Sumário
Expansão de leucócitos mielóide de linhagem em camundongos portadores de tumor tem sido proposta como uma causa de imunossupressão sistêmica. Nós demonstramos que a terapia de radiação de tumores leva a um declínio no número de células mielóides no sangue e uma diminuição no tamanho do baço. A frequência de células mielóides não diminuir para níveis observados em ratinhos livres de tumor: foi demonstrado que a doença metastática podem prevenir os números de células mielóides de retornar à linha de base, e que a recorrência de tumores a partir de doença residual correlaciona com a re-expansão de células da linhagem mielóide. terapia de radiação resulta num aumento da proliferação de células T no baço e enquanto que as respostas das células T aos antigénios estranhos não são alteradas pela carga tumoral ou a expansão de células mielóides, respostas a antigénios associados a tumores são aumentados após terapia de radiação. Estes dados demonstram que o número de células mielóides estão diretamente ligadas à carga tumoral primário, do presente contrato população após a terapia de radiação, e que a terapia de radiação pode abrir uma janela terapêutica para imunoterapia da doença residual
Citation:. Crittenden MR, Savage t, Cottam B, Bahjat KS, Redmond WL, Bambina S, et al. (2013) A expansão periférica Mielóide Impulsionada por Murino Cancer progressão é revertida por radioterapia do tumor. PLoS ONE 8 (7): e69527. doi: 10.1371 /journal.pone.0069527
editor: Maria G. Castro, da Universidade de Michigan School of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 05 de abril de 2013; Aceito: 11 de junho de 2013; Publicação: 25 de julho de 2013
Direitos de autor: © 2013 Crittenden et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo financiamento da investigação a partir de uma Susan G Komen para a atribuição Catalisador Carreira Cure (KG110131) e uma Sociedade americana de Câncer Research Scholar Grant (RSG-12-168-01-LIB) para MJG, e Wayne D. Kuni e Joan e . Kuni Fundação Kuni Scholar Award para MRC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
células mielóides têm um papel importante no desenvolvimento e progressão do cancro. macrófagos associados a tumores são críticos para a angiogénese, invasão, metástase, imunossupressão e resposta à terapia [1], [2], [3]. Estudos recentemente têm-se centrado na população de células mielóides que é frequentemente expandido no sangue periférico de pacientes com cancro [4], [5]. Certos modelos de ratinho estão associados com expansões mielóides extremas detectáveis no tumor, baço e sangue periférico, e estas células mielóides são capazes de suprimir a activação de células T
In vitro
[6], [7], [8].
modelos de tumores transplantáveis com as suas células cancerosas clonal idênticos fornecer um modelo útil para estudar as principais características de expansão mielóide. Se a expansão mielóide está relacionado com o número de células cancerosas, em seguida, o tratamento do tumor primário deve evitar a expansão mielóide. Gencitabina e 5-FU quimioterapia têm sido mostrados para controlar a expansão mielóide nos baços de ratinhos portadores de tumor [9], [10], [11]. No entanto, cada um destes agentes tem sido descrito como tendo um efeito inibidor directo sobre as populações mielóides
in vitro
[10], [11]. Enquanto estas não são quimioterapias particularmente mielotóxicas, os potenciais efeitos sistêmicos de quimioterápicos sobre proliferam activamente precursores mielóides podem confundir a contribuição de carga tumoral reduzida. A remoção cirúrgica do tumor primário também provoca uma diminuição em células mielóides [9], [12]. É interessante que esse efeito é incompleta, como células não retornar aos níveis ingênuos. Estes dados sugerem que os tumores têm um efeito sobre as células mielóides que persiste além excisão. No entanto, neste modelo o efeito de excisão do tumor é transitória, como a expansão mielóide retorna com recorrência do tumor primário e as metástases [12]. Portanto, estes dados podem ser reinterpretados a sugerir que as células cancerosas residuais podem evitar uma completa normalização de números mielóides. No modelo cirúrgica, trauma também pode atuar como um fator de confusão. O trauma tem sido demonstrado causar uma mobilização de células mielóides com fenotípicas, morfológicas e funcionais propriedades semelhantes às células mielóides induzida por tumores [13]. Esta expansão mielóide induzida por trauma pode ocultar a extensão da redução das células mielóides causadas pela remoção cirúrgica do tumor primário, e adicionar a qualquer expansão mielóide sustentada por doença residual.
