Abstract

Em trabalhos anteriores temos documentado a translocação nuclear de NOS endotelial (eNOS) e sua participação em complexos combinatórias com receptor de estrogênio beta (ERP) e fatores induzíveis hipóxia (HIFs) que determinam localizadas cromatina remodelação em resposta ao estrogênio (E2) e estímulos hipóxia, resultando em regulação da transcrição de genes associados com prognóstico adverso no cancro da próstata (PCA). Para explorar o papel da eNOS nucleares na aquisição de fenótipo agressivo em APC, realizamos ChIP-Sequencing em eNOS associada à cromatina a partir de células de um tumor primário com resultados pobres e a partir de células LNCaP metastáticos. Descobrimos que: 1. as regiões eNOS-bound (picos) são amplamente distribuídas em todo o genoma abrangendo vários fatores de transcrição sítios de ligação, incluindo elementos de resposta de estrogênio. 2. E2 aumentou o número de picos, indicando hormono-dependente eNOS re-localização. 3. Distribuição de pico foi semelhante com /sem E2 com ≈ 55% deles em regiões do DNA extragênicos e um envolvimento intrigante de domínio 5 ‘de vários miRs desregulados em CaP. Numerosos potencialmente novos genes eNOS-alvejados foram identificados sugerindo que eNOS participa na regulação dos conjuntos de genes grandes. A descoberta paralelo de regulação negativa de um conjunto de miRs, incluindo miR-34a, em células CaP associados com pior prognóstico nos levou para desvendar uma ligação molecular entre eNOS e SIRT1, um regulador de epigenética do envelhecimento e tumorigenicidade, regulada negativamente por miR-34a e por sua vez, ativando eNOS. E2 potencializa miR-34a regulação negativa aumentando assim a expressão de SIRT1, que descreve uma interação romance eNOS /SIRT1 aperfeiçoá-lo pela sinalização ER E2-activado, e sugerindo que eNOS pode desempenhar um papel importante na CaP agressiva

Citation:. Nanni S, Aiello A, Re A, Guffanti A, Benvenuti V, Colussi C, et al. Perfil Dinâmico (2013) dependentes de estrogénio de Enos-DNA Associações no câncer de próstata. PLoS ONE 8 (5): e62522. doi: 10.1371 /journal.pone.0062522

editor: Costanza Emanueli, da Universidade de Bristol, Reino Unido

Recebido: 20 de dezembro de 2012; Aceito: 22 de março de 2013; Publicado em: 03 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Nanni et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Associazione Italiana Ricerca sul Cancro a AFA; Ministério da Educação, Universidade e Bolsas de Investigação italiano: PRIN 2008NY72SJ e FIRB RBFR087JMZ a AFA e FIRB RBFR10URHP para s.n. V.B. é destinatário de uma FIRC (Federazione Italiana Ricerca sul Cancro) Fellowship. A. A. é suportado por financiamento do Susan G. Komen para a fundação da cura. CG. investigação é apoiada pelo Centro LOEWE para celular e Terapia Genética, Universidade Goethe, Frankfurt (DE). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações: co-autor AG é um empregado srl Genomnia e a Fé é um consultor de Genomnia srl. Os co-autores CG ad MCC são PLoS ONE membros do Conselho Editorial. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O óxido nítrico (NO) e suas sintases atingido celebridade entre oncologistas por causa da evidência de desregulamentação freqüente de produção de nO em vários tumores, incluindo o câncer de próstata (PCA, [1], [2], [3] e da descoberta de um papel-chave desempenhado pela nOS endotelial (eNOS) na manutenção e progressão tumoral [1 ], [3], [4] os nossos resultados experimentais anteriores forneceram demonstração do papel fisiopatológico da eNOS em três contextos celulares:. as células normais humanas endoteliais (HUVEC) antes e após o tratamento com 17β-estradiol (E2); culturas de células epiteliais . a partir de explantes CaP cultivadas em condição basal ou com E2; e amostras de tecido da próstata de pacientes com CaP microscopia confocal e de imunohistoquímica têm documentado, em particular, eNOS translocação nuclear em todos os três modelos experimentais [1], [5] e forneceu as seguintes provas: (i) a sinalização eNOS-nO “nuclear” é uma via fundamental na resposta das células endoteliais a estímulos angiogénicos e na aquisição de um fenótipo mais agressivo na APC; e (ii) a existência e papel funcional dos complexos combinatórias cruciais na cromatina, eNOS /ERa especificamente envolvidas na manutenção da homeostasia vascular [6], [7] e da eNOS /RpE, eNOS /HIF-1α ou eNOS /HIF-2α especificamente associado a evolução clínica adversa do CaP [1]. No modelo de tumor, estes complexos determinar localizada remodelação da cromatina em resposta ao estrogénio e hipóxia estímulos, resultando na regulação da transcrição de genes alvo de prognóstico [1]. Se eNOS e os seus parceiros estão presentes como uma constelação de coordenar complexos ou sob a forma de um complexo de macro-multifactorial continua a ser avaliada.

