Abstract

GIPC1 é uma proteína andaime citoplasmática que interage com complexos de sinalização numerosos receptor, e evidência emergente sugere que ela desempenha um papel na tumorigénese. GIPC1 é altamente expresso num número de doenças malignas humanas, incluindo cancro da mama, do ovário, gástrico e pancreático. Supressão de GIPC1 em células de câncer pancreático inibe humanos

in vivo

crescimento do tumor em ratos imunodeficientes. Para entender melhor a função GIPC1, que suprimiu sua expressão no peito humano e linhas celulares de cancro colorrectal e células epiteliais mamárias humanas (HMECs) e ensaiadas tanto a expressão de genes e fenótipo celular. Supressão de GIPC1 promove a apoptose em células MCF-7, MDA-MD231, SKBR-3, SW480 e células SW620 e prejudica independente de ancoragem a formação de colónias de HMECs. Estas observações indicam GIPC1 desempenha um papel essencial na transformação oncogénica, e a sua expressão é necessária para a sobrevivência de células de mama humano e cancro colorrectal. Além disso, uma assinatura gene knock-down GIPC1 foi usado para interrogar mama publicamente disponível e conjuntos de dados de microarranjos de cancro do ovário. Esta assinatura GIPC1 estatisticamente correlaciona-se com uma série de fenótipos da mama e cancro do ovário e os resultados clínicos, incluindo a sobrevida do paciente. Tomados em conjunto, estes dados indicam que a inibição GIPC1 pode representar um novo alvo para o desenvolvimento terapêutico para o tratamento de cancros humanos

Citation:. Chittenden TW, Pak J, Rubio R, Cheng H, Holton K, Prendergast N, et ai. (2010) Implicações terapêuticas de GIPC1 silenciamento no câncer. PLoS ONE 5 (12): e15581. doi: 10.1371 /journal.pone.0015581

editor: Pawel Michalak, Virginia Tech, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de outubro de 2010; Aceito: 12 de novembro de 2010; Publicação: 30 de dezembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Chittenden et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. TWC, AC, JQ, JP, RR, KH, NP, VG, YC, SB, MS, JCM, EAH, MA, e RS foram apoiados por fundos da Iniciativa Fundo Estratégico Dana-Farber e do Barr Foundation Claudia Adams. J.Q. e J.C.M foram apoiados em parte por uma bolsa da National Library of Medicine (R01LM010129) dos Estados Unidos National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

GIPC1, GIPC2 e GIPC3 compreendem a família de genes GIPC humana, que é caracterizada por um único, o domínio PDZ conservados e os domínios de homologia de GIPC (GH1 e GH2) [1]. GIPC1 é uma proteína envolvida no andaime expressão na superfície celular do receptor, o tráfico intracelular, e a transdução de sinal. Anteriormente mostrou GIPC1 desempenha um papel central na fisiológico sinalização do factor de crescimento, a regulação das células endoteliais, e arterial morfogénese ramificação em ambos os ratinhos e peixes-zebra [2], [3]. Além disso, GIPC1 interage com e estabiliza complexos receptores de sinalização importantes, incluindo cinases de tirosina do receptor TrkA e TrkB [4], [5], o VEGF co-receptor de neuropilina-1 [6], o co-receptor de FGF sindecano-4 [7], [ ,,,0],8], o receptor Frizzled-3 [9], do receptor IGF-1 [10], o receptor do tipo TGF-beta III [11], e endoglina [12]. Estas interações complexas do receptor refletem o papel GIPC1 joga como uma proteína adaptadora, que liga os processos de reconhecimento apoiado pelo factor de crescimento múltiplo para vias de sinalização intracelular, culminando na regulação do ciclo celular entre outras funções.

No câncer, GIPC1 foi identificado como um antigénio imunogénico sobre-expresso tanto em tumores da mama e do ovário [13], [14]. GIPC1 e GIPC2 mRNAs são expressos em Okajima, TMK1, MKN45 e células cancerosas gástricas humanas KATO-III, e em vários tumores gástricos primários [15], [16]. GIPC1 é altamente expresso no adenocarcinoma pancreático humano e desempenha um papel central na estabilidade do IGF-1R em linhas de células de adenocarcinoma pancreático [17], [18]. Mais recentemente, a supressão GIPC1 em células de cancro pancreático humano foi mostrado para inibir

in vivo

o crescimento do tumor de pâncreas em ratos imunodeficientes [19]. No entanto, o mecanismo pelo qual GIPC1 promove o crescimento do cancro não está bem estabelecida.