A consequência da terapia de radiação de tumores para sistémico populações mielóides não foi descrita. A terapia de radiação pode ser administrado de uma maneira altamente específica do local, resultando no controlo de tumores alvo e, em circunstâncias normais não há nenhum efeito sobre os tumores fora da área alvo. Assim, a terapia de radiação proporciona uma técnica para afectar do tumor primário em células mielóides periféricos sem os efeitos de confusão de quimioterapia e cirurgia. Nós demonstramos que a terapia de radiação de tumores 4T1 causa um declínio no número de células mielóides no sangue e uma diminuição no tamanho do baço. doença sistémica, tal como medido por metástases do pulmão, não é afectada pela radioterapia do tumor primário. Nós demonstramos que a expansão mielóide segue de perto o crescimento do tumor primário, mas que após o tratamento, os números mielóides não diminuir para o nível visto em ratinhos livres de tumor, sugerindo que após o tratamento local, local da doença e metastático residual combinam para sustentar números mielóides. Quando os tumores primários reapareceu como resultado da doença local residual, a expansão mielóide retornado. Demonstramos que, embora os números mielóides são regulados pelo crescimento do tumor e influenciada pela terapia de radiação, os números de células T não mudam. No entanto, a terapia de radiação do tumor primário melhorou a mielóide: CD8 e resulta no aumento da proliferação de células T endógenas no baço. Para testar se a expansão e contracção mielóide afectada em respostas de células T in vivo, nós medimos a resposta específica de antigénio a antigénios associados a vacina e associado a tumores. Nós demonstramos que não houve alteração no
in vivo
resposta a
Listeria monocytogenes
vacinação em portador de tumor e tratados ratos, mas que a combinação de radioterapia com resultados de vacinação em aumento de respostas à vacina antigénio partilhado com o tumor. Estes dados suportam a hipótese de que a expansão mielóide está directamente ligada à carga tumoral, que estas células contrato após a terapia de radiação, e que a terapia de radiação pode abrir uma janela terapêutica para imunoterapia de doença residual.
Materiais e Métodos
Ética
Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Earle A. Chiles Research Institute IACUC (animal Welfare Assurance No. A3913-01).
Animais e linhas celulares
a linha de células de carcinoma mamário 4T1 [14] (BALB /c) foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA). A linha de Panc02 murino pancreático de células de adenocarcinoma [15] (C57BL /6) foi gentilmente cedido pelo Dr. Woo (Mount Sinai School of Medicine, Nova Iorque). 6-8 semanas de idade C57BL /6 e BALB /c foram obtidos em Charles River Laboratories (Wilmington, MA) para utilização nestas experiências.
Anticorpos e reagentes
os anticorpos conjugados com fluorescência-CD11b -AF700, Gr1-PE-Cy7, IA (MHC classe II) -e780, Ly6C-PerCP-Cy5.5, CD4-E450, FoxP3-E450, CD25-APC, CD4-PerCP Cy5.5, CD8-FITC, IFN-y -APC, e CD40L-PE, foram adquiridos a eBioscience (San Diego, CA). Ki67-FITC, CD4-V500, TNFa-PE-Cy7 e Ly6G-FITC foram adquiridos a BD Biosciences (San José, CA). CD8-PE-TXRD foi adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA).
radioterapia de tumores
Os tumores foram inoculados por via s.c. na perna direita abaixo do joelho, a uma dose de 5 × 10
4 4T1 ou células de 2 x 10
5 Panc02 e deixou-se estabelecer durante 14 dias antes do início do tratamento. A dosagem foi baseado em recentes estudos clínicos [16], com três diárias de 20 fracções de tratamento Gy dadas usando um acelerador linear Elekta Synergy (Atlanta, GA) com 6 MV de fótons incorporando um bloco metade feixe para minimizar a dose para o tronco e um centímetro bolus.