Nos últimos anos, um papel relevante no cancro humano iniciação, progressão e metástase tem também sido atribuído a desregulação dos microRNAs (miRs) [8], [9]. Como a expressão de genes alvo prognóstico é regulada no âmbito do PCA é atualmente sob investigação, embora vários relatórios [10], [11], [12], [13], [14] identificaram os clusters altamente relevante para o câncer de próstata. Aqui nós temos expandido sobre este aspecto, documentando uma regulação baixa significativa de um conjunto de miRs, exclusivamente em células CaP associados com a evolução clínica adversa (células G1). Este cluster compreende miR-34a, o primeiro miR identificado como um regulador da deacetilase SIRT1 [15] um controlador de epigenética crítica do envelhecimento e tumorigenicidade [16].

De nota eNOS e NO também foram envolvidos no processo de envelhecimento, uma observação relevante uma vez que o envelhecimento é considerado um fator de risco independente em várias condições patológicas. Durante o envelhecimento, eNOS é frequentemente desregulado e os habituais NO biossíntese transformada para a produção de radicais livres. Este efeito contribui para danos no DNA e instabilidade genômica prestação de um terreno favorável para o desenvolvimento do câncer. Na verdade eNOS foi recentemente associada à manutenção de câncer pancreático [4] e à progressão do CaP [1], um dos tipo de câncer mais comum em idosos. Curiosamente, o papel da eNOS durante o processo de envelhecimento está estritamente relacionada com a função de SIRT1. Em condições fisiológicas, SIRT1 ativa eNOS por desacetilação. Envelhecimento, por prejudicar a função SIRT1 determina a eficiência metabólica da glicose reduzida, bem como uma diminuição da produção de níveis de NO apropriados, deteriorando assim o ambiente intracelular.

Estas instalações, juntamente com a nossa conclusão inicial de que o NO via representa uma “

primum movens

“de um programa de transcrição promover a aquisição de um fenótipo agressivo em células APC, e que a translocação nuclear de eNOS afeta significativamente cromatina remodelação de um subconjunto específico de genes prognósticos CaP [17], nos levou a investigar o potencial desta molécula sinalizadora chave como gene mestre na progressão do cancro da próstata. Nosso objetivo e desafio foram para desmascarar a função de eNOS em uma escala de todo o genoma de uma abordagem ChIP-Sequencing, com a esperança de desvendar um mecanismo geral associada com a presença de eNOS nucleares em tumores da próstata. Aqui nós apresentamos evidência experimental que define um circuito molecular que contribui para CaP agressivo e metastático e pode ser modulada por inibidores da eNOS ou SIRT1 com potencial impacto sobre as terapias atuais para CaP.

Métodos

Hormones and inibidores

17β-estradiol (E2 Sigma), NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME; Alexis), TSA (Sigma-Aldrich), MS275, MC1568, sirtinol, o resveratrol foram um presente do tipo de Antonello Mai (Roma, Itália) |

Os anticorpos

anti-ERa (HC-20 [Santa Cruz Biotechnology];. anti-ERP (L-20 [Santa Cruz Biotechnology], anti- eNOS (eNOS /Tipo NOS III [BD Biosciences]; Abcam, Cambridge, Reino Unido e Cell Signaling, MA, EUA), anti-HDAC1 (Abcam, Cambridge, Reino Unido e da Sigma-Aldrich, MO, EUA), anti-HDAC2 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-HDAC3 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-HDAC4 (Abcam, Cambridge, Reino Unido e Santa Cruz, CA, EUA); anti-HDAC5 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) anti -SIRT1 (Abcam, Cambridge, Reino Unido); anti-IgG (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-5-metilcitidina (Eurogentec, Seraing, Bélgica), anti-α-actina (Sigma-Aldrich), e anti- HSP70 (StressGen Biotechnologies, San Diego, CA).