Para investigar o papel que desempenha na GIPC1 cancro, foi utilizado para suprimir a expressão de RNAi GIPC1 em ambas as células de cancro da mama e colo-rectal e células epiteliais mamárias humanas (HMECs). Começamos nosso estudo examinando alterações nos padrões de expressão gênica global após a supressão GIPC1. Nossa análise indica que GIPC1 é necessário para mama e sobrevivência das células do câncer colorretal e desempenha um papel essencial na transformação oncogénica.

Resultados

silenciamento GIPC1 ea expressão gênica padrões em células de cancro da mama humano MDA-MB231

expressão do gene GIPC1 foi derrubado em células MDA-MB231 por transdução de hairpin RNAs curtos (GIPC1 KD), juntamente com empty-vector e controles não-transduzidas. Após a selecção de puromicina, sete repetições biológicos independentes de cada transdução foram crescidos em cultura, o RNA foi extraído, e GIPC1 knock-down foi ensaiada utilizando qPCR. qPCR encontrados 85% knock-down em células GIPC1 KD relação aos controles não transduzidas e vazio por vetores. RNAs das piscinas independentes foram hibridados com Affymetrix Human Genome U133 mais 2,0 GeneChips ™, os dados foram normalizados utilizando Robust Multi-Matriz de Análise [20] implementado no Bioconductor

affy

pacote e análise exploratória realizada com agrupamento hierárquico usando o pacote Bioconductor,

made4

[21]. Foi observado um efeito biológico forte de GIPC1 silenciamento (Figura S1). Análise de significância de Microarrays (SAM; Q-valor = 0%). [22] foi usado para identificar 3081 conjuntos de sondas (genes) ~2271 com expressão alterada nas células GIPC1 KD em comparação com as células de controlo do vector

Este lista gene GIPC1 KD foi comparado com os apresentados pelo Bild et al. [23], que analisou a sobre-expressão de cinco oncogenes (H-ras activado, E2F3 humano, activado β-catenina, humano c-myc, e c-Src humana) em HMECs primárias, utilizando

orderedlist

[ ,,,0],24]. Encontramos uma sobreposição significativa de genes anormalmente expressas no GIPC1 KD e os H-Ras sobre-expressão listas de genes ativados (P«0.05, figura S2).

Foram utilizados os 3081 sondas GIPC1 KD representando 2271 genes em uma análise de enriquecimento funcional utilizando Expression Analysis Explorador sistemática (EASE) [25] e facilidade aninhado, que se aplica a análise representacional EASE iterativa para identificar termos filha GO que impulsionam o significado de termos de nível superior (Chittenden

et al

., submetido). FACILIDADE usa teste exato de Fisher para identificar classes funcionais em conjuntos de genes que estão sobre-representados em relação à distribuição de genes testados fundo. Oito dos 67 ontologia sobre-representados gene (GO) termos encontrados por EASE são mostrados na Tabela 1, entre as quais são condições associadas com a proliferação celular, do ciclo celular, paragem do ciclo celular, a apoptose, a migração de células, e a degradação de proteínas mediado por ubiquitina.

EASE Nested (nease) é uma extensão do EASE que utiliza um segundo, sub-nível, teste exato de Fisher iterativo para encontrar GO subclasses que orientam a seleção prazo facilidade. Os resultados, apresentados na Tabela 2, incluem 17 subclasses funcionais estatisticamente enriquecidos de processos celulares encontrados por facilidade. nease descobriu que a facilidade significativa GO aulas processo biológico,

proliferação celular

,

modificação da proteína

,

mitose

,

crescimento celular e /ou manutenção

,

organização do citoesqueleto e biogênese

, e

processo fisiológico

são dirigidos coletivamente pelos processos biológicos

adesão celular e mediada por integrina sinalização

. Da mesma forma, prazo EASE significativa

organização citoplasma e biogênese

foi encontrado por nease a ser impulsionado em parte pela

cytokinesis após a mitose

. nease encontrado

apoptose

significativa devido a ir termos associados a

regulação da

filamentos de actina e

JAK-STAT cascata de sinalização

. expressão alterada foi encontrado em genes envolvidos tanto em

migração celular

e

metabolismo

; modificações no

atividade ubiquitina ligase proteína-Quais são devido a alterações na proteína de ligação. Nease também indica que GIPC1 KD altera a expressão de genes no EGF, TGFp, e Wnt vias de sinalização do receptor.

