Abstract

O câncer de ovário é uma doença altamente letal com mau prognóstico e especialmente em tumores de alto grau. A evidência emergente tem relatado que a sobre-regulação aberrante e activação de GRB7, ERK, bem como FOXM1 estão intimamente associados com aggresivenesss de cancros humanos. No entanto, a interação entre esses fatores na patogênese dos cancros humanos ainda permanece obscuro. Neste estudo, descobrimos que GRB7 (

P Art 0,0001), ERK fosforilação (

P Art 0,0001) e FOXM1 (

P

= 0,001) foram frequentemente aumentada e associado com tumores de grau elevado, assim como uma tendência elevada em associação com a fase do cancro do ovário avançado por análise imuno-histoquímica. Curiosamente, as expressões de GRB7 (

P Art 0,0001), ERK fosforilação (

P Art 0,001) e FOXM1 (

P Art 0,001) mostrou uma significativa padrão de aumento gradual ao longo de Grau 1 a cancros de grau 3 ovarianos. Os estudos bioquímicos usando análise de western blot demonstraram que a expressão ou knockdown de GRB7 aplicadas mostrou GRB7 poderia elevar os níveis de fosforilação ERK e FOXM1, enquanto que a expressão forçada de FOXM1 não poderia alterar os níveis de GRB7 e ERK fosforilação. Mas a inibição da sinalização de ERK pela U0126 ou PD98059 poderia reduzir o nível de FOXM1 em GRB7 que sobre-expressam as células de cancro do ovário, o que sugere que GRB7, ERK e FOXM1 são regulados ordenada. Além disso, a inibição da actividade de ERK pela U0126 ou PD98059, ou diminuição da expressão FOXM1 por Tioestreptona /invasão, crescimento inibiu significativamente a migração de células de tumor

in vitro

e

in vivo

. Coletivamente, nossas descobertas conferir que a segmentação GRB7 /ERK /cascata de sinalização FOXM1 pode ser uma opção terapêutica molecular promissora no combate ao câncer de ovário

Citation:. Chan DW, Hui WWY, Cai PCH, Liu MX, Yung MMH, Mak CSL, et ai. (2012) Segmentação GRB7 /ERK /FOXM1 Sinalização via prejudica agressividade de células do cancro do ovário. PLoS ONE 7 (12): e52578. doi: 10.1371 /journal.pone.0052578

editor: Muy-Teck Teh, Barts A London School of Medicina e Odontologia, Queen Mary University of London, Reino Unido

Recebido: 30 de agosto de 2012; Aceito: 20 de novembro de 2012; Publicação: 20 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Chan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Fundação Wong Verifique Ela Charitable. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a doença mais letal entre todas as malignidades ginecológicas [1], [2]. A alta taxa de mortalidade de câncer de ovário é por causa de mau prognóstico ea maioria dos casos são detectados em fase tardia. cancro do ovário é um tumor heterogénea exibindo uma ampla gama de citológica, clínica e características genéticas alteradas [3], [4]. cânceres de alto grau de ovário são caracterizados por núcleos de alta qualidade, alto índice mitótico, mais agressividade, pouco diferenciado, menos sensível à quimioterapia, bem como baixa taxa de sobrevivência [4], [5], [6]. As características relativamente pior patogênese e clínico-patológico de cancros do ovário de alto grau causar manejo clínico pobres deste tipo de doença. Portanto, compreender os mecanismos moleculares subjacentes podem auxiliar no desenvolvimento de terapia melhor curativo no cancro do ovário agressivos.

