Abstract

Purpose

Para fornecer informações funcionais adicionais para a caracterização do tumor, nós investigamos o uso de dupla energia tomografia computadorizada para imagiologia tumores de pulmão de murino. volume de sangue do tumor e permeabilidade vascular foram quantificadas usando ouro e iodo nanopartículas. Esta abordagem foi comparado com um método /CT-único da energia único agente de contraste.

Ex vivo

estudos de validação foram realizados para demonstrar a precisão de

in vivo

contraste agente de quantificação por CT.

Métodos

tumores pulmonares primários foram gerados no

LSL-Kras

G12D; p53

FL /FL

ratos. As nanopartículas de ouro foram injectados, seguindo-se nanopartículas de iodo dois dias mais tarde. O ouro acumulados em tumores, enquanto que o iodo fornecida contraste intravascular. Três tomografias de dupla energia foram realizadas em duas para o método único agente de contraste e um método para o agente de contraste dupla. As concentrações de ouro e de iodo em cada varredura foram calculados utilizando uma decomposição dupla energia. Para cada método, o volume de sangue fraccionada do tumor foi calculado com base na concentração de iodo, e permeabilidade vascular tumoral foi estimada com base na concentração de ouro amarelo. Para a validação, as medições CT-derivados foram comparados com histologia e espectroscopia de emissão óptica com plasma indutivamente acoplado medições das concentrações de ouro nos tecidos.

Resultados

CT dupla energia habilitado

in vivo

separação dos agentes de ouro e de contraste de iodo e mostrou absorção de nanopartículas de ouro no baço, fígado e tumores. Os tumores medições de volume de sangue fraccionada determinados a partir dos dois métodos de imagem estavam de acordo, e uma alta correlação (R ​​

2 = 0,81) foi encontrada entre o volume de sangue fraccionada medida e densidade microvascular derivados de histologia. medições da permeabilidade vascular obtidos a partir dos dois métodos de imagem concordaram bem com

ex vivo

medições.

Conclusões

CT

Dual-energia usando dois tipos de nanopartículas é equivalente à única nanopartícula método, mas permite a medição do volume de sangue fraccionada e permeabilidade com uma única varredura. Tal como confirmado pelo

ex vivo

métodos, as concentrações de nanopartículas CT-derivados são precisos. Este método poderia desempenhar um papel importante na caracterização do tumor de pulmão em CT

Citation:. Ashton JR, Clark DP, Moding EJ, Ghaghada K, Kirsch DG, West JL, et al. (2014) Dual-Energy Micro-CT Imagem Funcional de câncer de pulmão primário em ratos usando agentes de nanopartículas de Contraste Ouro e iodo: um estudo de validação. PLoS ONE 9 (2): e88129. doi: 10.1371 /journal.pone.0088129

editor: Tanya V. Kalin, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de setembro de 2013; Aceito: 06 de janeiro de 2014; Publicação: 10 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ashton et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento a partir de um National Institutes of Health Center /Nacional para a concessão de Recursos Nacional de Pesquisa Biomédica Technology Resource Center (P41 EB015897) (CTB) e do National Cancer Institute U54 CA151668 (JLW). Outro apoio foi fornecido pelo NIH /NCI R21 CA175839 e NIH Instituto Nacional de Alergia /e Doenças Infecciosas K02 AI093866 (DGK). JRA é suportado por um cientista de Formação Programa de Formação Grant Medical (T32 GM007171) e um Duke Institucional Fellowship. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. KG detém opções de ações em Marval Biosciences, uma empresa start-up que buscam o desenvolvimento de um agente de contraste iodado CT lipossomal. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de pulmão continua a ser a principal causa de morte por câncer no mundo, e o número de mortes atribuídas de pulmão é esperado câncer de aumentar 50% até 2020 [1]. A tomografia computadorizada (TC) é o exame de imagem padrão para a avaliação de pacientes com suspeita de câncer de pulmão. Infelizmente, nódulos pulmonares malignas e benignas apresentam frequentemente características radiográficas semelhantes em CT [2], de modo a malignidade pode nem sempre ser devidamente identificados e tratados. Na triagem de teste National Lung Cancer (NLCST), o rastreio CT em pacientes de alto risco reduziu a mortalidade específica por câncer de pulmão [3], e da Força serviços preventivos dos Estados Unidos recomendou recentemente o rastreio do cancro do pulmão CT rotina para pacientes de alto risco; No entanto, este rastreio inevitavelmente conduz à detecção de pequenos nódulos pulmonares ( 1 centímetro) que não estão bem caracterizados por modalidades de imagem actualmente disponíveis (PET, CT ou MRI) [4]. O NLCST revelou que a maioria destes nódulos não são clinicamente significativa. Consequentemente, há uma necessidade de ampliar as informações fornecidas por imagem CT para nódulo caracterização, tanto para a caracterização de tumores conhecidos e para diferenciar tumores malignos novos detectados a partir de nódulos benignos.