Colectivamente, estes dados sugerem que GIPC1 está envolvida na proliferação celular, apoptose, motilidade celular e adesão e degradação de proteínas mediada por ubiquitina. Estes dados sugerem que GIPC1 desempenha um papel amplo além de sua antiga associação com a regulação vascular e que pode, no cancro, ser envolvidos nos processos associados com o controle do ciclo cell-.

GIPC1 silenciamento inibe a proliferação de células MDA-MB231 e induz a apoptose

Porque GIPC1 KD afeta processos ligados ao crescimento celular, foram avaliados os efeitos do esgotamento GIPC1 na proliferação de células MDA-MB231. Determinou-se a viabilidade das células após a depleção GIPC1 por ambos os ensaios resazurina e redução de tetrazólio MTS em células experimentais e controle. Em ambos os casos, GIPC1 silenciamento provoca uma redução significativa na viabilidade celular às 48 horas após a sementeira (Figura 1A e 1D). Desde GIPC1 interage com [6] neuropilina-1, as células foram tratadas com VEGFA (10 ng /ml) para determinar se a perda de viabilidade celular causada pela supressão GIPC1 pode ser superado por um mitogénio relevante. VEGFA tratamento não é suficiente para impedir que uma redução aproximada de 40% e 60% na viabilidade das células em células GIPC1 KD em 48 e 72 horas, respectivamente (Figura 1D).

. Avaliação da viabilidade celular (azul) e caspase 3/7 atividade (rosa), a 0, 24, 48 e 72 horas. As linhas sólidas com caixas azuis (não transduzidas) e diamantes azuis (não-alvo) e linha pontilhada com triângulos azuis (GIPC1 KD) indicam a viabilidade celular. Rosa denota caspase 3/7 atividade. B. caspase 3/7 Normalizada actividade. Total de actividade da caspase 3/7 foi normalizada para a viabilidade celular e avaliado em 0, 24, 48, e 72 horas. A normalização indica um aumento de 2,1 vezes na actividade da caspase em células GIPC1 07/03 KD em comparação com células não-alvo em 72 horas. ensaio Tunnel C.. fragmentação do ADN foi avaliada como controlo positivo%. GIPC1 KD está correlacionada com um aumento na apoptose 11,24 dobra (GIPC1 /não-alvo; P 0,05). D. Avaliação da proliferação de células depois de VEGF (10 ng /ml) de indução. A proliferação foi avaliada às 0, 24, 48, e 72 horas. Dias 1, 2 e 3 foram normalizados ao dia 0. As linhas sólidas com caixas azuis (não-transduzidas) e diamantes azuis (não-alvo) e linha pontilhada com triângulos azuis (GIPC1 KD) indicam proliferação celular em meio de inanição. Rosa denota indução VEGF. D. Avaliação de PARP1 clivado. PARP1, clivada PARP1, GIPC1, e expressão GAPDH foi avaliada por western blot em células de câncer de mama humano MDA-MB231. Os dados estão apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam significância estatística (P ≤ 0,05) entre não-alvo e condições GIPC1 KD.

GIPC1 KD também influencia a apoptose. Para determinar os efeitos de silenciamento GIPC1 na actividade da caspase 3/7, o ensaio de redução de resazurina fluorométrico mostrado na Figura 1A foi multiplexado com um ensaio de caspase-3/7 homogénea Apo-ONE. Quando caspase 3/7 actividades são normalizados para os valores de viabilidade celular, detectou um aumento significativo na actividade da caspase em células GIPC1 07/03 KD quando comparado com o controlo linhas de células às 72 horas (Figura 1B). Encontrámos perdas semelhantes de viabilidade celular e aumento da caspase 3/7 actividades após GIPC1 silenciamento no cancro MCF-7 e SKBR-3 humano da mama e colo-rectais humanos linhas SW480 e SW620 de células do cancro (dados não mostrados).

para determinar se o aumento da actividade da caspase 3/7 encontrados em células MDA-MB231 está associada a fragmentação do ADN, foi realizado um ensaio de TUNEL colorimétrico deadend (Figura 1C). GIPC1 segmentação induz a fragmentação do DNA; avaliada como uma proporção em relação às células de controlo, a proporção relativa de células apoptóticas (GIPC1 KD /não-alvo) é 11,24 (P 0,05). Além disso, o aumento na actividade da caspase 3/7 e fragmentação de ADN em células GIPC1-silenciados estão associadas com um aumento da expressão de PARP1 clivado (Figura 1D). Estes dados são consistentes com os resultados de microarray (Tabelas 1 e 2), que indicam GIPC1 silenciamento inibe a proliferação celular e promove a apoptose.