proteína ligada ao receptor do factor de crescimento de 7 (GRB7) é um adaptador de sinalização que funciona aos sinais par de receptores de superfície celular para o específico vias de sinalização [7]. evidências emergentes relataram que GRB7 é sobre-expressa e geralmente acompanhada com a sobre-expressão de ErbB2 em cancros humanos [8], [9]. clínicopatológicos análises mostraram que a GRB7 regulada positivamente está associado com o comportamento metastático [8], [10], [11], [12]. Além disso, a activação constitutiva de ERK foi implicada numa variedade de comportamentos tumorigénicas, tais como a proliferação celular, diferenciação, metástase, angiogénese, e quimiorresistência em cancros humanos [13], [14], [15], [16]. Além disso, forkhead Caixa de M1 (FOXM1) tem sido identificada como um factor de transcrição oncogénica, que é frequentemente sobre-regulada em numerosos cancros humanos [17], [18], [19]. Nós e outros descobriram recentemente que a regulação positiva de FOXM1 aumenta a proliferação celular, a migração /invasão e particularmente a sua expressão está envolvida na progressão do cancro [17], [20], [21], [22]. Curiosamente, os três fatores acima parecem convergir para as propriedades cancerígenas agressivas, como de alta qualidade e tumores em estágio avançado, mas a relação de seu mecanismo regulador não foi completamente elucidado. Portanto, a delimitação da interação de seus mecanismos reguladores ajudarão a explorar um potencial alvo terapêutico no cancro do ovário.

Neste estudo, mostramos que as expressões de GRB7, ERK e FOXM1 foram significativamente correlacionados com a progressão de câncer de ovário. Descrevemos também o mecanismo de regulação de GRB7 /ERK /cascata de sinalização FOXM1 ea inibição desta sinalização utilizando o U0126 inibidor químico ou inibidor FOXM1 Tioestreptona poderia notavelmente revogar a ovário migração de células cancerosas /invasão, e

in vitro

e

in vivo

crescimento do tumor. Nossos resultados reforçam a importância do /ERK via GRB7 /FOXM1 nas propriedades tumorigénicas e argumentam esta via para um alvo terapêutico promissor no cancro do ovário de alta qualidade.

Materiais e Métodos

linhas celulares e drogas

Duas linhas celulares de cancro do ovário: A2780cp (presentes do Prof. BK Tsang, Dept. of Obstetrics Ginecologia da Universidade de Ottawa) [23], e OVCA433 (obtidas da American Type Culture Collection, Rockville, MD), bem como dois clones que expressam de forma estável GRB7; C19 em OVCA433 e C15 em A2780cp que foram gerados previamente [12] foram incluídos neste estudo. Todos foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2 em meio essencial mínimo ou meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro bovino fetal a 10%. MAPK /ERK-cinase 1/2 (MEK1 /2) inibidores de PD98059 e U0126, e inibidor FOXM1 Tioestreptona foram obtidos de Calbiochem (La Jolla, CA, EUA).

Plasmídeos e transfecção de células

o pEGFP /GRB7 plasmídeos de expressão foram usadas como anteriormente [12]. Quatro shRNA 29mer Hush shRNA constrói contra GRB7 em pGFP-V-RS vector foram adquiridos de OriGene Technologies para gerar células GRB7 estável knockdown (Cat. No. TG312621, OriGene Technologies, Inc, Rockville, MD, EUA). O não-eficaz de 29-mer mexidos shRNA (TR30013) (OriGene Technologies) foi usado como um controlo negativo. Para FOXM1 knockdown humano, o kit TriFECTa® ARNi que contém três siRNAs segmentação FOXM1 humana foi comprado de IDT (Tecnologias de ADN integrado, Inc., Iowa, EUA). transfecção das células foi realizada utilizando LipofectAMINE 2000 ™ (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os padrões de expressão foram analisados ​​por transferência de Western. O vector parental pEGFP-C1 foi usado como controle do vetor vazio.

imuno-histoquímica e Western Blot As análises

imuno-histoquímica (IHQ) coloração para GRB7, fosforilação ERK e FOXM1 foi realizada em uma matriz de tecido de cancro do ovário (OVC1021) (Pantomics Inc, San Francisco, CA) utilizando anticorpos policlonais anti-GRB7 primária (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anti-fosfo-ERK (Chemicon International, Inc., Temecula, EUA), e anti-FOXM1 (Abcam, Inc., Cambridge, MA, EUA). A percentagem de células imuno-positivas, em tumores e epitélio normal foi avaliado pela proporção de células imuno-positivas variou de 10 a 100%, e a intensidade de coloração pontuada como 0 (negativa), 1 (fraca), 2 (moderada) , 3 (forte) e 4 (marcado). A imunorreactividade para cada caso foi pontuado como uma percentagem das proporções das células imuno-positivas, multiplicada pela intensidade da coloração. A mudança de dobragem de cada coloração foi obtida através da divisão do nível de cada amostra de cancro expressão pelo valor médio de coloração imuno-reactivo ovários normais e cistadenoma misturado limítrofe. A quantificação da coloração imuno-histoquímica foi marcado às cegas, pelo menos, por dois observadores independentes.