análise clonogénicos de células de cancro metastáticas
Para a análise clonogénica de células de cancro metastático, os pulmões foram dissecados em fragmentos de cerca de 2 mm, seguida por agitação em 1 mg /mL de colagenase (Invitrogen), 100 ug /ml de hialuronidase (Sigma, St Louis, MO), e 20 mg /ml de DNase (Sigma) em PBS durante 1 h à temperatura ambiente. A digestão foi filtrada através de 100 um de malha de nylon para remover os restos macroscópicos. As diluições em série de células tumorais foram semeadas a 6-se placas de cultura de tecidos em meio contendo 60 uM de 6-tioguanina para seleccionar células de cancro em relação às células do estroma e as colónias foram contadas após 7 dias. A diluição de série eo número de colónias foram usadas para calcular o número de células cancerosas clonog�icas no órgão original.
Citometria de Fluxo de células mielóides no sangue e Spleen
A expansão das células mielóides em o sangue periférico foi medida utilizando um ensaio de esferas de sangue total. O sangue total foi colhido em tubos de EDTA de ratinhos vivos através da veia safena, e 25 mL de sangue fresco foi corado diretamente com cocktails de anticorpos fluorescentes. Um número conhecido de partículas fluorescentes AccuCheck (Invitrogen) foram adicionados a cada amostra, então as células vermelhas do sangue foram lisadas com Cal-Lyse solução de lise de sangue completo (Invitrogen), e as amostras analisadas num citómetro de fluxo BD LSRII. Determinou-se o número absoluto de células na amostra com base na comparação de eventos celulares a talão eventos (células /ml). Para análise de citometria de fluxo de esplenócitos, baços homogeneizadas foram lavadas e coradas com anticorpos específicos para antigénios de superfície, em seguida as células foram lavadas e fixadas utilizando um kit de coloração de células T reguladoras (EBiosciences) e intracelularmente coradas para FoxP3 e Ki67. A proporção de cada tipo de células infiltrantes foi analisada num BD LSRII. Fluxo de triagem de células de sangue foi realizada usando uma célula Classificador BD FACSAria para maior do que 98% de pureza. A morfologia das populações de células classificadas foi determinada por Cytospin seguido por coloração com DiffQuick. esfregaços de sangue foram coradas utilizando mancha de Wright-Giemsa (Ricca Chemical Company, Arlington, TX). As imagens foram adquiridas utilizando um TE2000-S microscópio de fluorescência Nikon Eclipse com aquisição e análise de software NIS-Elements, ou em um scanner de slides Leica SCN400.
citocinas Bead Ensaio
Os tumores foram colhidos no gelo e homogeneizou-se em 4,5 ul de PBS contendo HALT inibidor da protease por mg de tecido. Os restos celulares foram removidos por centrifugação a 14000 g durante 15 minutos a 4 ° C, e os sobrenadantes foram armazenados em alíquotas a -80 ° C até serem usadas. Os níveis de citocinas nos sobrenadantes foram detectadas usando um ensaio de esferas multiplex murino (Life Technologies, Grand Island, NY) e lidas num leitor de matriz Luminex 100. As concentrações de citocinas para repetições de cada amostra de tumor foram calculados de acordo com uma curva padrão.
estirpe bacteriana e Vacinação
ACTA-excluídos (Δ
actA
)
L. monocytogenes
expressando o péptido AH1-A5 lm-AH1-A5) foram previamente descritos [17]. As bactérias foram crescidas até à midlog no cérebro-coração caldo de infusão, lavadas e ressuspensas em DPBS para injecção. Uma dose de 5 × 10
6 UFC foi entregue por via intravenosa e confirmada por plaqueamento de inoculo residual. Os ratinhos de controlo ou ratinhos com tumores 4T1 não tratada ou tratada como acima com três 20 frações diárias de tratamento Gy foram vacinadas 1 dia após a dose de radiação final com 5 × 10
6 UFC Lm-AH1-A5. Os baços foram colhidos 7 dias após a vacinação e suspensões de células foram estimuladas com 2 uM de LLO
91-99 (GYKDGNEYI), AH1 (SPSYVYHQF), ou veículo de DMSO na presença de Brefeldina A durante 5 horas a 37 ° C. As células estimuladas foram lavadas e coradas com CD4-PerCP Cy5.5 e CD8-FITC, em seguida, fixadas e permeabilizadas utilizando um BD Cytofix /Cytoperm plus kit (BD Biosciences) e congeladas a -80 ° C. Para análise de células foram descongelados e corados com IFNy intracelularmente-APC, TNFa-PE-CD40L e Cy7-PE. As células foram lavadas e analisadas em um BD LSRII Citómetro de fluxo e os dados foram interrogados usando BD FACSDiva (BD Biosciences) e Flojo (árvore da estrela, Ashland, OR).