Cultura celular

HUVEC e LNCaP células foram cultivadas como descrito [1], [5]. culturas de câncer de próstata primário foram obtidos a partir de recém-explantados espécimes de câncer de próstata após a aprovação da Comissão de Ética Institucional, conforme descrito [17]. PCA-células imortalizadas foram obtidas por transdução de antigénio T grande de SV40 e hTERT como descrito [1]. Os dados clínicos de pacientes incluídos no presente estudo já foram relatadas em outros lugares [17]. O resultado dos doentes (sobrevivência, metástase, locais e /ou recorrência bioquímica) foi seguido até dezembro de 2012 (período de observação, Julho de 2002 a Dezembro de 2012). grupo de mau prognóstico (G1) de pacientes com PCA foi definida pela presença de recorrência bioquímica /local, metástase, ou mortalidade específica da doença, eo grupo bom prognóstico (G2) foi definido por remissão completa com a cirurgia sozinha. As linhas celulares derivadas de pacientes foram atribuídos proporcionalmente ao G1 (C1IM, C11IM, C13IM, C19IM, C27IM, C43IM, C45IM) ou G2 (C14IM, C24IM, C25IM, C35IM, C38IM, C39IM, C40IM, C41IM) fenótipos.

transfec�es, extractos celulares e Western Blot

as transfecções transientes foram realizadas pela técnica Jet Pei ™ (Poly Além disso transfecção). eNOS vector encoding S1177A foi um presente de CM Counter (Duke University Medical Center, Durham, EUA) [4]. Os extractos totais para imunoprecipitação Co-IP foram obtidos com EUA tampão (Tris-HCl 50 mM pH = 7,5; EDTA 5 mM; NaCl 250 mM; Triton 0,1%; NaF 50 mM), as fracções nucleares e citoplasmáticos foram obtidos como descrito anteriormente [18 ].

Tratamentos

As células foram tratadas com 10

-7 M E2, 5 mM L-NAME, 500 nM TSA, 500 nM MS275, 10 mM MC1568, 10 mM sirtinol, 25 uM resveratrol, isoladamente ou em combinação para os tempos indicados nas legendas das figuras. Pelo menos 72 horas antes da utilização experimental, as células foram mudadas para meio suplementado com soro privados de hormona [19].

chips e Re-chips

chip e re-chip ensaios de cultura As células foram realizados como descrito [1], utilizando anticorpos específicos para o RpE, eNOS, SIRT1, HDAC1, HDAC 3, HDAC 4. Os controlos negativos foram ausência de anticorpo (NoAb) ou IgG normal. Análise de metilação, utilizando o anticorpo anti-5-metilcitidina foi realizada como descrito em [5]. Os fragmentos de ADN foram recuperados e analisados ​​por quantitativa PCR em tempo real, tal como descrito [1]. Iniciadores são apresentadas na seção suplementar.

para Chip-sequenciação, os chips foram realizadas como descrito [1], [6] com modificações. Resumidamente, as soluções de cromatina foram preparados por ultra-sons utilizando Bioruptor UCD-200 (Diagenode) para se obter fragmentos de ADN entre 150-500 pb de comprimento. Pré-compensação de solução da cromatina foi realizada com proteína G-agarose (Pierce) e a recuperação de complexos imunes com proteína G saturadas com BSA numa concentração final de 1 ug /uL. Imunoprecipitadas e amostras de DNA de entrada foram dissolvidos em duas vezes destilada H

2O. Validação de DNA antes da sequenciação foi realizada por qPCR utilizando primers específicos para os promotores hTERT e PS2 (ver secção Suplementar).