Para a análise de transferência de Western, as células foram lisadas com tampão de lise celular (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) contendo Cocktail de Inibidor de Protease (Roche, Indianapolis , IN) e PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo) (Sigma Chemical Co. St. Louise, MO). As amostras foram resolvidas por SDS-PAGE e electrotransferidas para membranas Immobilon-P Transferência de membrana (Millipore Corporation, Bedford, MA). As manchas foram bloqueadas com leite desnatado a 5%, seguido de incubação com anti-GRB7, FOXM1 (Santa Cruz), GFP (Abcam), fosfo-ERK, ERK (Cell Signaling), e

β-

actina (Sigma Chemical Co., St Louis, MO). As manchas foram então incubadas com anticorpo de cabra anti-coelho ou anti-ratinho conjugado com anticorpo secundio de peroxidase de rábano (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH) e visualizados por quimioluminescência aumentada (ECL) (Amersham).

análise de viabilidade celular

a viabilidade celular foi medida por Kit de Proliferação celular II (XTT) por 5 dias de acordo com as instruções do fabricante (Roche). Os dados foram coletados a partir de pelo menos três experiências independentes.

migração e invasão celular Assays

Para quantificar as capacidades migratórias e invasivos celulares de células de cancro do ovário, a migração celular e invasão celular kits de ensaio Transwell (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) foram utilizados neste estudo, de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, 1,5 x 10

5 as células foram ressuspensas em soro de meio de cultura livre (Tioestreptona, PD98059 ou U0126 foi adicionado quando necessário) e semearam-se sobre a câmara superior, ao passo que a forma completa foi colocada na câmara inferior como quimio-atractor . A placa foi incubada a 37 ° C e 5% de CO

2 durante 12 horas para o ensaio, a migração de células e 48 horas para ensaio de invasão de células permitindo que as células passem através dos poros na membrana. A célula migraram e invadiu as taxas foram calculadas após coloração celular e contagem usando pelo menos três campos diferentes para cada filtro transpoço. Os experimentos foram repetidos três vezes.

In Vivo

tumorigenicidade Ensaio

Para examinar o

in vivo

efeitos da U0126 e Tioestreptona sobre o desenvolvimento do tumor, 5 × 10 sc

6 A2780cp células foram inoculados em

BALB /c nu /nu

camundongos fêmeas de 3-4 semanas de idade e em grupos de cinco. A formação de tumores em ratinhos nus foi monitorizada para cada 3 dias. 25 a 50 umol /kg de U0126 ou de 200 a 300 umol /kg i.p. Tioestreptona (Calbiochem, La Jolla, CA, EUA) foi administrado uma vez a cada 3 dias com um total de 4 injecções em cinco ratinhos nu quando o tamanho do tumor tornou-se cada ~ 3 mm de diâmetro. Como grupo controle, DMSO por si só era administrada i.p. para o mesmo tempo de tratamento. Os tamanhos de tumor foram medidos utilizando compassos de calibre de corrediça e foram calculadas pela seguinte fórmula: volume = (largura)

2 * comprimento * π /6. As curvas de crescimento de tumor foram representados graficamente o volume de média ± SEM de tumores de 5 ratos. Os efeitos secundários, tais como alterações de peso corporal foram monitorizados de perto. Todas as experiências com animais foram aprovados pela Universidade de Hong Kong Comissão sobre o Uso de Animais Vivos em Ensino e Pesquisa (CULATR No.2560-11).

Análise Estatística

Os parâmetros clínicos foram analisados ​​pelo SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL). O teste exato de Fisher (para dados paramétricos) eo teste de Mann-Whitney (dados não paramétricos) foram usados ​​para comparar os valores entre os subgrupos. O Student

t

-test foi utilizado para analisar a viabilidade celular, migração /invasão e

In vivo

resultados do crescimento do tumor. A

p

-valor foi considerada significativa quando inferior a 0,05.