Estatísticas
Os dados foram analisados e gráficos usando Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). números mielóides no sangue ao longo do tempo foram adaptados a curvas polinomiais de segunda ordem utilizando Prism. conjuntos de dados individuais foram comparadas usando teste T e análise de Student entre vários grupos foi realizada utilizando ANOVA com grupos individuais avaliada usando comparação de Tukey.
Resultados
A expansão das populações mielóides está associada com a progressão do câncer em modelos animais e em doentes com cancro. Em ratinhos, a expansão mielóide varia entre modelos de tumor, por exemplo, com expansões mielóides particularmente pronunciado descritos no modelo de carcinoma mamário 4T1 [18]. Nestes modelos, os ratos com tumores avançados expor extremamente grandes baços, contendo uma expansão particularmente visível na CD11b
+ Gr1
+ população. Para acompanhar a expansão mielóide em camundongos através do crescimento do tumor sem a necessidade de sacrificar o animal acompanhámos populações mielóides no sangue periférico. preparação padrão de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) por centrifugação em gradiente de densidade pode levar à perda de populações de granulócitos, os quais constituem a maioria das células mielóides no sangue periférico. Por isso, desenvolvemos um fluxo de sangue total citometria de ensaio incorporando contagem de grânulos para medir números absolutos de circulando células mielóides. medidas repetidas de vários ratos demonstraram que esta população mielóide cresceu 2-3 registra através do crescimento do tumor, aumentando drasticamente a celularidade total do sangue periférico. Em ratos naïve o CD11b
+ células mielóides em geral consistia em Gr1
+ e Gr1
– células (Figura 1a), onde o CD11b
+ Gr1
+ células foram uniformemente MHC classe II ( IA) negativo eo CD11b
+ Gr1
– células incorporadas tanto MHC classe II células negativas e positivas (Figura 1aii). Em 4T1 ratinhos portadores de tumor foram observados fenotipos semelhantes, mas um grande aumento no número destas células, nomeadamente uma expansão na CD11b
+ Gr1
+ células, consistente com as observações de outros investigadores foi observada [4] , [19]. A terapia de radiação de ratinhos portadores de tumores estabelecidos 4T1 controla o crescimento do tumor; No entanto, apesar de doses elevadas de radiação, os tumores recorrência local (Figura 1b). A radioterapia do tumor primário resultou em uma diferença significativa em células mielóides periféricas, em comparação com ratinhos não tratados, dentro de uma semana da terapia de radiação (p 0,01 Dia 21 após o desafio com tumor) (Figura 1B). Neste ponto, os números de células mielóides circulantes em murganhos tratados foram significativamente mais baixos do que os níveis de pré-tratamento para um pouco mais de uma semana antes da expansão devolvido (RT D14 vs RT D21 (p 0,05), RT D14 vs RT D23 ( p 0,05), RT D14 vs D27 TA (p = 0,26)). Os números circulantes de células mielóides em ratinhos tratados permaneceram significativamente mais baixa do que em ratinhos sem tratamento até cerca de duas semanas de pós-tratamento (p 0,05 27 dias a seguir a inoculação do tumor). Neste ponto, a recorrência do tumor primário era evidente (Figura 1bi) sugerindo uma ligação potencial entre o peso do tumor primário e números mielóides. Estes dados demonstram que a terapia de radiação do tumor primário transitoriamente inverte a expansão mielóide associado a um tumor.
