Abstract

ribonucleoparticule nuclear heterogêneo A1 /A2 (RNPhn A1 /A2) e fator de splicing 2 /fator de splicing alternativo (SF2 /ASF) são fundamentais para o RNA mensageiro precursor (pré-mRNA) splicing. Interferão reguladora do factor de três (IRF-3) desempenha um papel crítico na defesa do hospedeiro contra infecções virais e microbianas. Truncados de IRF-3 proteínas resultantes de splicing alternativo foram identificados e caracterizados como antagonistas funcionais de comprimento completo de IRF-3. Neste estudo, examinou-se o mecanismo molecular para regulação de splicing de IRF-3 pré-mRNA e relatada pela primeira vez o efeito regulador de hnRNP A1 /A2 e SF2 /ASF em IRF-3 splicing e de activação. depleção de RNA de interferência mediada por RNPhn A1 /A2 ou SF2 /ASF no cancro do pulmão de células não-pequenas células humanas (NSCLC) aumentou exclusão de exons 2 e 3 do gene IRF-3 e níveis reduzidos de proteína e IRF-3 expressão IRF- 3 efector a jusante, as moléculas de interferão-beta e CXCL10 /IP-10. Além disso, a ligação directa de hnRNP A1 e SF2 /ASF para motivos de ligação específicos de IRF-1 intrão 3 foi confirmada por ensaio de desvio de mobilidade electroforética do ARN. ensaio minigene splicing posterior mostrou que IRF-3 minigenes com hnRNPA mutante 1 /A2 ou a ligação SF2 /ASF motivos aumento da exclusão de exons 2 e 3. Além disso, knockdown de RNPhn A1 /A2 ou SF2 /ASF em células NSCLC tumorais induzida por fito-hemaglutinina reforçada necrose a libertação do factor-alfa por células mononucleares de sangue periférico (PBMC), mas suprimida a de interleucina-10 em NSCLC /PBMC co-culturas. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que knockdown específico para RNPhn A1 /A2 ou SF2 /ASF aumento exclusão de exons 2 e 3 do IRF-3 pré-mRNA e influenciar as funções imunomoduladoras de células NSCLC humanas

Citation:. Guo R, Li Y, Ning J, Sun D, ​​Lin L, Liu X (2013) RNPhn A1 /A2 e SF2 /ASF Regular splicing alternativo do Interferon Regulatory Fator-3 e afetar as funções imunomoduladores in Human Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 8 (4): e62729. doi: 10.1371 /journal.pone.0062729

editor: Luwen Zhang, da Universidade de Nebraska – Lincoln, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de dezembro de 2012; Aceito: 25 de março de 2013; Publicação: 29 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (Grant No. 30.572.072) para XL e pelo Beijing Municipal Natural Science Foundation (Grant No. 5.092.009) e da National Science Foundation Natural da China (Grant No. 30.871.366) para YL. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Dr. Jinying Ning, como o terceiro autor deste manuscrito, era um empregado da a empresa Crown Bioscience Inc (Pequim). Ele contribuiu com algumas ferramentas de análise e forneceu consultoria para este trabalho. Não há patentes será compartilhada por Crown Bioscience Inc (Beijing). Não há produtos em desenvolvimento e não há produtos comercializados de Crown Bioscience Inc (Beijing) foram utilizados neste trabalho de investigação. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