Resultados

GRB7, ERK fosforilação e FoxM1 são elevados frequentes no câncer de ovário

relataram anteriormente que GRB7 [12], a fosforilação de ERK e FOXM1 [21] são sobre-expressos em amostras de cancro do ovário em particular em tumores de grau elevado. No entanto, a interacção entre estes factores em cancros do ovário não foi ainda elucidado. Por análise imuno-histoquímica (IHQ) em uma matriz de tecido de cancro do ovário (OVC1021), verificou-se que todos esses fatores foram congruently regulada em amostras de cancro do ovário que era consistente com nossos resultados anteriores [12], [21]. Como esperado, o GRB7 overexpressed ( 4 dobras) foi correlacionada com o aumento da fosforilação ERK ( 2 dobras) (

P Art 0,0001, teste exato de Fisher) e FOXM1 ( 3 dobras) (

P Art 0,0001, teste exato de Fisher) (Tabela 1). Além disso, GRB7 (

P Art 0,0001, teste exato de Fisher), ERK fosforilação (

P Art 0,0001, teste exato de Fisher), e FOXM1 (

P

= 0,001, teste exato de Fisher) foram significativamente correlacionados com tumor de alto grau e tinha uma tendência de alta em associação com o câncer de ovário estágio avançado (GRB7,

P

= 0,021; fosfo-ERK,

P

= 0,065; e FOXM1,

P

= 0,065, teste exato de Fisher) (Tabela 1). Era digno de nota que um aumento progressivo significativo de GRB7 (

P Art 0,001, o teste de Mann-Whitney) ERK fosforilação, (

P Art 0,001, teste de Mann-Whitney) e FOXM1 (

P Art 0,001, teste de Mann-Whitney) padrão de expressão foi observado a partir de grau 1 para grau 3 tumores (Fig. 1A e 1B) e um padrão menos óbvio desde o início de cânceres de ovário fase tardia (Figura S1 ), sugerindo que estes fatores desempenham um papel importante na progressão do câncer de ovário. Tomados em conjunto, estes dados indicam que há uma interação próxima entre GRB7, atividade ERK e FOXM1 na regulação do cancro do ovário oncogênese especialmente em tumores de alto grau.

(A) As expressões de GRB7, fosforilação ERK e FOXM1 foram avaliados por meio de análise imuno-histoquímica utilizando anticorpos específicos em uma matriz de tecido de cancro do ovário (OVC1021, Pantomics). (B) imagens representativos mostram o aumento gradual do GRB7, fosforilação ERK e expressões FoxM1 de grau 1 para grau 3 câncer de ovário (subtipo serosa) (200 × ampliações).

Regulamento Molecular de GRB7 /ERK /FOXM1 sinalização em células do cancro do ovário

Tendo em conta que o aumento GRB7, fosforilação ERK e FOXM1 correlação significativa com tumor de ovário de alta qualidade, eles podem ser regulados coordenadamente a fim de mediar funções oncogênicos na progressão do câncer de ovário . Estávamos, portanto, interessado em investigar o mecanismo de regulação entre esses fatores em células de cancro do ovário. Para este efeito, tanto A2780cp e OVCA433 células foram primeiramente tratadas com U0126 inibidor de MEK1 /2. Western blot mostrou que a fosforilação de ERK e FOXM1 foram notavelmente reduzidas, mas não foi observada nenhuma alteração na expressão GRB7 (Fig. 2A). Além disso, o tratamento de Tioestreptona reduzida com sucesso o nível de FOXM1, enquanto os níveis de fosforilação de ERK GRB7 e ainda permaneceram inalterados (Fig. 2B). Para excluir a função não específica de Tioestreptona no tratamento de dose elevada, a abordagem siRNA mediada knockdown FOXM1 foi realizada em células A2780cp. Semelhante ao tratamento de Tioestreptona, depleção de FOXM1, não alterou a expressão de GRB7 e fosforilação de ERK (Fig. 2B). Isto indica que a supressão da actividade de ERK poderia diminuir o nível de FOXM1, enquanto que a redução da expressão FOXM1 não afecta a expressão ou actividade de ERK GRB7. Para provar ainda mais esta observação, knockdown forma estável de GRB7 endógena em um GRB7 alta expressar linha de células, OVCA433, utilizando abordagem shRNA mostrou claramente que não só GRB7 mas também fosforilação ERK e FOXM1 foram reduzidas (Fig. 2C). Em contraste, a expressão forçada de GRB7 aumento da fosforilação de ERK e FOXM1 em A2780cp e OVCA433 células (Fig. 2D). Por outro lado, o tratamento de qualquer uma ou U0126 PD98059 MEK1 /2 inibidores poderia reduzir não apenas a fosforilação de ERK, mas também em células ectópicas FOXM1 expressando GRB7 (Fig. 2D). Colectivamente, estas descobertas que conferem GRB7 regula positivamente a actividade de ERK positivamente que por sua vez, eleva FOXM1 em células de cancro do ovário.