GIPC1 silenciamento induz MDA-MB231 G2 do ciclo celular prisão

Microarray resultados implicaram efeitos do ciclo celular de GIPC1 KD. Foram realizadas de canal único análise FACS de células GIPC1 KD e os controlos associados ao explorar o ciclo celular em células de controlo e GIPC1 KD. supressão GIPC1 promove G1 sutil e prisão G2 profunda no dia 14 de selecção pós-puromicina dos transfectantes GIPC1 shRNA (Figura 2A). Estes dados indicam a acumulação de células em ambos G1 (43,70% ± 1,86% das células vs. 38,58% ± 0,21%) e G2 (46,33% ± 1,29% vs 27,70% ± 0,67%) fases do ciclo celular em comparação com GIPC1 KD células de controle não-alvo. células GIPC1 KD continuar a atravessar a fase S contra a prisão G2 proeminente (9,98% ± 0,57% versus 33,73% ± 0,53%). GIPC1 knockdown também resulta numa acumulação significativa de células num pico ADN 8N (9,74% ± 0,67% vs 0%) e em detritos celulares (sub-G1; 5,52% ± 0,54% vs 1,57% ± 0,17%). Juntamente com os resultados de microarray apresentados nas Tabelas 1 e 2, e comparados com os controlos apropriados, estes dados sugerem supressão GIPC1 promove prisão divisão celular e apoptose.

. canal único análise FACS de não transduzidas não-alvo, e as células GIPC1 KD 14 dias pós-transdução. Grey é% de células em G1. Amarelo indica% de células na fase S. Laranja é igual a% de células em G2. Azul é células% a 8N. D indica% detritos. análise de mancha B. ocidental de CDC25B, GIPC1 e GADD 45 α /expressão γ em não transduzidas não-alvo, e as células GIPC1 KD. Os dados estão apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam significância estatística (P ≤ 0,05) entre as condições não-alvo e GIPC1 KD.

Para determinar as causas do ciclo celular anormal encontrada com supressão GIPC1, usamos Western blot para avaliar a expressão da proteína de conhecidos -reguladores do ciclo celular de check-ponto encontrado expresso diferencialmente na análise de microarray. GIPC1 silenciamento induz uma perda de CDC25B e um aumento na expressão GADD45α /proteína γ (Figura 2B). CDC25B é necessário para a activação e CDK1 entrada em mitose; Considerando que a expressão dos membros da família de proteínas GADD45 são aumentadas após a detenção crescimento e danos ao DNA. Estes resultados suportam tanto o microarray (Tabelas 1 e 2) e FACS (Figura 2A) resultados que indicam que a supressão GIPC1 promove predominantemente prisão G2.

supressão GIPC1 altera a adesão celular e motilidade

achados sugerem Microarray GIPC1 está envolvido na adesão e de motilidade (Tabelas 1 e 2). Foram avaliados os efeitos da GIPC1 silenciando sobre a motilidade celular e aderência em células experimentais e de controlo MDA-MB231. GIPC1 silenciamentos aumentou significativamente a adesão de células MDA-MB231 em ambos os 30 e 60 minutos após o plaqueamento (Figura S3A). Utilizou-se um ensaio de zero (ferida) para avaliar os efeitos da GIPC1 KD na motilidade celular. supressão GIPC1 diminuiu significativamente a migração de células MDA-MB231, com ou sem oito horas de indução do factor de crescimento (Figura S3B). Microarray resultados indicam supressão GIPC1 está associada com um enriquecimento de genes anormalmente expressas no, proteína RHO mediada por integrina, JAK-STAT, EGF, Ras, TGFp e vias WNT (Tabela 2 e Figura S2). Estas vias, encontrado pela primeira vez em nossa análise bioinformática, regulamentar tanto adesão e migração celular e são candidatos para uma investigação mais aprofundada. Experimentalmente, GIPC1 depleção resultados na adesão celular aumentada e reduzida motilidade celular. depleção GIPC1 resulta em perda de EGF, FGF2, PDGF-BB, TGF-p1, e VEGFA motilidade celular induzida (Figura S3B). Estes dados sugerem que GIPC1 desempenha um papel num número de vias de transdução de sinal importantes que afectem tanto a adesão celular e a motilidade.