RNA mensageiro precursor alternativo (pré-mRNA) splicing é um importante mecanismo pós-transcricional pelo qual As células podem gerar um repertório diverso de isoformas proteicas a partir de um número mais reduzido de genes [1]. Estima-se que a maioria dos genes de multi-exões humanos são de splicing alternativo [2]. O splicing alternativo desempenha um papel importante no desenvolvimento, a fisiologia, e a doença e o processo de remoção de intrões selectivamente e união de exões residual é sujeito a regulação exacta e é muitas vezes perturbada em desordens inflamatórias e cancros [3] – [6]. Numerosos estudos têm demonstrado que algumas proteínas de ligação a ARN, podem participar na regulação do processo inflamatório e a tumorigénese através da regulação de splicing de mRNA ou a estabilidade dos genes inflammation- e relacionadas com tumores [4], [6] – [8]. Duas famílias de proteínas de ligação a ARN nucleares, a família de ribonucleoproteínas nucleares heterogêneos (RNPhn) ea família de serina /proteínas ricas em arginina (SR), têm um papel central na regulação do splicing alternativo e estabilidade do mRNA. A família RNPhn contém pelo menos vinte membros e liga-se, principalmente, às seqüências chamados silenciadores de splicing, localizadas em exons (ESSS, silenciadores de splicing ex�icas) ou íntrons (ISSS, silenciadores de splicing intr�icas), para promover a exclusão exão e atuam como repressores splicing [9]. As proteínas mais abundantes e melhor caracterizados deste grupo são hnRNP A1 e PRNhn A2, que partilham um elevado grau de homologia de sequência e homologia funcional [10]. evidências crescentes têm demonstrado que hnRNP A1 e PRNhn A2 são sobre-expressos em vários tipos de tumores e servir como biomarcadores tumorais iniciais [7], [11] – [13]. HnRNP L, como um outro membro da família PRNhn, tem sido relatado para aumentar a produção de citocina pró-inflamatória induzida por TLR, estabilizando ARNm em macrófagos [14]. A família de proteínas SR, outro regulador de splicing alternativo, também inclui mais de vinte membros. Estas proteínas ligam-se potenciadores de splicing que localizam nos exons (ESEs, intensificadores de splicing ex�icas) ou intrões (IES, intensificadores de splicing intrónicas), e predominantemente funcionar como antagonistas de proteínas PRNhn [15]. No entanto, um número de estudos também revelaram que as proteínas SR regular eventos ignorando exão e proteínas SR diferentes mostram actividades opostas na promoção da inclusão exão ou saltar sobre os mesmos genes [16], [17]. fator de splicing 2 /alternative fator de splicing (SF2 /ASF), como o membro melhor caracterizado da família SR, tem sido relatada a ser regulado para cima em vários cancros humanos, incluindo o cancro do pulmão e cancro do colo do útero, e desempenha um papel importante no estabelecimento e manutenção da transformação celular [8], [18] – [20]. Uma pesquisa recente revelou também que SF2 /ASF mediada por IL-17 induzida por a estabilidade do ARNm de quimiocina CXCL1 em ​​células de cancro cervical humano [21].

O factor regulador de interferão continuamente crescente (IRF) família inclui activadores transcricionais e repressores que regular a expressão de genes críticos para a resposta imune, a hematopoiese e a sobrevivência celular [22] – [24]. IRF-3 é única entre os membros da família IRF na medida em que é um transdutor chave directa do ARN de cadeia dupla viral e bacteriana sinalização mediada por lipopolissacáridos [25], [26]. IRF-3 funciona como um activador de transcrição essencial para os interferões do Tipo I (IFNa /p), um subconjunto de genes estimulados com interferão, bem como alguns genes de quimiocinas, tais como RANTES e CXCL10 /IP-10 e desempenha papéis cruciais tanto na imune inata resposta contra a infecção virai e a subsequente activação da imunidade adaptativa [27] – [31]. O gene IRF-3 consiste em 8 exões e intrões 7 e codifica uma proteína de 427 amino ácidos. IRF-3 é uma fosfoproteína e é composto por um domínio de ligação ao ADN N-terminal (DBD) (aminoácidos 1 a 110), um domínio C-terminal de IRF-associado (IAD, aminoácidos 198-374), e um domínio de transactivação (TAD, aminoácidos 134 a 394) [32]. Com os seus papéis críticos na defesa do hospedeiro, a actividade de IRF-3 é estritamente controlada. IRF-3 é amplamente expresso e é predominantemente encontrado sob uma forma citoplasmática inactiva. Após a infecção, o vírus ou ARN de cadeia dupla induz a fosforilação da serina resíduos C-terminais e /treonina conduz a uma alteração conformacional em IRF-3 com a exposição de ambos os domínios DBD e IAD, o que resulta em mais homo ou heterodimerização, cytoplasm- -to núcleo translocação, a associação com coactivators CBP /p300, e ativação da transcrição de vários genes-alvo [33], [34].