(A) O tratamento com o U0126 (5 uM) mostraram uma redução significativa na expressão de ERK fosforilação acompanhada com FOXM1 em células de cancro do ovário tempo dependente, ao passo que nenhuma alteração na expressão GRB7 foi encontrado em células A2780cp. (B) Tratamento de Tioestreptona (20 M) notavelmente reduzida a expressão de FOXM1 apenas, mas nenhuma mudança nas expressões de GRB7 e fosforilação ERK em A2780cp células (

esquerdo

). Esgotamento de FOXM1 por siRNA knockdown não alterou a expressão de GRB7 e ERK fosforilação (

direito

). C, siRNA mexidos controle. SI1, SI2 e SI3 siRNAs segmentação três diferentes regiões de FOXM1 humano e a expressão de knockdown FOXM1 em 60%, 45% e 70%, respectivamente. (C) Dois dos quatro GRB7 shRNA constrói (SH1 e SH2) mostrou ~ 70% knockdown de GRB7 acompanhada de uma redução de fosforilação e FoxM1 expressões ERK em OVCA433 células. O controlo scrambled (NC), foi utilizado como controlo negativo. (D) a expressão forçado de GRB7 aumento da fosforilação ERK e FOXM1. No entanto, o tratamento com ambos os U0126 (10 mM) ou PD98059 (20 M) poderia suprimir a fosforilação induzida ERK e FOXM1 em A2780cp e OVCA433 células de cancro do ovário.

supressão da actividade ERK ou expressão FOXM1 Diminui ovário a migração de células cancerosas e Invasion

tem sido documentado que as exposições de tumores ovarianos de alto grau de alta capacidade na migração de células /invasão [4], [24]. Assim, nós saber se a inibição da actividade de ERK ou expressão FOXM1 pelos seus inibidores específicos poderiam influenciar a migração celular e invasão de células de cancro do ovário. Para verificar essa hipótese, uma linha de células de cancro do ovário de alta qualidade, OVCA433, exibindo altas habilidades migratórias e invasivos foi ectopicamente expressa com GFP /GRB7 e tratados com inibidores. Os resultados mostraram que o tratamento de Tioestreptona, PD98059 e U0126 notavelmente reduzida taxa de migração de células de células OVCA433-GRB7 por 3,5 vezes, 2,2 vezes e 2,5 vezes, respectivamente, quando comparado com o controlo (Fig. 3A). Da mesma forma, o tratamento de Tioestreptona, PD98059 e U0126 também reduziu significativamente a taxa de invasão de células de células OVCA433-GRB7 por 3,5 vezes, 2,6 vezes e 2,9 vezes, respectivamente, em comparação com o controlo (Fig. 3B). Estes resultados sugerem que a inibição da GRB7 de sinalização /ERK /FOXM1 é capaz de prejudicar a migração celular e invasão de células de cancro do ovário.