Biblioteca Preparação, Chip-Sequenciamento e Análise de bioinformática

preparação biblioteca

NGS e sequenciação sólido, foram realizados em Genomnia. As amostras de ADN em 50 ul de Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8 foram cortados utilizando o Sistema S2 Covaris ™, com os seguintes ajustes: ciclo de trabalho de 10%, intensidade de 5%, ciclos /disparo 200, tempo de ciclo de 60 s , número de ciclos 3. tamanho DNA após tosquia, verificado no Bioanalyzer, foi 25-400 nt com um pico de cerca de 140 nt. Sheared ADN (50 ng) foi reparado nas extremidades e ligado utilizando o kit de ligação rápida (New England Biolabs) a 27 pmoles do adaptador multiplex P1 e 27 pmoles de uma (diferente para cada ligação) de P2 multiplex adaptadores de cadeia dupla com código de barras (sólido ™ Fragmento Biblioteca Oligos Kit, Applied Biosystems pn 4.401.151). As amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos, purificado utilizando o Kit de Agencourt® AMPure®, e nick-tradução foi realizada na não-ligado extremidades 3 ‘. Finalmente moléculas da biblioteca foram amplificados por PCR durante 15-17 ciclos e purificados utilizando o Kit de Agencourt® AMPure® tal como descrito antes. As amostras foram quantificadas utilizando kits Qubit dsDNA SH ou Br e verificado no Bioanalyzer (Agilent Technology) usando um chip de ADN 1000. Para obter a ligação e a amplificação clonal de fragmentos de bibliotecas na superfície de grânulos de sequenciação, as bibliotecas de ADN 8 reunidas foram adicionados à emulsão de reacção PCR realizada de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems). Após a amplificação, a emulsão foi quebrado com butanol, grânulos foram enriquecidos para grânulos positivos modelo, 3’-end estendida e covalentemente ligado para um slide sequenciamento, e sequenciado usando as configurações padrão no sólido sistema versão 3.5 para produzir 50 nucleotídeos longo lê.

Mapeamento do sequenciamento de dados

Mapeamento do sequenciamento espaço de Cor lê o genoma de referência (UCSC Homo sapiens hg19 da UCSC) foi realizada com o Lifetech Lifescope conjunto de software 2.5.1 bioinformática, depois de “um priori “a correcção de erros com o procedimento SAET. Os arquivos de alinhamento resultantes (de entrada de pares e experiência) em formato standard.bam foram analisados ​​para o pico de chamar diretamente com a versão do software MACS 1.4.1 [20]. Além disso, the.bam alinhamentos foram convertidos para o formato the.bed com o utilitário bedtools bamToBed e utilizada para chamar de pico com o software de análise de sicer [21], a fim de ter em conta a natureza heterogénea de ADN destes – interacções de proteína que pode incluir bastante longos áreas de interacção. Todos os cruzamentos entre os arquivos de cama Macs e sicer e características do genoma foi realizada com o conjunto de software bedTools v2.17.0 (https://code.google.com/p/bedtools/).

Peak Identificação

a análise do seqüenciamento e mapeamento resultados, da qualidade de pico MACS, da anotação relativa e ainda pico chamado exploratória de dados foram realizadas com o pacote comercial de software de bioinformática Integromics SeqSolve. Correlação dos Macs e sicer picos (Experiment

contra

entrada) com a estrutura gene conhecido NCBI RefSeq e anotação foi realizada com internos em scripts Genomnia Perl ou com a biblioteca ChIPpeakAnno Bioconductor, versão 2.10 [22]. análise de pico diferencial foi realizada com a rotina SICER-df.sh do software sicer ou com a biblioteca Bioconductor DiffBind [23], complementado por in-house scripts perl Genomnia. Remoção de (falsos positivos) regiões aberta cromatina foi realizada utilizando “Uma coleção completa de regiões artefato sinal de lista negra no genoma humano”, Anshul Kundaje, ftp://encodeftp.cse.ucsc.edu/users/akundaje/rawdata/blacklists/hg19 /). teste estatístico associado com características de sequência (avaliação de SST e comprimento de pico diferenças médias) foram avaliadas com o teste t de duas amostras Welch na linguagem estatística versão R 2.15.1. análises estatísticas ligadas de seqüência, incluindo cálculos de densidade tag do kernel, foram realizadas com as rotinas estatísticos apropriados e bibliotecas da versão 2.15.1 linguagem estatística R (https://www.r-project.org/). dados de sequenciamento de curto ler e as informações experimento associado tenham sido depositados no banco de dados do EBI ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) com o número de acesso E-MTAB-1204.