a integridade estrutural é essencial para IRF-3 para executar sua função regular em vias celulares miríade , como tem sido demonstrado por alterações funcionais resultantes de splicing alternativo de IRF-3 pré-ARNm. IRF-3-A é o primeiro caracterizado IRF-3 splicing isoforma e sua exão original de 2 encontrados em IRF-3 passa a ter [35] intron 2. proteína IRF-3a carece de uma porção do DBD N-terminal de IRF-3 e é incapaz de se ligar aos elementos IRF clássicos de ligação, tais como elementos de resposta ao IFN-estimulada (ISREs). No entanto, o IRF-3a com um domínio IAD intactos tem sido demonstrado para formar um heterodímero com o IRF-3 após a infecção viral e inibem o IRF-3 actividade de transcrição [36]. Recentemente, foram identificadas cinco novas variantes de splicing de IRF-3, referidos como IRF-3b, -3c, -3D, -3E, e -3f, e revelaram que estas variantes de splicing são gerados por deleção dos exões 2, 3, ou 6 ou alguma combinação destes [37]. Estas novas isoformas de splicing foram predicados a perder toda a região do domínio DBD (IRF-3b, -3c, -3d, e -3f) ou perder partes do TAD e domínios IAD (IRF-3b, -3d, e -3E ). Além disso, também foi demonstrado que estas novas variantes de splicing foram expressos em vários tipos de células e tecidos humanos e pareceu funcionar como moduladores negativos de IRF-3 e reduzir a transactivação do promotor de IFNp em diferentes extensões. Estas alterações estruturais e funcionais estabelecidas devido ao splicing alternativo merecer investigação mais profunda do mecanismo molecular para regulação do splicing de IRF-3 pré-mRNA.

No presente estudo, RNA depleção mediada por interferência do RNPhn A1 /A2 ou SF2 /ASF no cancro do pulmão de células não-pequenas células humanas (NSCLC) aumentou exclusão de exons 2 e 3 do IRF-3 pré-mRNA. Usando análise e programas como o ESE Localizador sequência, identificamos local RNPhn A1 /A2 de ligação (UAGGGA) e sítio de ligação SF2 /ASF (GGAAGGA) no intron 1. teste de desvio de mobilidade eletroforética subsequente IRF-3 (EMSA) usando tipo selvagem ( em peso) sonda de ARN ou de ARN com mutação nestes sítios de ligação e ensaio de minigene de splicing de IRF-3 mutante confirmou a presença de hnRNP A1 /A2 e SF2 /ASF motivos de ligação de IRF-3 no intrão 1. Além disso, a influência da mudança de IRF- padrão de splicing 3 sobre a expressão dos seus genes alvo a jusante e na produção de citocinas em NSCLC /periférico de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de co-culturas também foi avaliada.

Materiais e Métodos

Cultura celular e ARN Interferência

NSCLC humano linhas de células A549 e Calu-6 foram obtidas de ATCC (Manassas, VA). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro inactivado por calor a 10% de bovino fetal (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO

2.

foram seleccionados ARN de interferência pequenos (ARNsi) segmentação hnRNP A1, hnRNP A2, SF2 /ASF, ou do tracto polipirimidina de ligação a proteínas (PTB ou hnRNP I) ARNm e transfecções de siRNA foram realizadas como descrito [7] , [38]. Devido à redundância funcional de hnRNP A1 e PRNhn A2 relatado anteriormente, os siRNAs destes dois genes foram transfectados ao mesmo tempo. Resumidamente, em crescimento exponencial A549 e células Calu-6 foram semeadas em placas de 6 poços (2 × 10

5 células /poço). No dia seguinte, 80 pmol de RNPhn A1 e A2 RNPhn (cada 40 pmol), 40 pmol de SF2 /ASF, ou 40 pmol de RNAs duplex PTB (Beijing DNA-SYN Biotecnologia Co., Beijing, China) foram misturados com 6 ul Oligofectamine reagente de transfecção (Invitrogen) mais 250 ul de meio Opt-MEM (Invitrogen) durante 20 minutos e foram então adicionados às células, respectivamente. Depois de transfecção durante 48 h, as células foram adicionalmente transfectadas com 20 pmol de cadeia dupla de ARN-poli (I: C) (Sigma, St. Louis, MO) para activar a sinalização através da via de IRF-3. Depois de poli (I: C) estimulação durante 24 h, o ARN celular total e as proteínas foram isolados para análise posterior. Para transfecções siRNA específicas, a transfecção siRNA incompatíveis foi utilizado como controlo transfectadas por simulação.