GIPC1 é necessário para independente de ancoragem de formação de colónias da linha de células tHMEC-LT-r

para avaliar se GIPC1 é necessário para a transformação oncogénica, que suprimiu a sua expressão em HMECs imortalizado-hTERT transformadas com SV40 T Grande (LT) e antígenos pequeno T (ST) (tHMEC-LT-st) [26]. células tHMEC-LT-ST são capazes de crescimento independente de ancoragem; No entanto, a depleção GIPC1 reduziu significativamente a eficiência do independente de ancoragem de formação de colónias da linha de células tHMEC-LT-r, quando comparado com células de controlo. Como um controlo adicional, uma segunda construção GIPC1 shRNA foi utilizado neste conjunto de experiências (Figura 3A). Estes dados indicam que GIPC1 é necessário para a formação de colónias independentes de ancoragem, uma medida de transformação oncogénica das células HMEC.

. Macio formação agar colônia em nontransduced, não-alvo, e as células células GIPC1 KD tHMEC-LT-st. B. Western blot indicando o effectivness GIPC1 de silenciamento com dois contructs GIPC1 shRNA independentes: NM_005716.2-1083s1c1 e NM_005716.2-499s1c1. Os dados estão apresentados como médias ± SEM. Os asteriscos indicam significância estatística (P ≤ 0,05) entre não-alvo e condições GIPC1 KD.

relevância clínica de genes regulados por GIPC1

knock-down

Para avaliar ainda mais a suposição de que GIPC1 desempenha um papel significativo no desenvolvimento e progressão de cancros humanos, 411 sondas com uma dobra-≥2 mudança na análise de SAM GIPC1 empobrecido células MDA-MB231 em comparação com células de controlo (GIPC1 assinatura; Tabela S1) foram usadas para interrogar duas disponíveis publicamente e clinicamente anotada mama e conjuntos de dados de câncer de ovário com o pacote Bioconductor,

globaltest

[27]. Um grande cancro da mama conjunto de dados de DNA microarray mesclada com 689 amostras de pré-tratamento [28], [29], [30] e um conjunto de dados do cancro do ovário com 274 pacientes tratados [31] foram utilizados para a análise. Na análise multivariada Global Test dos 689 pacientes de câncer de mama, a assinatura GIPC1 KD está associada com o grau do tumor (P 0,01), status do nó de linfa (P 0,0001) e status ER (P 0,05). A assinatura GIPC1 também está fortemente associada a sobrevivência do paciente dentro de ErbB2 + /ER + (n = 42, P 0,001), luminal B (n = 146, P 0,05) e basal (n = 92, p 0,01) subtipos de cancro da mama molecular (Tabela 3). A análise do conjunto de dados de câncer de ovário indica que a assinatura GIPC1 é significativamente associada com todas as variáveis ​​clínicas avaliadas; incluindo a sobrevida do paciente e estágio do tumor, grau e tipo (Tabela 3). Estes dados suportam relatórios recentes que sugerem que GIPC1 desempenha um papel na mama humano e etiologia do câncer de ovário e progressão [13], [14].

Discussão

Pouco se sabe sobre o papel de GIPC1 no crescimento do tumor e progressão. As evidências indicam que é altamente expressa em vários tumores humanos, incluindo os da mama, do ovário, gástrico, cancros pancreáticos e [13], [14]. Além disso, um relatório recente mostra GIPC1 é necessário para

in vivo

o crescimento do tumor de pâncreas em ratos imunodeficientes [19]. Neste estudo, utilizou-se ambas as abordagens computacionais e experimentais para examinar GIPC1 na mama humano e células de câncer colorretal, e em pacientes com câncer de mama e de ovário. Nós descobrimos que é necessária para GIPC1 mama e sobrevivência de células de cancro colorectal, e que desempenha um papel essencial na transformação oncogénica de células epiteliais mamárias humanas.