SIRT atividade

a atividade enzimática foi avaliada com kit de ensaio de HDAC (Upstate) de acordo com as instruções do fabricante usando 40micrograms de extratos totais.

microscopia confocal

análise confocal foi realizada como descrito anteriormente [1]. Amostra foram analisadas com um Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscópio com 63x de ampliação. Para cada uma das amostras de 10 campos independentes foram analisadas e imagens representativas são mostrados. máscara de co-localização foi obtido por software LSM510 para produzir imagens que contêm regiões exclusivamente colocalized.

Exiqon microarrays e Análise de Dados

purificação de RNA total, incluindo miRNAs, foi realizada utilizando o kit miRNeasy (QIAGEN) e amostras foram imediatamente armazenados a -80 ° C. quantificação e integridade do RNA foi avaliada usando Nanodrop e Agilent 2100 Bioanalyzer. Somente amostras com um número de integridade do RNA (RIN) 8,0 foram levados para análise. Um total de 500 ng de RNA a partir da amostra de referência e foi marcado com Hy3 ™ e ™ hY5 marcador fluorescente, respectivamente, utilizando o kit de marcação poder matriz miRCURY ™ LNA (Exiqon, Dinamarca) seguindo o processo descrito pelo fabricante. O Hy3 ™ marcado com amostras e uma hY5 ™ marcado com amostra de RNA de referência foram misturados por pares e hibridado com a miRCURY ™ LNA matriz versão 5

th Generation (Exiqon, Dinamarca), que contém sondas de captura dirigidos a todos os miRNAs para o homem , rato ou rato registrado no miRBase versão 16.0 do Instituto Sanger. A hibridação foi efectuada de acordo com o manual de matriz miRCURY ™ LNA usando uma estação de hibridação Tecan HS4800 (Tecan, Áustria). Após a hibridação os diapositivos de microarray foram digitalizados e armazenados em um ambiente livre de ozono (nível de ozono inferior a 2,0 ppb), a fim de impedir que o potencial de branqueamento dos corantes fluorescentes. As lâminas de matriz de microarray miRCURY ™ LNA foram digitalizadas utilizando o Sistema G2565BA Microarray Scanner da Agilent (Agilent Technologies, Inc., EUA) e a análise de imagem foi realizada utilizando o software Imagene 9,0 (BioDiscovery, Inc., EUA). Os sinais quantificados foram fundo corrigida (Normexp com valor de deslocamento 10 [24] e normalizada usando o Lowess global (Scatterplot localmente ponderadas Smoothing) algoritmo de regressão. Expressão diferencial de miRNAs entre os grupos foi realizada utilizando um teste t de uma cauda após o qual um

p

valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo um total de 52 miRs foram usadas para gerar um mapa de calor onde as cores vermelho e verde indicam alta e baixa expressão, respectivamente, uma análise de agrupamento supervisionado bidirecional foi realizada utilizando correlações de Pearson.. e os critérios de Ward como uma regra de ligação. linha celular C27IM foi hibridizada duas vezes com correlação = 0,92. Microarrays dados foram depositadas no banco de dados Curie em https://microarrays.curie.fr/, nome de usuário e senha de login estão disponíveis mediante solicitação .

miRNA maduro e pri-miR Detecção

a transcrição reversa foi realizada de acordo com o método do fabricante protocolo utilizando TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). PCR em tempo real foi realizado três vezes, em duplicado, num ABI Prism 7500 ou 7900 Sequence Detection System HT (Applied Biosystems). quantidade relativa de cada amadurecer miR ou pri-miR foi medida como mudança de vezes utilizando o 2

-ΔΔCt método (RNU6B ou RNU19 e β-actina ou GAPDH serviu como controle endógeno, respectivamente).