OVCA433 células com expressão estável de GFP /GRB7 (OVCA433-GRB7) foram tratados com DMSO como controlo, Tioestreptona (20 uM), PD98059 (20 uM) e U0126 (10 | iM) durante 6 horas e foram analisados ​​por ensaio de migração de células (a) Transwell. O representante de fotos e gráfico de barras mostrou redução significativa no número de células migratórias através da membrana Matrigel-revestidas em células OVCA433-GRB7 tratados com Tioestreptona, PD98059 e U0126 que o controle DMSO (*

P Art 0,02, Student

t

-teste) às 8 horas; ensaio de invasão de células (B) Transwell. O representante de fotos e gráfico de barras mostrou uma redução significativa na taxa de invasão em células OVCA433-GRB7 tratados com Tioestreptona, PD98059 e U0126, quando comparado com o controle de DMSO (*

P Art 0,05, Student

t

-test) a 15 horas.

Segmentação GRB7 /ERK /FoxM1 Inibe o cancro do ovário Tumor Crescimento

in vitro

e

in vivo

estudos anteriores demonstraram que a activação constitutiva de actividade de ERK ou aumento da expressão de GRB7 e FOXM1 estão intimamente associados com tumorigenicidade de vários cancros humanos [12], [16], [21], [25], [26]. Isto sugere que a segmentação quaisquer componentes nesta cascata de sinalização devem, teoricamente, revogará as propriedades tumorigénicas em células de cancro do ovário. De fato, publicações anteriores relataram que knockdown de FOXM1 e ERK poderia reduzir o crescimento celular e invasão de cancros humanos [27], [28], [29]. Neste estudo, o objetivo foi investigar as alterações tumorigênicos usando inibidores farmacêuticas que visam especificamente cascata GRB7 /ERK /sinalização FOXM1. Assim, em primeiro lugar avaliado o efeito supressor sobre a proliferação celular de linhas celulares de cancro do ovário serosas dois de alto grau; A2780cp e OVCA433 usando U0126 (10 uM). Por ensaio de proliferação celular XTT, tanto A2780cp (

P

= 0,02, Student

t

-teste) e OVCA433 (

P

= 0,03, Student

t

-test) exibiu uma redução significativa na taxa de proliferação celular em comparação com os controlos (Fig. 4a). Da mesma forma, ao tratamento de Tioestreptona (20 mM), A2780cp (

P

= 0,015, Student

t

-teste) e OVCA433 (

P

= 0,025, Student

T

-test) também mostrou uma redução profunda na taxa de proliferação celular em comparação com os controlos (Fig. 4b).

(a) os ensaios de proliferação celular XTT mostrou que a inibição de fosforilação por ERK U0126 (10 M) revogada significativamente a taxa de proliferação celular em GRB7 expressando estavelmente OVCA433 células (

P

= 0,020, Student

t

-teste) e células A2780cp (

P

= 0.030, Student

t

-teste), em comparação com os controles de vetor. (B) Os ensaios de proliferação celular XTT mostrou que a supressão da expressão FOXM1 por Tioestreptona (20 uM) reduziu significativamente a taxa de proliferação de células que expressam estavelmente em GRB7 OVCA433 células (

P = 0,015

, Estudante

T

-test) e células A2780cp (

P

= 0,025, Student

t

-teste), em comparação com os controles de vetor.

a seguir, examinou o

in vivo

atividade tumorigénico do GRB7 em A2780cp por inoculação subcutânea GRB7 e controlo de vectores expressando células A2780cp em um flanco de ratinhos nus. Como esperado, GRB7 expressando estavelmente células A2780cp exibiu crescimento do tumor de 30% mais rápido em comparação com o controle de vetores (

P

= 0,020, Student

t

-teste) (Figura S2). A seguir, investigou o efeito supressor sobre o crescimento do tumor de GRB7 expressando estavelmente A2780cp mediante tratamento de U0126 ou Tioestreptona. Quando o tamanho do tumor atingiu ~ 3 mm de diâmetro em portadores de tumor ratinhos nus no Dia 6, U0126, a 25 e 50 uM /kg foi i.p. injectado na cavidade peritoneal de ratinhos nus para todos os 3 dias. Após 4 tempos de injecção U0126, descobrimos que havia 35% e 72% de redução no tamanho do tumor em comparação com o controle de DMSO no dia 18, quando injetado com U0126 a 25 mM /kg (