Os nossos dados também mostram GIPC1 desempenha um papel importante na regulação do ciclo celular. análise facilidade de GIPC1 knockdown em células MDA-MB231 mostra enriquecimento de genes diferencialmente expressos com funções anotados em G1 /S e G2 /M transições, parada do ciclo celular, proliferação celular e apoptose. nease busca explicações biológicas para estes efeitos principais e implica alterações potenciais na adesão celular, a sinalização mediada por integrina, e regulação do citoesqueleto de actina. Além disso, Nease encontrado um enriquecimento de genes envolvidos na citocinese. Esta descoberta está de acordo com um recente relatório indicando que a ativação de um transmembrana heparan proteoglicanos de sulfato que interage com GIPC1 eo receptor FGFR1 para regular a sinalização FGF2 sindecam-4 (SDC4), é necessário para citocinese de MCF 7-cancro da mama células humanas [32]. Keller-Pinter

et al

. mostrou que serine179-fosforilação e ectodomínio derramamento de SDC4 é máxima em G2 /M. Expressão de mutantes modificados que imitam serina 179-fosforilação (Ser179Glu) ou SDC4 fosforilação resistente causada abscission incompleta e gigante, células multinucleadas [32]. Além disso, SDC4 regula polimerização de actina, a formação de adesão focal, e motilidade celular através de sinalização PI3K

análise nease também sugere que GIPC1 está envolvido em seis grandes redes de transdução de sinal no cancro da mama:., Proteína RHO mediada por integrina, JAK-STAT, EGF, TGF e WNT. Estes resultados suportam os relatórios anteriores que indicam que GIPC1 interage com o receptor Frizzled-3 [9], o receptor TGF-beta tipo III [11], e endoglina [12]. Apesar do fato de que a nossa análise não sugerem um enriquecimento de genes dentro da rede de transdução de sinal PI3K, descobrimos que a supressão GIPC1 diminui a expressão de um número de genes-chave envolvidas na via, incluindo

sdc2, PIK3CB, PIK3D, PDK1, Akt3 CDC42BPA, CDC42EP3, RACGAP1,

e

RAC1

. Por outro lado, GIPC1 silenciamento promove elevações significativas na expressão gênica para

PTEN, p27

KIP1, RHOBTB1, RHOB,

e

PAK2

. Enquanto a activação aberrante de sinalização PI3K está envolvido na indução da transformação oncogénica, estes genes funcionam em conjunto para integrar mecanismos que controlam um número de processos celulares, incluindo a regulação do citoesqueleto, a motilidade celular e adesão, a proliferação celular e a apoptose [26], [ ,,,0],33].

validação experimental da expressão do gene de perfis resultados indica que GIPC1 silenciamento promove a paragem G2 do ciclo celular, apoptose, e alternâncias na adesão celular e a motilidade em células de cancro da mama humano MDA-MB231. depleção GIPC1 correlaciona-se com o aumento da actividade da caspase 3/7, a fragmentação do ADN, a regulação positiva dos membros da família GADD45, e perda de expressão CDC25B. Além disso, GIPC1 silenciamento correlaciona-se com reduções acentuadas na viabilidade celular e avaliações em caspase 3/7 atividades em células de câncer colorretal humano MCF-7 e SKBR-3 de cancro da mama humano e SW480 e SW620.

Ao usar RNAi para esgotar GIPC1 ARNm em células MDA-MB-231, fomos capazes de identificar uma grande variedade de genes cuja expressão foi alterada. Nós comparamos esta assinatura GIPC1 ao público de mama disponível e conjuntos de dados de expressão de genes do cancro do ovário para a qual o bem-anotados dados fenotípicos e resultados estavam disponíveis. Encontramos forte correlação entre a assinatura GIPC1 e um número de variáveis ​​clínicas de pacientes importantes.