Estatísticas

A análise estatística foi realizada utilizando Prism 2.01 software de estatística (GraphPad). As diferenças entre os grupos sujeitos foram avaliados por 2 caudas teste de Mann-Whitney U e teste t de 1 de cauda de Student. Um intervalo de confiança de 95% (P 0,05) foi considerado significativo. Os dados estão representados como gráficos de caixa de parcelas (caixas mostram as medianas e os quartis superiores e inferiores dos dados e suiças indicam os valores mínimo e máximo), como média ± SEM ou como vezes de indução (+/- tratamento), como indicado em legendas de figuras.

resultados

Genome-wide perfil de eNOS de ligação Eventos em células cancerosas da próstata

Nós documentados anteriormente que, em células de câncer de próstata eNOS transloca para o núcleo em resposta ao estrogênio, um processo inibida por anti-estrogénios, [5]. Aqui mostramos por microscopia confocal que esta re-localização dependente de estrogénio é também eficazmente prevenida por L-NAME, um inibidor de eNOS (Figura S1). Esta constatação apoia fortemente uma relação causal entre a atividade da eNOS, a produção de estrogênio e de sinalização.

Nossas perguntas abertas foram

i.

Como eNOS desempenhar um papel no câncer de próstata em condições basais ou em resposta a estrogénios e, por extensão, no programa de transcrição dependentes de estrogênio associado ao câncer de próstata fenótipo agressivo ?, e

ii.

Será que a função eNOS nuclear envolvem interações moleculares com proteínas capazes de modificar a estrutura da cromatina e alterar a transcriptoma em células de câncer de próstata que respondem ao estrogénio? Para responder a estas questões cromatina imunoprecipita�es acoplados a enorme sequenciamento paralelo (ChIP-seq) foram realizadas antes e após o tratamento com 17β-estradiol (E2, 10

-7M) em duas linhas celulares:

i

. C27IM células derivadas de um cancro da próstata primário com um fenótipo agressivo e bem caracterizados por imunofenotipagem, marcadores citogenéticos, o crescimento e a formação de colónias, a amplificação do gene, do gene ARNm e perfil miR [1], [17], e

ii

. em células LNCaP, uma linha de células de próstata humana derivada de um nódulo linfático metástase [25], assim representativa do fenótipo “metastático”. A capacidade de resposta mantida destas células para hormonas esteróides sexuais, ambos os andrógenos e estrógenos [19], [26], torna-os um controlo optimizado para um tumor primário hormone-responsive agressivo, mas ainda não metastático.

O objetivo da nosso estudo foi identificar, no microambiente da próstata, os alvos de transcrição primários de E2 sinalização associada com eNOS. Estamos focados em um tratamento hormonal curta (45 min), com base em estudos anteriores por nós e outros que indicou claramente neste momento como ideal para seguir os efeitos primários e imediatos de transcrição E2-dependente, antes da ativação de alvos secundários [1 ], [6], [19], [27], [28].

eNOS ChIP-seq foi conduzido e eNOS associada DNA regiões (picos) foram identificados utilizando dois algoritmos, os Macs 1.4.1 ( versão Linux ou incorporado na SeqSolve software ™ comercial de Integromics) e sicer v1.1, para minimizar o viés de pico de chamadas e considerar a natureza ‘estendido’ da interacção de complexos eNOS /ER com cromatina [20], [21] . análise diferencial de chamados picos ou regiões alargadas (ilhas) também foi realizada por dois métodos, comparando e intersectando os resultados, para as mesmas razões (ver Métodos e [22], [23], [29], [30]).

O número de sequenciação e lê-eNOS de ligação de eventos para cada linha de células, não tratado ou exposto a E2

, estão mostrados na Tabela S1. Sob ambas as condições, os picos de ADN contendo eNOS estão amplamente distribuídos em todo o genoma com regiões conservadas hiperdensidade, como mostrado sobreposto ao ideograma cromossoma humano para ambas as linhas celulares (Figura S2). Este padrão, que lembra a distribuição genômica de sítios ERE descritas por Carroll

et al.

[31], apoia nossas descobertas anteriores da existência de complexos eNOS /ER [1], [5], [6] .