P

= 0,032, Estudante

t

-teste) e 50 mM /kg (

P

= 0,005, Student

t

-teste), respectivamente (Figura 5A e 5B). Além disso, quando do tratamento de Tioestreptona de 200 um /kg e 300 um /kg no dia 9, houve 47% e 52% de redução no crescimento do tumor, em comparação com o controlo de DMSO no dia 18, respectivamente, (

P

0,01, Student

t

-teste) (Figura 5A e 5B). Esses resultados mostram que a regulação positiva de GRB7 poderia aumentar o crescimento do tumor, enquanto usando U0126 ou Tioestreptona poderia reduzir eficazmente o crescimento do tumor de células de cancro do ovário, tanto

in vitro

e

in vivo

.

(a) o GRB7 expressando estavelmente células A2780cp (ACP-GRB7) foram injectados por via subcutânea no flanco direito de ratinhos nus. Os ratinhos foram divididos em 5 grupos (cinco ratinhos por grupo) e tratados com DMSO como um controlo, ou U0126 (25 ou 50? M /kg) ou Tioestreptona (200 ou 300? M /kg) para todos os 3 dias, uma vez ao dia 6 (as setas representam as injeções). O tamanho relativo do tumor foi calculada em relação aos do primeiro dia de tratamento (dia 0) e são representados como o tamanho relativo médio (%) ± EP para cada grupo (*

P

= 0. 032, **

P Art 0,01 e ***

P

= 0. 005, são significativamente diferentes do grupo de controlo DMSO, Student

t

-teste). (B) As imagens representativas e gráficos de barras mostram o peso médio do tumor de cada grupo feita no dia 18. (*

P

= 0. 043, **

P

= 0. 001, e ***

P Art 0,02, são significativamente diferentes do grupo de controlo DMSO, Student

t

-teste)

Discussão

neste estudo, apresentamos evidências de que GRB7, fosforilação ERK e FOXM1 são aumentadas no cancro do ovário. Curiosamente, o aumento concomitante de GRB7, fosforilação de ERK e FOXM1 está associada com cancros do ovário de alto grau. É importante salientar, que mostram que esses fatores são coordenadamente regulada no GRB7 /ERK /FOXM1 sinalização eixo em células de cancro do ovário. Funcionalmente, inibindo a atividade de ERK pela U0126 ou PD98059 e expressão FOXM1 por Tioestreptona notavelmente inibir o crescimento de células de câncer de migração /invasão e tumor de ovário

in vitro

e

in vivo

. Essas descobertas claramente evidência de que a cascata de sinalização GRB7 /ERK /FOXM1 activado desempenha um papel importante na patogênese do câncer de ovário de alta qualidade.

A activação constitutiva da via de sinalização ERK tem estado envolvida no desenvolvimento do cancro humano [30] , [31], [32]. De fato, tendo como alvo esta via para combater cânceres humanos tem sido atraído muita esforço para desenvolver medicamentos eficazes para a década passada [15], [33], [34], [35]. Nós e outros descobriram recentemente que GRB7 e sua variante, GRB7v, são frequentemente regulados positivamente em cancros do ovário e são capazes de aumentar a proliferação celular, a migração /activação de invasão através de via de sinalização de ERK [12], [36], [37]. Por outro aspecto, evidências emergentes descobriram que a regulação positiva do factor de transcrição aberrante FOXM1 está envolvida na patogénese de vários cancros humanos [17], [21], [22], [38], [39]. Apesar de todos estes factores de forma aberrante activados são predominantemente associada a patogénese do cancro, existe nenhum relatório de medida de mencionar a ligação de sinalização entre GRB7, actividade de ERK e FOXM1 em células cancerosas humanas. Neste estudo, usando análise de IHC de arranjo de tecido de cancro do ovário, que mostram que GRB7, ERK e FOXM1 fosforilação concomitantemente aumentou em amostras de cancro do ovário. Curiosamente, suas expressões exibem um aumento gradual ao longo do grau do tumor de ovário. De fato, nossa análise de correlação clínico-patológico fornece mais provas de que suas expressões regulada estão significativamente associados com tumor de alto grau. Como sabemos, este é o primeiro relatório que mostra o status desses fatores envolvidos na progressão do cancro do ovário, até agora expressão. Ao todo, estes resultados indicam que GRB7, ERK fosforilação e FOXM1 formar uma convergência oncogênico na patogênese do câncer de ovário de alta qualidade. Portanto, voltadas para esta cascata de sinalização pode conseguir um bom resultado quando o tratamento deste tipo de doenças.