No cancro da mama, foi utilizada a metodologia de teste Global e encontraram sobrevida livre de recorrência foi significativamente associada com a assinatura GIPC1 apenas dentro de subtipos moleculares específicos da doença: pacientes com luminal B ER + tumores (ER de alta qualidade +; P = 0,015), ERBB2 + /ER + doença (P = 4,3 × 10

-4), e os cancros talvez basal-like ou triplo-negativos (P = 0,0074). Dentro luminal A ER + (baixo grau ER +) casos e pacientes com ERBB2 + /cânceres ER-, a assinatura GIPC1 não foi preditiva de sobrevida livre de recorrência. Portanto, a assinatura GIPC1 pode ser capaz de distinguir o resultado do paciente dentro de grupos de câncer de mama de alta qualidade, particularmente aqueles que são ER +, e não simplesmente distinguir o grau do tumor (alta vs. baixa) ou status de ER (positivo contra o negativo). No conjunto de dados do cancro do ovário, a assinatura GIPC1 está estatisticamente correlacionado com todas as variáveis ​​clínicas avaliadas: a sobrevida global e grau do tumor, tipo e estágio. Uma característica comum das correlações que encontramos entre a assinatura GIPC1 e parâmetros clínicos na mama e câncer de ovário era uma associação com tumores de alto grau que são caracterizados por dano ao DNA excessivo e mau prognóstico do paciente.

Os dados de expressão disponíveis indicam que GIPC1 é altamente expresso em todos os cancro humano e os nossos resultados sugerem GIPC1 é um componente necessário para o crescimento do cancro humano promoveu a montante por factores de crescimento e seus receptores. Porque a transdução de sinal GIPC1 é activado por uma grande variedade de receptores da superfície celular e uma vez que também é conhecida por ser essencial para a ramificação morfogénese de vasos sanguíneos arteriais, segmentação GIPC1 mediada vias é uma estratégia terapêutica lógico para o tratamento de cancros humanos. Em particular, os nossos dados sugerem segmentação GIPC1 pode ser particularmente importante para estrogênio cânceres de mama de alta qualidade receptor-positivo

Materiais e Métodos

cultura celular

O MCF-7. , MDA-MB231, e SKBR-3 linhas celulares de cancro de mama humano e SW480 e SW620 linhas celulares de cancro colorrectal humano foram adquiridos da ATCC. células epiteliais mamárias humanas (HMECs) foram adquiridos a partir de Invitrogen (# A-10565). experimentos HMEC primárias foram realizadas passagem ≤ 10.

hTERT

-immortalized HMECs expressando SV40 LT e st foram cultivadas como descrito anteriormente [26]. Todas as linhas celulares foram cultivadas em pratos de cultura de tecidos de 100 × 20 mm (Becton Dickinson # 353803). As células MCF-7 foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO

2 em EMEM (GIBCO # 11095-080) suplementado com-inactivado pelo calor 10% de Soro Fetal Bovino (ATCC # 30-2020) e 1% de antibiótico-Antimyotic (Invitrogen # 15240-062). As células MDA-MB231 foram cultivadas a 37 ° C e 0% de CO

2 em meio L-15 de Leibovitz (Gibco # 11415-064) suplementado com 10% de FBS e 1% de antibiótico-Antimyotic. As células SKBR-3 foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO

2 em meio de McCoy 5A (GIBCO # 12330-031) suplementado com 10% de FBS e 1% de antibiótico-Antimyotic. células SW480 e SW620 foram cultivadas a 37 ° C e 0% de CO

2 em meio L-15 de Leibovitz suplementado com FBS a 10% e 1% de antibiótico-Antimyotic. HMECs primárias foram cultivadas a 37 ° C e 5% de CO

2 em Meio 171PRF (sem vermelho de fenol) (GIBCO # H-171PRF-500) suplementado com suplemento de crescimento epitelial mamária (MEGS) (Gibco # S-015- 5) e 1% de antibiótico-Antimyotic. Todas as linhas celulares foram mantidas a 60-70% de confluência.

shRNA produção vector lentiviral e transdução

GIPC1 (NM_005716.2-1083s1c1 e NM_005716.2-499s1c1) e vazios plasmídeos vector shRNA como bem como o delta 8,9 e VSVG plasmídeos foram obtidos a partir da instalação RNAi no Instituto do Câncer Dana-Farber. A mexidos, não-alvo plasmídeo shRNA foi a compra da Sigma (# SHC002). versões de ADNc de SV40 LT + r (LTG) foram clonados em pWZL-explosão como previamente descrito [26]. Todos os plasmídeos foram cultivadas em caldo LB + 100 ug /mL de ampicilina (Teknova # L8105). Os plasmídeos foram purificados utilizando o kit Qiagen Plasmid Maxi HiSpeed ​​de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen # 12663), e os rendimentos foram avaliadas utilizando um espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific # SID-10135606). HEK 293T /17 células (ATCC # CRL-11268) foram expandidos para uma densidade de 5 x 10