Foram identificados pela análise MACS chamada pico em células C27IM e LNCaP, respectivamente 12.034 e 2.344 picos eNOS associados antes do tratamento E2 e 57,802 e 34.560 em seguida (Tabela S2). De nota, a remoção de regiões de cromatina abertas conhecidas para gerar falsos positivos em experimentos Chip-seq (as chamadas “regiões ultra-alta artefato sinal”) deixou substancialmente inalterados os resultados em termos de número de pico: 11.694 e 2.333 em C27IM não tratada e células LNCaP e 57.616 ou 34.451 em células C27IM e LNCaP após tratamento E2 (Tabela S2 e Figura 1A) (ver Métodos e [32].

a) diagrama de Venn das regiões que exibem eNOS-recruitment na ausência ( NT) ou na presença de estradiol (E2). Número de discretas genômicas picos eNOS-recrutamento identificadas por Chip-Seq em C27IM_NT e C27IM_E2 (à esquerda), LNCaP_NT e LNCaP_E2 (à direita) usando análise de MACS (FDR 0,1 e valor P p 1e-5). Sobreposição entre picos em NT e E2condition foi determinada utilizando limiar de 1 nt. B) distribuição de comprimento de picos eNOS em C27 IM_NT, C27 im_ E2 (esquerda) e LNCaP NT, LNCaP E2 (direita). Os dados são apresentados como gráficos de caixas sobrepostas de comprimentos de pico para E2 tratada (preto) ou não tratados (cinzento). linha preta é os picos E2 comprimento médio, linha cinza é os picos NT comprimento médio. p 2.2e-16 NT vs E2. C) Carta de torta da distribuição eNOS-picos nas regiões intra /extragenic (esquerda) ou de distância de TSS (direita). Números em percentagem representam valores min-max em cada categoria. D) Diagrama de Venn do MACS-picos em C27IM_E2 e LNCaP_E2. Sobreposição entre eNOS picos foi determinada utilizando limiar de 1 nt. E) A validação por PCR quantitativa de ChIP-seq eNOS-picos. A ligação eNOS foi monitorada em 9 regiões genômicas, a especificidade foi avaliada em uma região “vazio” (região sem eNOS picos) do cromossoma 5. Os dados representam a média +/- SEM de 3 experiências independentes. * P . ENOS_E2 0,05 vs eNOS_NT

Claramente mediante tratamento com estrogénios o número de picos aumentou significativamente (4.8- e 14 vezes em células C27IM e LNCaP, respectivamente) que indica uma específica dependente de hormonas eNOS re-localização ao longo do genoma. Uma comparação de sequências quantitativa dos picos da eNOS associada antes e após o tratamento E2 revelou a existência de picos sobrepostos entre as duas condições, (6,805 picos comuns em C27IM e 1368 em células LNCaP (Figura 1A). A sobreposição correspondente de 5.190 e 1.630 genes células C27IM e LNCaP, respectivamente, também foi encontrada para eNOS picos associados com o gene mais próximo como anotados no banco de dados NCBI RefSeq incorporado no navegador UCSC Genome (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) (dados não mostrados). Os picos sobrepostos (e genes associados), portanto, representam um sub-conjunto de regiões eNOS-bound que não são sensíveis ao tratamento estradiol, sugerindo interações eNOS com proteínas outros do que ER.

em a outra extremidade, a maioria dos picos são sensíveis a E2, resultando em indução de

de Novo-

eNOS genoma de ligação (50,811 picos em C27IM e 33.083 em LNCaP) ou descolamento (4.889 picos em C27IM e 965 em LNCaP ). de interesse, em ambos os casos, vários picos eNOS MACS induzidas pelo estradiol existem

per

gene. Em células tratadas com E2 a maioria dos genes alvo da eNOS estavam ligados uma vez ou duas vezes, cerca de 5% foram ligados 3 vezes, e cerca de 9% foram ligados 4 ou mais vezes (Tabela S3). Além disso, a estimulação de E2 a distribuição alterada da eNOS como indicado pelo aumento significativo do comprimento de pico depois do tratamento E2 sugerindo uma estabilização complexo de ADN-eNOS /ER após tratamento hormonal (Tabela S2 e Figura 1B).