a) i) de citometria de fluxo de sangue periférico inteiro fresco a partir de ratinhos BALB /c naive e 4T1 portadores de tumor, mostrando CD11b
+ SSC
populações mielóides hi. ii) Gr1 e IA (MHC classe II) coloração em fechado CD11b
+ SSC
populações mielóides hi de camundongos portadores de tumor ingênuos e 4T1. b) i) A média e o erro padrão do diâmetro da perna de ratinhos BALB /c portadores de tumores 4T1 deixados sem tratamento (NT) ou tratados com início no dia 14 com 3 doses diárias de 20 Gy de radiação focal (RT). células /ul de sangue periférico mielóide de ii) os ratinhos não tratada e tratada iii) ratinhos começando no dia 14 com 3 doses diárias de 20 Gy de radiação focal. iv) montados a partir de curvas de gráficos ii) e iii) representada sem medições. c) i) ensaios clonogénicos de metástases pulmonares presentes na eutanásia em ratinhos BALB /c portadores de 4T1 Os tumores deixados sem tratamento (círculos vazios – NT) ou tratados com início no dia 14 com 3 doses diárias de 20 a radiação focal Gy (círculos preenchidos – RT). ii) células mielóides /sangue periférico ul de camundongos normais (Naïve) e camundongos dia 17 após a injecção de 4T1 i.v. (I.v.) ou s.c. (S.c.) iii) celularidade total do baço em ratos naïve (NT) e camundongos dia 24 após a injecção de 4T1 i.v. (I.v.) ou s.c. (S.c.) d) i) células /ul de sangue periférico Mielóide de C57BL /6 murganhos portadores de tumor Panc02 colhidas em diferentes pontos de tempo. ii) 24 dias diâmetro perna e iii) células mielóides /ul de sangue periférico de ratos C57BL /6 murganhos portadores de tumor Panc02 deixada sem tratamento (NT) ou tratados com início no dia 14 com 3 doses diárias de 20 Gy de radiação focal (RT). Em cada gráfico, cada símbolo representa um mouse. NS = não significativo; * = P 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,005; **** = P 0,001. Os dados representam várias experiências duplicadas.
O modelo 4T1 é espontaneamente metastático, predominantemente para os pulmões. As metástases são semeadas dentro de 10 dias após a implantação do tumor primário – Após este tempo, a remoção cirúrgica do tumor primário não curar ratinhos, mas em vez disso, eventualmente, resulta em mortalidade devido a um crescimento progressivo da doença metastática [20]. Para monitorar a progressão metastática em nosso modelo de terapia de radiação, colhemos os pulmões de ratos que exigiam a eutanásia devido ao seu tumor primário superior a 12 mm, ou devido a más condições. Nos ratinhos tratados com a terapia de radiação de 14 dias após a inoculação do tumor, o controlo do tumor primário resultou em colheitas de pulmão atrasado em comparação com ratinhos não tratados. No entanto, na colheita de pulmão, a análise clonogênica demonstraram que as metástases continuou a progredir (Figura 1CI). Mesmo em ratos onde o tumor tratados com radiação era estável, ou a progredir lentamente, dentro de 35-50 dias de desafio todos os ratos se tornaram suficientemente doente para exigir a eutanásia, e isso morbidade foi universalmente associado com uma extensa carga de doença pulmonar. Estes dados confirmam extensos dados históricos que a terapia de radiação focal do tumor primário é uma terapia altamente local, resultando no controle do câncer exclusivamente no campo de radiação: na casa das centenas de milhares de pacientes tratados por ano com a terapia de radiação, efeitos abscopal – tratamento induziu o controle de tumores fora do campo de radiação – são extremamente raros onde a radiação é a única modalidade de tratamento [21]. Uma vez que a expansão mielóide em pacientes tem sido associada com a doença invasiva e metastática [5], é possível que a doença metastática residual impede a normalização total dos números mielóides seguinte terapia local. Para examinar a contribuição da doença metastática à expansão mielóide, os ratinhos foram injectados por via intravenosa com tumores 4T1 para formar metástases directamente na ausência de um tumor primário. Os ratinhos portadores única doença metastática exibiu periférica expansão mielóide (Figura 1cii), mas não foram substancialmente menos células mielóides presente do que em ratinhos com tumores primários sub-cutânea síncrona. Esta relação foi sustentado no baço, onde os ratos que carregam apenas exibiram metástases significativamente mais células do que os ratos que carregam não tumorais, mas este foi um número significativamente menor do que os ratos com tumores primários sub-cutâneos (Figura 1ciii). Como sabemos que a terapia de radiação focal controla o tumor primário localmente mas não controla metástases, ratos que receberam a terapia de radiação manter tanto a sua doença local residual
e jogue o seu fardo tumor de pulmão. Por conseguinte, estes dados são consistentes com a combinação de doença local e metastático residual prevenção números mielóides retornando à linha de base após a terapia de radiação, e é consistente com observações após a quimioterapia [9] e excisão cirúrgica [9], [12].