Isolamento de ARN total e semi-quantitativa por RT-PCR

O ARN celular total foi isolado utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Cerca de 3 ug de ARN total de cada linha celular foi digerido com RNase-free DNase I (Promega, Madison, WI) para remover a contaminação de ADN e transcrito reversamente em ADNc utilizando o sistema Superscript III (Invitrogen). Para examinar os níveis de genes alvo em células de expressão de ARNm, conjuntos de iniciadores específicos do tipo, foram concebidos e os produtos de PCR correspondentes foram sequenciados para confirmar a precisão da transcrição. Os conjuntos de iniciadores, a temperatura de recozimento para a amplificação, e o comprimento dos produtos de PCR estão listadas na Tabela 1. A mistura de PCR consistiu em Tris-HCl 10 mM pH 8,0, KCl 50 mM, MgCl 1,5 mM

2, 200 pmol de cada iniciador, 2 U de Taq ADN polimerase (Promega), e um 2/1 ul de ADNc de amostra. Os fragmentos resultantes foram sujeitos a electroforese num gel de agarose a 1,2-2,5% e visualizado com brometo de etídio. Todas as reacções de PCR foram repetidos com resultados reprodutíveis. β-actina foi utilizada como controlo interno e extraiu-se ARN total a partir das mesmas células sem transcrição reversa foi usada como controlo negativo. Para assegurar que as reacções de PCR estão dentro do intervalo linear da amplificação, os números apropriados de ciclagem para a amplificação de cada um dos genes alvo ou controlo foram examinados (dados não mostrados).

Western Blot Análise

células foram lisadas durante 30 min em tampão de lise (Tris-HCl 15 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% de Tween 20, e DTT 1 mM) suplementado com inibidores de protease e a solução foi clarificada por centrifugação a 12.000 rpm durante 15 min. A proteína total (25 ug) em 1 × tampão de amostra de dodecilsulfato de sódio (SDS) foi separado por 10% SDS-PAGE e transferidos para membrana de nitrocelulose electro-(Amersham Pharmacia Biotech, Chicago, IL). As membranas foram então bloqueados com leite desnatado a 5% e sondado com anticorpos primários específicos: anti-hnRNP A1 (Grupo Proteintech, Inc., Chicago, IL), anti-hnRNP A2B1 (Proteintech), anti-SF2 /ASF (Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA), anti-TBP (Proteintech), anti-actina (I-19) (Santa Cruz), ou anti-IRF-3 (Proteintech) (1:1000 1:3000 para diluição), respectivamente. Após lavagem com tampão de 0,2% de Tween 20 /PBS, três vezes, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano e visualizados utilizando o sistema de quimioluminescência aumentada, ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido).

Mobilidade electroforética Deslocamento Assay (EMSA)

a sequência do intrão 1 de IRF-3 pré-ARNm, a montante do exão 2 5 ‘sítio de splicing, contém uma sequência UAGGGA que é o mesmo que o consenso hnRNP A1 /A2 ligação de alta afinidade sítio identificado por SELEX, UAGGG (A /L) [39]. Usando o programa ESE Finder, outros dois sítios de ligação (GGAAGGA) do SF2 /ASF foram identificados imediatamente a montante do exão 2 5 local de splicing ‘. Para explorar a possibilidade de que RNPhn A1 /A2 e ligam SF2 /ASF a estes motivos de ligação, proteínas de fusão GST-RNPhn A1 e GST-SF2 /ASF foram expressos por indução IPTG e purificadas com glutationa Sepharose 4B. Os oligonucleótidos de ARN sintéticos contendo motivos de ligação de tipo selvagem para hnRNP A1 /A2 ou SF2 /ASF (WT-A1 ou WT-SF2), o motivo de ligação G3C mutante para hnRNP A1 /A2 (MU-A1), ou o motivo de ligação a G2C mutante para SF2 /ASF (MU-SF2) foram biotinilados utilizando o kit Fim a biotinilação do ARN Pierce 3 ‘(Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL) seguindo as instruções do fabricante. As reacções foram realizadas de desvio em gel utilizando o Kit de LightShift EMSA quimioluminescente (Pierce) de acordo com a descrição do fabricante. Resumidamente, 20 fmol de ARN do tipo selvagem ou mutante sondas biotiniladas foram incubadas com 50 ng de proteínas de fusão GST purificada durante 20 min à temperatura ambiente numa reacção de ligação de 20 uL contendo 2 ug de ARNt. As reacções de EMSA foram sujeitas a electroforese num PAGE nativa 6%, transferido para uma membrana de nylon carregada positivamente (Amersham), e, em seguida reticulada utilizando uma câmara de GS Gene Linker UV (BioRad, Hercules, CA). Detecção de RNA biotinilado foi realizada utilizando estabilizado conjugado de estreptavidina /peroxidase de rábano (Pierce) de acordo com as instruções do fabricante. Para demonstrar a especificidade da formação do complexo proteína-RNA, proteína GST purificada foi utilizada para a reacção de EMSA e actuou como controlo negativo.