Distribuição de eNOS picos em relação ao TSS mais próximo obtido por meio de análise Kernel densidade tag revelou que

i.

sua frequência está centrada no TSS e diminui em ambos os lados com uma clara assimetria para as áreas intragênicos (Figura S3A) e

ii

. tratamento E2 ampliada a área global coberta pelos picos em C27IM e, em menor extensão, em células LNCaP, como mostrado usando uma janela de 10.000 pb, embora os picos mostrou um enriquecimento significativo em torno do TSS seguinte E2 estímulos (Fig. S3B).

Curiosamente, a distribuição de pico global em regiões genômicas anotados foi semelhante em ambas as condições experimentais (+/- E2), com leve prevalência (53-58%) de picos localizados em regiões extragênicos, eo restante em intragênicos regiões, em especial dentro dos intrões (Figura 1C). Tal como mostrado na Figura 1D, houve uma sobreposição considerável entre os picos induzidos por E2 em células C27IM e LNCaP.

A correlação entre o número de sítios identificados por MACS e sicer em ambas as células C27IM e LNCaP revelou uma concordância substancial (ver Métodos ), ainda validado pelos resultados do ensaio de ChIP mostrados na Figura S4. Por exemplo hTERT, um gene alvo de estrogênio, com vários EREs conhecidos [1], [19], [33], [34] mostra picos Macs e E2-aumento ilhas sicer em correspondência para sites bem caracterizados por Chip-qPCR (Figura S4A ); pS2 (TFF1), um gene alvo estrogênio clássica, apresenta-E2 aumento ilhas derivadas de sicer em locais amplificados por Chip-qPCR (Figura S4B); GSTP1, um gene silenciado pelo complexo RpE-eNOS na ausência de ligando [5] mostra picos MACS em correspondência aos locais amplificados por Chip-qPCR, exclusivamente na condição não estimulada (Figura S4C).

Além disso, a matriz de correlação de pares que descreve a ocupação DNA com base na pontuação chamador pico MACS e coordenadas (Figura S5A), bem como a análise de agrupamento hierárquico de ligação de afinidade (heatmap) que mostram afinidades para os sites diferencialmente ligados calculado a partir de dados de contagem de ler e MACS pico coordenadas (Figura S5b) revelou que locais de ligação em cluster primeiro em resposta a E2, e em seguida, de acordo com o tipo de célula. Um total de 692 E2 vs NT diferencialmente representados picos (FDR 0,05). Foram identificados, destes 287 com uma mudança vezes positivo e o restante com uma negativa

Por fim, validou a eNOS ChIP-Seq enriquecimento dados observados após tratamento com estradiol. O efeito E2 foi monitorizada em células C27IM, sem tratamento (NT) ou E2-tratada, utilizando o anticorpo anti-eNOS e ChIP-qPCR em oito promotores de genes previamente identificados ou derivados a partir de análise de perfil de microARN (Figura 1E e Figura 2A abaixo) [1] . Nossos resultados revelam uma correlação significativa entre a presença de Enos-picos, como emergindo de dados do chip-Seq colocadas sobre o tratamento com estrogênio (Figura S4 e

dados não mostrados

), eo recrutamento induzida por estrogénio da eNOS na regiões genômicas mesmos, como avaliadas pelo tradicional ChIP-qPCR. Enriquecimentos foram normalizados para a ausência de anticorpo (noAb), ou um anticorpo não relacionado (Ab IgG). Especificidade do Chip-Seq foi assegurada utilizando primers que amplificam uma região genômica dentro cromossomo 5 falta eNOS picos e mostrando simultaneamente a ausência de eNOS recrutamento por Chip-qPCR clássica.

A) Supervisionado análise de cluster de microRNAs profiling (Exiqon array) para os dois grupos de pacientes definidos por status recorrência (bom ou mau prognóstico). B) Validação pelo quantitativa PCR em tempo real dos diferenciais níveis de miRNAs no G1 (mau prognóstico n = 7) e G2 (Bom 8) grupos prognóstico n =, * p 0,05 G1 vs G2. C) nível diferencial de transcritos primários (pri-MIR) em G1 (n = 7) e G2 (n = 8), * p 0,05 vs G1 G2. Os dados são representados como gráfico de caixa em uma escala logarítmica.

A análise de agrupamento de padrão de miRNAs em células APC.

Com o objectivo de diferenciar o câncer de próstata letal e não-letal e, finalmente, melhorar