Este efeito de terapia de radiação não foi limitado ao modelo 4T1. O modelo de tumor de adenocarcinoma pancreático Panc02 impulsiona expansão mielóide com a progressão do tumor, embora em menor grau do que 4T1 (Figura 1di). A terapia de radiação de tumores Panc02 causou um controlo transiente do crescimento do tumor (Figura 1dii), seguido por uma excrescência agressivo [22]. Como o tratamento de 4T1, a terapia de radiação de tumores Panc02 resultou numa diminuição significativa nas células mielóides periféricos (fig. 1diii). Em conjunto, estes dados demonstram que a terapia citotóxico dirigido ao tumor primário provoca uma sistémica, embora transitória reversão da expansão mielóide conduzido pelo crescimento do tumor.
no nadir de células mielóides no sangue após a terapia de radiação, os baços foram visivelmente menor (Figura 2a). Contamos as células do baço como uma medida de contracção mielóide após a terapia de radiação, e enquanto celularidade total de baço diminuiu sete dias após a terapia de radiação, ele manteve-se em um tamanho intermédio – significativamente menos células do que os ratos sem tratamento (p 0,01) e significativamente mais células do que os ratinhos sem tumores (p 0,01) (Figura 2BI). Para determinar se a diminuição do número mielóides sistémicos foi causada pelo tratamento de radiação de forma independente de efeitos sobre o tumor, os ratinhos portadores de tumores de 4T1 foram tratadas com radiação para a perna que não possui o tumor contralateral. Os ratinhos que receberam a terapia de radiação ao tumor exibido um número significativamente menor de células totais no baço do que os ratos não tratados ou aqueles tratados no membro contralateral (Figura 2BI). CD11b
+ células foram, de longe, a maior população no baço expandida de ratinhos portadores de tumor, e o CD11b
+ população no baço mostrou um resultado intermediário semelhante seguinte radioterapia do tumor primário, com ratinhos tratados com radioterapia tumor exibindo um número significativamente menor CD11b
+ células do que os ratos não tratados ou ratos irradiados na perna não-portador de tumor (Figura 2bii). Mais uma vez, apesar da redução causada pela radiação do tumor, os ratinhos tratados mantiveram uma elevação significativa em células mielóides sobre ratinhos portadores de tumor e não houve nenhuma diferença significativa entre os ratinhos não tratados e ratinhos irradiados para a perna sem tratamento (Figura 2bii). A resposta mielóide semelhante à radiação do tumor observado no sangue periférico e no baço os resultados em uma correlação estreita entre estas medidas, independentemente de tumor ou estado de tratamento (Figura 2c). Uma vez que a terapia de radiação para o tumor e para o membro oposto irá irradiar uma acumulação de sangue por meio de tratamento, que a terapia de radiação que atinge o membro oposto é não reduz números mielóides no baço indica que o efeito sobre as populações mielóides não é devido aos efeitos directos de radiação sobre as células mielóides ou quaisquer potenciais de dispersão-doses.
a) baços excisados a partir de D24 recentemente 4T1 ratinhos BALB /c portadores de tumor deixada sem tratamento (NT) ou tratados com início no dia 14 com 3 doses diárias de 20 Gy radiação focal (RT). Caixas mostradas são 3 cm de largura. b) i) total da celularidade do baço em ratinhos ingénuos (sem tumor) e os ratinhos 24 dias após a injecção de 4T1 não tratada (tumor NT) ou tratados com início no dia 14 com 3 doses diárias de 20 a radiação focal Gy ao tumor (tumor RT) ou para o membro oposto não envolvido (tumor Perna RT). ii) o número de CD11b
+ células por baço em ratinhos a partir da experiência apresentada na I). c) O número de CD11b
+ células no baço em função do número de CD11b
+ células /mL de sangue periférico no momento da colheita para cada grupo de tumor e tratamento.