IRF-3 Minigene Construção e transfecção

Um tipo selvagem do minigene contendo o IRF-3 região genômica relevante do exão 1 ao exão 4 e regiões flanqueando foi clonado no vector pcDNA3.0 (Invitrogen), utilizando

KPN

I e

locais Eco RI

corte. O intrão 1 de peso de IRF-3-minigene contém os locais de ligação putativos para hnRNP A1 /A2 (WT-A1) e SF2 /ASF (WT-SF2). Minigenes com o sítio de ligação G3C mutante para hnRNP A1 /A2 (MU-A1) ou o sítio de ligação G2C mutante para SF2 /ASF (MU-SF2) foram gerados por meio de uma de duas etapas de PCR de extensão de sobreposição [40] utilizando o WT-IRF -3 minigene construir como um modelo. Todas as cassetes de expressão estão sob o controlo do promotor de CMV e um sinal de poliA. Todas as construções foram verificadas através de sequenciação. O tipo selvagem e os vectores minigene mutados foram transfectados em células A549. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram recolhidas e os níveis de expressão relativa das isoformas de IRF-3 foram analisados ​​utilizando RT-PCR.

isolamento e cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e co-cultura com as células A549

o protocolo de estudo e documentos de consentimento foram aprovados pelo Comitê de Ética e as comissões Académicos da Universidade de Pequim primeiro Hospital. amostras de sangue da veia periférica foram obtidas de doadores saudáveis ​​com consentimento informado. Isolamento e cultura de PBMC foi realizada como previamente descrito [41]. Resumidamente, as PBMC foram isoladas do sangue periférico usando o Histopaque®-1077 (Sigma) seguindo as instruções do fabricante. Para o cultivo de PBMC, as células foram ressuspensas em meio RPMI 1640 suplementado com 5% inactivado pelo calor FBS (Invitrogen), 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 5 ug /ml de f ito-hemaglutinina (PHA) (Sigma) e 10 mM de HEPES e semeadas a 2 x 10

5 células /poço em placas de 6 poços.

Para a co-cultura subsequente com PBMC, as células A549 a 60-80% de confluência foram transfectados com siRNAs específicas, como descrito acima. Às 48 h pós-transfecção, as células foram adicionalmente transfectadas com poli (I: C). Quatro horas mais tarde, o meio foi mudado para meio de co-cultura de PBMC [meio RPMI 1640 suplementado com FBS inactivado por calor a 10%, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 1 ug /ml de PHA, e HEPES a 10 mM]. As PBMC (5 × 10

6) As células foram semeadas em Transwell-claro inserções (tamanho de poro 0,4 um, Costar Grupo, Washington, DC) e colocado em cima das culturas de A549. A co-cultura foi realizada durante 72 h e, em seguida, o meio de cultura foi recolhido para análise posterior.

A detecção de IFNp, CXCL10 /IP-10, TNF-α, e IL-10 por Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA )

As concentrações de IFNp (Pierce), CXCL10 /IP-10 (SABiosciences, Frederick, MD), factor de necrose tumoral-alfa (TNF-α) (SABiosciences), e interleucina-10 (IL-10) (SABiosciences) em sobrenadantes de cultura de células foram determinadas por ELISA de acordo com as instruções dos fabricantes. Os dados foram medidos a 450 nm com um leitor de microplacas BioRad.

imuno coloração

Para a análise imuno-histoquímica da expressão de RNPhn A1, A2 RNPhn, SF2 /ASF e IRF-3, 63 embebidos em parafina tecidos humanos NSCLC tumorais, 39 tecidos de controle não tumorais adjacentes, e 26 tecidos bronquiectasias foram obtidos a partir da Universidade de Pequim primeiro Hospital, Beijing, China. Este estudo foi aprovado tanto pela Ética e as comissões Académicos da Universidade de Pequim Primeiro Hospital, e o consentimento informado foi obtido de cada sujeito.