Um método potencial para caracterização do tumor adicional é estudar a vasculatura do tumor pulmonar. A angiogênese é um fator chave no crescimento e metástase do câncer. Em particular, a angiogénese promove o crescimento do tumor através do fornecimento de tumores com os nutrientes necessários e fornece uma conduta para a propagação metastática. vasculatura do tumor formado por angiogênese rápida tende a ser menos bem organizado e mais permeável do que a vascularização normal [5]. A densidade da vasculatura tumoral, o que é muitas vezes correlacionada com a extensão da angiogénese, é relacionada com a agressividade do tumor e pode correlacionar com a sobrevivência [6]. Existe também evidência de que a extensão da vascularização e permeabilidade vascular difere entre nódulos pulmonares benignos e malignos [7]; No entanto, estudos mais abrangentes, que são melhor realizadas ao nível pré-clínico, são necessários para elucidar a importância destes biomarcadores vasculares em câncer de pulmão.

Usando estudos pré-clínicos em ratos, já anteriormente demonstrado que pulmonar indolente e agressivo Os tumores podem ser diferenciadas usando a energia de micro-CT única e um lipossomal contendo iodo (Lip-I) agente de contraste [8]. O aumento da acumulação de nanopartículas (devido ao aumento da permeabilidade vascular) foi demonstrada em tumores mais agressivos em comparação com os indolentes, enquanto que a densidade vascular foi semelhante nos dois tipos de tumor. Os experimentos de agente único contraste necessárias duas tomografias separados por vários dias para permitir a depuração do sangue completa do agente de contraste a fim de quantificar e diferenciar sinal vascular do sinal de acúmulo de tumor. O atraso entre o início e imagem-fase tardia pode não ser necessário se adotar uma solução mais elegante que envolve dois tipos distintos de nanopartículas e métodos de imagem CT como espectral ou de dupla energia (DE) CT.

DE imaging é uma técnica avançada que subiu recentemente para a vanguarda da tecnologia de CT [9]. A absorção de raios-X por agentes de contraste é fortemente dependente tanto do peso atómico do agente de contraste e a energia do raio incidente-X. Assim, dois materiais de diferente peso atómico podem ser diferenciados uns dos outros com base nos seus coeficientes de atenuação originais em duas energias de raios-X diferentes. DE-CT permite a visualização seletiva e quantificação de vários agentes de contraste em uma única varredura. DE-CT tem feito progressos significativos na imagiologia clínica do cancro. Para os tumores do pulmão, tem sido demonstrado que o aumento de iodo em exames clínicos DE-CT pode ser correlacionada com o SUV

max de

18FDG- PET [10], [11], que mostra que a ED-TC tem o potencial para estender tomografia computadorizada para além de imagens puramente anatômica a imagem funcional e molecular. Enquanto DE-CT mostra alta promessa na clínica para a imagem latente câncer, ele não vem sendo amplamente adotada no domínio pré-clínica devido aos desafios associados com maior resolução espacial, resolução temporal, e os níveis de ruído em micro-CT. Nós, contudo, têm sido endereço capazes alguns destes desafios e têm mostrado que a ED micro-CT utilizando nanopartículas como agentes de contraste pode desempenhar um papel importante na geração de imagens pré-clínico para cardíaca [12], do pulmão [13], e aplicações de cancro [14] , [15].

