC-3. Esses achados estão de acordo com os relatórios anteriores, que mostraram que as mudanças no citoesqueleto pode ser um fator-chave na regulação da progressão neoplásica e crescimento do tumor [24], [40] – [43]. Um estudo anterior também detectada uma redução dramática no número de células de cancro do pâncreas com rosetas podosomal após o tratamento ezrina RNAi e relataram que a formação de podosomes e suas rosetas foi conduzida por uma interacção ezrina-cortactina, que tem um papel na invasão de cancro pancreático [44 ]. Outro relatório revelou que a formação pseudópode foi claramente diminuída por tratamento ezrina RNAi em quatro linhas celulares de carcinoma hepatocelular [37].

Os nossos resultados sugerem que a ezrina desempenha um papel importante no crescimento invasivo de CCEs língua. Também examinamos actina, proteínas da família Rho, E-caderina, N-caderina e β-catenina para investigar os mecanismos moleculares subjacentes a estas observações. Descobrimos que a ezrina supressão induzida a expressão aumentada de E-caderina e β-catenina em células HSC-3. Sabe-se que o E-caderina desempenha um papel central na adesão célula-célula epitelial e a manutenção da integridade da colónia celular epitelial [45]. Está bem documentado que a perda ou a inibição da função de E-caderina, ou os seus associados cateninas, leva à redução da adesão intercelular e um aumento do potencial invasivo [46]. Além disso, vários estudos de malignidades epiteliais, incluindo CCEs por via oral, sugeriram que o complexo E-caderina /catenina β-regula a invasão e metástase [47] do cancro, [48]. complexos de adesão da caderina interagir com o citoesqueleto de actina em uma forma complexa, o que é pouco compreendida. A vista actual é que a E-caderina está associada ao citoesqueleto de actina através da sua interacção com β-catenina, que por sua vez se liga a proteína se liga à actina α-catenina [49]. Evidências recentes sugerem que a ezrina é importante para a localização de E-caderina para a membrana do plasma [24]. Assim, a hipótese de que a E-caderina e β-catenina downregulation ligada à Ezrin superexpressão pode ter sido associada com remodelamento de actina e a formação de extensões PODIA.

É amplamente conhecido que a reorganização da actina é regulada pela Rho famílias pequenas GTPases, como Rho, Rac e Cdc42 [50], ou seja, Rho regula fibras de tensão e montagem de adesão focal, Rac regula a formação de saliências lamellipodia e babados de membrana, e Cdc42 desencadeia extensões filopoidais na periferia das células [51]. Foi examinada a expressão e atividade da RhoA, Rac1 e Cdc42 na Ezrin siRNA- e células HSC-3 NSC-transfectadas.