Todos os tecidos foram incluídos em parafina e foram coradas utilizando S-P método de imuno-histoquímica. Resumidamente, as lâminas foram deparaffinised em xileno, re-hidratadas em etanol graduado e depois tratou-se com PBS contendo 3% de dióxido de hidrogénio para bloquear a peroxidase endógena. Após pré-incubação em soro de cabra a 10% para bloquear a ligação não específica, as lâminas foram depois incubadas com anticorpos primários específicos: anti-hnRNP A1 (Proteintech), anti-hnRNP A2B1 (Proteintech), anti-SF2 /ASF (Santa Cruz), ou anti-IRF-3 (Proteintech) a 4 ° C durante a noite. Após a lavagem, as secções foram subsequentemente incubadas com imunoglobulinas biotiniladas durante 15 min e em seguida com conjugado de estreptavidina-peroxidase durante 15 min. Os sinais foram desenvolvidos com DAB-H

2 solução

2O. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina de 5%, e, em seguida, examinadas por microscopia de luz. As secções sem tratamento com o anticorpo primário foram utilizados como controle negativo. A coloração foi pontuada numa escala de 0 a IV como se segue: 0, menos do que 5% das células foram coradas; I, 5-25% de células foram coradas; II, 25-50% das células foram coradas; III, 50-75% das células foram coradas; e IV, mais de 75% das células foram coradas. Pontuações II-IV foram classificados como positivos, enquanto os escores 0 e I foram negativos.

Análise Estatística

SPSS 15.0 (SPSS Inc, Chicago, IL) foi utilizado para determinar a significância estatística. As variáveis ​​contínuas de diferentes grupos foram apresentados como média ± S.D. e foram comparadas usando

t

teste. O teste do qui-quadrado foi utilizado para analisar significado para RNPhn A1, A2 RNPhn, SF2 /ASF, e expressão IRF-3 entre os grupos de tecido pulmonar malignos e benignos estudado. Os valores de

P

. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Knockdown de RNPhn A1 /A2 ou SF2 /ASF em Células NSCLC humano aumenta a exclusão de exons 2 e 3 de IRF-3 gene

Para examinar o possível efeito de RNPhn A1 /A2 e SF2 /ASF na regulação do splicing do gene IRF-3, foi realizada a depleção mediada por siRNA de RNPhn A1 /A2 ou SF2 /ASF em células NSCLC A549 e Calu-6. Depois de siRNA transfecção e subsequente poli (I: C) estimulação do IRF-3 via de sinalização, o ARN celular total e as proteínas foram isoladas e a abundância de hnRNP A1 /A2 e SF2 /ASF mRNAs e proteínas foi avaliada por semi-quantitativo de RT-PCR e análise de transferência de Western, respectivamente. Quando comparado com extractos de controlo transfectadas por simulação, os extractos de ambos A549 e Calu 6-células transfectadas com ARNsi específicos mostrou uma redução acentuada nos níveis de genes alvo (Figs. 1B e 1C) de expressão. Como esperado, o siRNA transfecção SF2 /ASF não afectou os níveis de hnRNP A1 /A2, e vice-versa.