Para determinar se qualquer população mielóide específica foi particularmente afetada pela terapia de radiação, foi realizada sub-fenotipagem adicional de células mielóides do sangue periférico. O anticorpo reconhece tanto Ly6G Gr1 e Ly6C, e anticorpos para estes marcadores foram utilizados para distinguir subpopulações dentro CD11b
+ células [6]. Consistentes com a literatura, no CD11b
+ Gr1
+ células foram duas populações principais distinguidos pela Ly6C e Ly6G: uma população claramente distinta de Ly6G
-Ly6C
+ células e uma grande população de Ly6G
+ células que exibiam expressão variável de Ly6C (Figura 3aa-III). Após a terapia de radiação, houve uma perda aparente de CD11b
+ Gr1
+ Ly6G
+ células expressando níveis mais baixos de Ly6C (Figura 3aiii). Usando controles para identificar Ly6G
+ Ly6C
– células (Figura 3aiv) demonstramos que a terapia de radiação ao tumor resultou em uma diminuição significativa na CD11b
+ Gr1
+ Ly6G
+ células que foram Ly6C
-. Isto não acontece quando o membro oposto foi irradiada (Figura 3av). Para caracterizar estas populações, que estes sub-classificados fenótipos a partir do sangue periférico de ratos portadores de tumores de 4T1 (Figura 3B). De acordo com caracterizações anteriores [6], Ly6G
-Ly6C
+ células tinham morfologia de monócitos, Ly6G
+ Ly6C
+ teve a morfologia dos neutrófilos e Ly6G
+ Ly6C
– células tinham a morfologia de neutrófilos maduros. Da mesma forma, esfregaços de sangue de ratinhos portadores de tumor mostraram uma forte expansão dos neutrófilos, os quais foram muito diminuída após a terapia de radiação para o tumor (Figura 3c). Estes dados demonstram que a terapia de radiação dos resultados de um tumor num reversão particular de expansão dos neutrófilos impulsionado-tumoral.
a) A citometria de fluxo de sangue periférico inteiro fresco a partir de i) murganhos sem tratamento prévio ou ratinhos portadores de tumores 4T1 ii) deixado sem tratamento ou iii) irradiados, mostrando Ly6C e Ly6G dentro CD11b fechado
+ Gr1
populações mielóides hi. iv) histogramas de expressão Ly6C em condomínio fechado CD11b
+ Gr1
hiLy6G
+ células, incluindo coloração controle negativo (FMO) e mostrando a percentagem Ly6C
– em ratos irradiados no tumor (Tumor RT) ou o membro oposto (tumor Perna RT). v) A percentagem de CD11b
+ Gr1
hiLy6G
+ células que são Ly6C
– de ratinhos ingénuos (sem tumor) e camundongos dia 24 após a injecção de 4T1 não tratada (Tumor NT) ou tratados começando no dia 14 com 3 doses diárias de 20 Gy de radiação focal para o tumor (tumor RT) ou para o membro oposto não envolvido (tumor Perna RT). Cada símbolo representa um mouse. b) cytospins da ordenada CD11b
+ Gr1
células hi de ratos não tratados que são i) Ly6C
+ Ly6G
-, ii) Ly6C
+ Ly6G
+, ou iii) Ly6C
-Ly6G
+. Cada cytospin é mostrado ao lado da pureza trama espécie com maior ampliação na caixa de inserção. c) Wright-Giemsa de esfregaços de sangue d24 de i) camundongos normais (sem tumor) e camundongos dia 24 após a injeção de 4T1 ii) não tratada (Tumor NT) ou iii) tratada com início no dia 14 com 3 doses diárias de 20 Gy radiação focal para o tumor (tumor RT). A caixa de inserção é rodado e mostrado em maior ampliação. NS = não significativo; * = P 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,005; **** = P 0,001. Os dados representam várias experiências replicadas; cada subfigura inclui dados de um experimento de replicação diferente.