6/100 mm de prato de cultura de células (BD # 353803 Primaria) em meio de Dulbecco modificado de Eagle (ATCC # 30-2002) + 10% de calor-inactivado soro Fetal de bovino (ATCC # 30-2020) e incubou-se a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 24 horas. Cada placa foi então transfectadas com FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche # 11814443001), VSVG plasmídeo purificado, Delta 8,9 plasmídeo purificado, e ou 6 mg de shRNA plasmídeo purificado ou 4 mg de purificado LTG

plasmídeo WB em meio OptiMEM (Invitrogen # 11058-021). O meio foi mudado um dia após a transfecção com + 10% de meio FBS DMEM contendo 1% de antibiótico-Antimyotic (Invitrogen # 15240-062). Meio contendo o vírus empacotado foi recolhido no dia 2 após a transfecção, foi adicionado meio fresco, e a colheita virai foi novamente recolhidas no dia 3 após a transfecção. O lentivírus empacotada foi filtrada com filtros de 0,45 um (Corning # 431220) e concentrou-se durante 90 minutos a 16.600 g, usando uma ultracentrífuga (Beckman L8-70M #). Após ressuspensão, a lentivírus foi titulada utilizando o Kit de quantificação QuickTiter Lentivirus (celular Biolabs # VPK-108-HIV) segundo as instruções do fabricante. Para a transdução de vector lentiviral shRNA, meios de crescimento contendo polibreno e um volume de lentivírus que correspondeu a uma MOI de 50 foi adicionado às células e incubadas durante a noite nas condições de cultura específica da linha celular. No dia seguinte, os meios de vírus foi substituído com meio de crescimento específica da linha celular. Às 72 horas, o meio de crescimento foi suplementado quer com 10 ug /mL de puromicina e /ou 2,5 ug /ml de blasticidina. As experiências foram realizadas 14 dias após a selecção.

isolamento de ARN, a hibridação microarray e processamento, e PCR quantitativa

O ARN total foi isolado a partir de linhas de células utilizando o Kit RNeasy Mini (Qiagen # 74106) de acordo com a as especificações do fabricante com colunas QIAshredder (Qiagen # 79656) para homogeneização sedimento celular. O ARN total foi quantificado utilizando um espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific # SID-10135606). Vinte e um Affymetrix GeneChip Human Genome U133 mais 2,0 Arrays foram usados ​​para este estudo. Sete conjuntos por grupo foram utilizados para as seguintes linhas MDA-MB231 células: não transduzidas, vector vazio, e GIPC1 KD. hibridação e processamento Microarray foi realizada utilizando protocolos padrão no Centro de Microarray Núcleo do Instituto de Câncer Dana-Farber. O processamento da amostra foi realizada com um Affymetrix GeneChip Fluidics Station FS450 e matrizes foram digitalizadas com um scanner matriz GCS300 de acordo com as recomendações do fabricante. Duas fases quantitativa PCR em tempo real foi realizado com um sistema Applied Biosystems 7900HT (Applied Biosystems # 4329001). TaqMan GIPC1 (Applied Biosystems # Hs00991802_m1) e 18S endógena de Controle (Applied Biosystems # 4304437) ensaios foram executados em 8 replicados por amostra usando o Quantificação Relativa (Delta Ct), FAM nenhuma configuração de atenuação. Delta Cts foram calculadas subtraindo o Ct média dos controlos endógenos do Ct média do alvo de amplificação. O delta-delta Ct foi calculado subtraindo a média delta Ct das amostras vetor vazios do delta média Ct das amostras vetor alvo. Dobre a mudança foi calculada como 2 elevado à potência de delta-delta Ct.

normalização de dados Microarray e análise

Os dados brutos (arquivos .cel) foram importados para R e os dados foram normalizados com RMA [ ,,,0],20] utilizando o pacote Bioconductor,

affy

. análise exploratória de dados inicial foi realizada com a análise de agrupamento hierárquico (média-ligação e métrica 1 – Pearson coeficiente de correlação distância) usando o pacote Bioconductor,

made4

[21]. Duas classes análise da significância não pareado de Microarrays (SAM;. [22] com uma taxa de descoberta false 0% (q-valor) foi utilizado para determinar a expressão diferencial de genes entre as células GIPC1 KD MDA-MB231 e controle de vetor vazio