GRB7 é conhecido um adaptador que transmite sinais a partir de receptores de superfície celular específicos para cascatas de sinalização a jusante através da interacção proteína-proteína do seu Src -homology 2 (SH2) de domínio de uma variedade de tirosina-cinases [7], [40], [41]. Nós e outros autores relataram anteriormente que é frequentemente sobre-expressa GRB7 e promove a proliferação celular, a migração celular e invasão de células de cancros humanos [10], [12], [42]. Dado aos seus papéis importantes como moléculas de transdução de sinal na activação de vias de sinalização oncogénicos, vários estudos tentaram desenvolver inibidores de segmentação para o domínio SH2 de GRB7, a fim de inibir a activação aberrante de actividades de sinalização relacionados e eliminação de células cancerosas [43], [44] , [45], [46]. Para exemplos, a combinação de Grb7 péptido cíclico, G7-18NATE, com quimio-drogas eram capazes de inibir o crescimento de células de cancro da mama [47], [48] metástase, ou com o ligando peptídico específico para suprimir GRB7 mediada em carcinoma do pâncreas, etc. [11], [49]. No entanto, a especificidade e a afinidade são os principais obstáculos encontrados no desenvolvimento destes inibidores como agentes terapêuticos alvo GRB7-moleculares [26], [49], [50]. Aqui, os nossos dados mostram que GRB7 regula a actividade de ERK e a expressão FOXM1 ordenada e está de acordo com os nossos relatórios anteriores [12], [21], indicando que o GRB7 sobre-expresso aumenta o crescimento de células de cancro do ovário e da migração de células /invasão por meio de elevação de ERK e atividades FoxM1. Por isso, propusemos que suprimir a ERK activada aberrante e FOXM1 deve exercer efeitos semelhantes de uso de inibidor GRB7 na inibição das propriedades tumorigénicas acima de células de cancro do ovário. Na verdade, o nosso

in vitro

e

in vivo

estudos tumorigênicos mostram claramente que o crescimento de células de câncer de ovário e migração de células /invasão são notavelmente reduzidos após a tratamentos de PD98059 ou U01260 e Tioestreptona via segmentação MEK /atividades FoxM1 ERK e respectivamente. Mais importante ainda, os efeitos supressores de tumor derivado de um U0126 /ou PD98059 Tioestreptona são equivalentes. Estas descobertas parecem fornecer uma abordagem alternativa ao desenvolver terapias GRB7-alvo em câncer de ovário.

Em resumo, este estudo mostra que a activação aberrante de GRB7 /ERK /cascata de sinalização FOXM1 é significativamente correlacionada com o desenvolvimento de câncer de ovário . Segmentação este eixo sinalização por MEK /ERK ou inibidores FoxM1 poderia obter efeito promissor na terapia baseada em transdução de sinal para esta doença.

Informações de Apoio

Figura S1. análise

imunohistoquímica mostraram aumento da expressão de GRB7, fosforilação ERK e FOXM1 foram associados com câncer de ovário estágio avançado.

doi: 10.1371 /journal.pone.0052578.s001

(TIF)

Figura S2.

expressão forçado de GRB7 aumenta o crescimento do tumor no modelo de rato de xenotransplante. O GRB7 expressando estavelmente A2780cp células (ACP-GRB7) e controle do vetor vazio A2780cp células (Pac-V) foram injectados por via subcutânea no flanco direito de ratinhos nus (5 ratos por grupo). O tamanho do tumor foi monitorizado para cada três dias. As imagens representativas e gráficos de barras mostram o peso médio do tumor de cada grupo feita no dia 18. (*

P

= 0,02, Student

t

-teste)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0052578.s002

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos Prof. Guan Jun-Lin, departamentos de Biologia celular e do desenvolvimento, da Universidade de Michigan, para fornecer o GRB7 cDNA de comprimento total.