expansões mielóides impulsionado-tumorais são ligados ao ambiente inflamatória local e engenharia expressão de GM-CSF [23] ou IL-1β [24] por cancro células foi mostrado para conduzir a expansão mielóide. Para determinar se a terapia de radiação influenciado números mielóides modulando estas citocinas, analisamos os seus níveis no tumor. Os níveis de GM-CSF, IL-1α e IL-1β não foram alterados no tumor após a terapia de radiação (Figura 4a). Estes dados indicam que o equilíbrio destas citocinas inflamatórias e factores de crescimento do tumor não é dirigir a mudança nos dados mielóides. Embora não possamos excluir a regulação de outros factores de crescimento, talvez seja mais relevante que, após a terapia de radiação os tumores primários são significativamente menores pelo diâmetro (Figura 4bi) e peso (Figura 4Bii). Se nós calcular o número de células no baço por mg de tumor primário, não existe qualquer diferença entre os ratos não tratados e irradiados (Figura 4biii). Assim, mesmo sem regulação do factor de crescimento no local do tumor, uma carga tumoral menor significará menos os factores de crescimento derivados de tumores para influenciar números mielóides. Portanto, estes dados sugerem que a contracção seguinte mielóide citotóxica e terapia citostática é determinada principalmente por flutuações no número de células cancerosas.
a) ensaio de esferas para i) GM-CSF, ii) A IL-1α e iii) IL-1β em homogenatos de 4T1 os tumores no dia 24 após a injecção de 4T1 deixada sem tratamento (NT) ou tratados com início no dia 14 com 3 doses diárias de 20 a radiação focal Gy ao tumor (RT) ou para o membro oposto não envolvido (RT Adv ). b) gráficos desafio d24 seguinte tumor mostrar i) diâmetro da perna ii) o peso do tumor e iii) esplenócitos por baço peso /tumor para camundongos não tratada (NT) ou tratados com início no dia 14 com 3 doses diárias de 20 a radiação focal Gy (RT) . Em cada gráfico, cada símbolo representa um mouse. NS = não significativo; * = P 0,05; ** = P 0,01; *** = P 0,005; **** = P 0,001. Dados são representativos de três experiências em replicado.
subpopulações de células mielóides de camundongos portadores de tumor pode exercer efeito supressor sobre a função das células T
in vitro
. Por esta razão, nós examinamos as células T no baço após a terapia de radiação. Devido à expansão mieloide no baço, as células T são uma porcentagem menor de esplenócitos; no entanto o número total de células T CD8 não era diferente do tumor em ratinhos portadores ou após a terapia de radiação do tumor (Figura 5a). Que as células T CD8 permanecer constante, enquanto as células mielóides aumentar os resultados num mielóide dramaticamente distorcida: proporção de células T – no baço a razão aumenta a partir de uma média de cerca de 1,7 CD11b
+ por CD8
+ a 29 CD11b
+ por CD8
+ (p 0,001). O resultado da diminuição induzida por radiação nas células mielóides é uma melhoria no mielóide: CD8 no baço – a 20 CD11b
+ por CD8
+ (p 0,01) – sugerindo um potencial pouco melhorado para iniciar
de novo
respostas imunes. Consistente com os dados nas células T CD8 +, não houve alteração no número de células não-reguladora T CD4 em ratos portadores de tumor e ratinhos tratados em comparação com controlos (Figura 5b). No entanto, a carga tumoral e terapia de radiação é acompanhado por um aumento no número de células T reguladoras (T
reg) no baço (Figura 5B), tal como medido por CD4
+ células que expressam CD25 e FoxP3 (Figura S1 ). Curiosamente, a terapia de radiação aumentaram significativamente a proliferação de células T CD8 + e células T CD4 não-reguladoras (Figura 5C) tal como medido pela expressão de Ki67 (Figura S1), o que sugere que as respostas imunitárias endógenos podem ser mais activos no baço após a terapia de radiação do tumor primário.