(A) Diagrama esquemático mostrando a três variantes de splicing FL-IRF-3 (IRF de comprimento completo -3), Tipo I (apenas E2 exclusão) e Tipo II (exclusão) isoformas tanto E2 e E3. E, exão. IRF-3 exons de 1 a 4 são numerados. A linha sólida preta representa íntrons. As setas acima dos transcritos mostram a localização de conjuntos de iniciadores específicos desenhados para a análise de RT-PCR de variantes de splicing de IRF-3. (B) emenda fatores RNPhn A1 /A2 ou SF2 /ASF foram esgotados por transfecção siRNA específica em células NSCLC humanas A549 e Calu-6, respectivamente. A1, A1 hnRNP; A2, PRNhn A2. O siRNA controle incompatíveis foi usado para controle de mock-transfectadas. Após transfecção siRNA e subsequente poli (I: C) estimulação, as células foram colhidas e semi-quantitativo de RT-PCR foi realizada para determinar o impacto de interferência de ARN sobre a expressão de genes-alvo e de IRF-3 variantes de splicing. Produtos correspondentes para FL-IRF-3 e dos seus dois tipos de variante de splicing (Tipo I e Tipo II) são indicados por setas. Para todas as reacções, o ARN total extraído de células A549 sem transcrição reversa foi usada como controlo negativo. Os produtos de PCR de FL-IRF-3, tipo I e tipo II isoformas foram quantificados por varrimento TotalLab Quant. O gráfico indica a proporção isoforma FL /(FL + I + II), e os valores são média ± DP de n = 3 experiências. (C) análise de transferência de Western foi realizada com anticorpos dirigidos contra as proteínas indicadas à direita. As bandas de proteína de IRF-3 também foram quantificadas e normalizadas para controlo interno actina. O gráfico indica a proporção de IRF-3 /actina e os valores são a média ± DP para n = 3 experiências.

#

P

e

##

P

. 0,05 em comparação com células A549 mock-transfectadas e Calu-6, respectivamente

dos IRF-3 variantes de splicing, o IRF-3b, -3c, -3D, e -3f perdem o exão 2 ou ambos exão 2 e exão 3 [37]. Para analisar a mudança de splicing alternativo de IRF-3 em células de siRNA-transfectadas, amplificação por RT-PCR de IRF-3 foi realizada utilizando conjuntos de iniciadores específicos para a frente com o iniciador localizado no exão 1 e o iniciador reverso no exão 4. Como mostrado nas Figs. 1A e 1B, de comprimento completo de IRF-3 (tipo I: única exão 2 de exclusão e Tipo II: tanto o exão 2 e o exão 3 de exclusão) (FL-IRF-3) e dos seus dois tipos de variante de splicing gerado três bandas: 500 pb (E1 + 2 + 3 + 4), 327 pb (E1 + 3 + 4), e 155 pb (E1 + 4) de comprimento, respectivamente. Como para as células A549, o esgotamento combinado de hnRNP A1 e PRNhn A2 e depleção única de SF2 /ASF ambos resultou numa diminuição óbvia em FL IRF-3 ARNm, a partir de 67% a 9% ou 11%, e um aumento concomitante em mRNAs de Tipo I e II isoformas (Fig. 1B). Resultados semelhantes foram obtidos utilizando células Calu-6, com o knockdown de hnRNP A1 /A2 ou SF2 /ASF resultando em diminuição de 91% a 13% ou 15% FL-IRF-3 ARNm (Fig. 1B). Um único depleção hnRNP A1 ou hnRNP A2 foi também realizada em células NSCLC e mostrou qualquer efeito sobre o IRF-3 padrão de splicing (dados não mostrados). Consistente com os resultados de RT-PCR, hnRNP A1 /A2 ou depleção SF2 /ASF resultou em diminuição óbvia nos níveis de proteína IRF-3 Expressão em ambos A549 e células Calu-6 (Fig. 1C).

Para investigar mais diretamente a especificidade do RNPhn A1 /2 ou SF2 /ASF esgotamento e salto de exon de IRF-3 pré-mRNA, usamos siRNA para esgotar PTB, outro regulador negativo abundante de splicing alternativo. depleção PTB não mostrou qualquer efeito sobre o padrão de splicing de IRF-3 (Figs. 2A e 2B).

factor de splicing PTB foi esgotada por transfecção siRNA específica em células NSCLC humanas A549 e Calu-6. O siARN controlo incompatíveis foi utilizado como controlo transfectadas por simulação. Após transfecção siRNA e subsequente poli (I: C) estimulação, do ARN total e das proteínas celulares foram recolhidos e testados por semi-quantitativo de RT-PCR (A) e análise por Western blot (B) para examinar os niveis de expressão de genes alvo e IRF- 3 variantes de splicing indicado à direita. Para as reacções de RT-PCR, o ARN total extraído de células A549 sem transcrição reversa foi usada como controlo negativo. Para todas as análises de Western blot, RT-PCR e, actina foi utilizada como controle interno.

RNPhn A1 /A2 e SF2 /ASF ligam especificamente a sequências no IRF-3 Intron 1