agentes de contraste nanopartículas são essenciais para estudos pré-clínicos CT porque os agentes de contraste convencionais são eliminados da corrente sanguínea muito rapidamente para imagem eficaz. A maioria dos modelos animais pré-clínicos, especialmente ratos, são capazes de renal claras peso molecular agentes de contraste clínicos baixos a partir de seu sangue dentro de segundos (meia-vida de sangue normal em humanos é de 2-3 horas [16]), devido a sua extremamente elevado débito cardíaco. As nanopartículas utilizadas como agentes de contraste para TC, tipicamente têm um longo ( 2 horas) e uma meia-vida também tendem a acumular-se em tumores devido ao aumento da permeabilidade e efeito de retenção (EPR) [17]. A utilidade destes agentes em CT imagem pré-clínico tem sido bem estabelecida [14], [18] – [24]

Nós desenvolvemos recentemente um método DE micro-CT para separar o ouro e à base de iodo para nanopartículas. imagiologia vascular em sarcomas dos tecidos moles [14]. Neste método, as nanopartículas de ouro são injectados e deixada a acumular-se no tecido de tumor, durante dois dias. Lipossomal iodo é então injectada e imediatamente seguido por uma verificação DE-CT enquanto o iodo permanece intravascular. A permeabilidade vascular (taxa de absorção de nanopartículas do tumor) é calculada utilizando a concentração medida de ouro nos tecidos, enquanto que o volume de sangue é calculada a partir de concentrações de iodo tecido. O presente trabalho tem como objetivo aplicar o método de micro-CT DE para a difícil tarefa de tumores pulmonares de imagem para a quantificação do volume de sangue do tumor e permeabilidade vascular. Neste estudo, nós mostramos que o método dois agente de contraste (de dois materiais), que requer apenas uma única tomografia computadorizada, compara favoravelmente com o nosso método publicado anteriormente agente de contraste simples (-prima única), que necessitou de duas tomografias espaçadas vários dias Além [8]. Importante, nós também como objectivo validar os nossos

In vivo

resultados dual-energia com

ex vivo

medidas padrão ouro. Para o melhor do nosso conhecimento, não houve publicados estudos clínicos ou pré-clínicos DE-CT com validação rigorosa do

in vivo

concentrações materiais calculados. medições DE normalmente são calibrados utilizando

in vitro

fantasmas, que aproximados, mas não representam plenamente,

in vivo

condições. Portanto, não há o potencial de erro significativo nas medições DE quando se depende da in vitro calibrações fantasmas. Neste artigo, nós empreendemos

in vivo

validação, que é fundamental para desenvolver ainda mais DE-CT para os modelos pré-clínicos.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos os animais foram tratados de acordo com as boas práticas de animais, tal como definido pelos organismos nacionais e /ou locais relevantes de bem-estar animal, e todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comitê Institucional de animal Care and Use (IACUC protocolo A283-11-11) de Duke University Medical Center. O programa de gestão de animais Duke University Medical Center é credenciado pela Associação Americana para Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC) e atende Institutos Nacionais de normas de saúde, conforme estabelecido no “Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório” (DHHS publicação No. (NIH) 85-23, Revised 1985). A instituição também aceita como obrigatória a “Política de Humane Cuidado e Uso de Animais de Laboratório pelas instituições premiado” PHS e “Princípios NIH para a utilização e cuidados dos animais vertebrados utilizados em testes, investigação e formação.”.

O iodo lipossomal Fabricação

iodo lipossomal foi produzido como descrito anteriormente [25]. Uma mistura de lípido (200 mmol /L), que consiste de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), colesterol, e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metoxi ( polietileno glicol) -2000] (DSPE-PEG 2000) num 55:40: rácio molar de 5 foi dissolvido em etanol e hidratado com uma solução concentrada de iodixanol (550 mg I /ml). A solução de lípido resultante foi sequencialmente extrudido sobre um extrusor Lipex Thermoline (Northern Lipids, Vancouver, British Columbia, Canadá) para dimensionar os lipossomas para -100 nm. A solução de lipossomas foi diafiltrada utilizando um módulo MicroKros® (Spectrum Laboratories, Milpitas, CA) para remover o iodixanol encapsulado-un.

lipossomal iodo Caracterização

A distribuição de tamanho de lipossomas na formulação final foi de determinada por dispersão de luz dinâmica (DLS) usando um Malvern Zetasizer Nanoseries (Malvern Instruments, Worcestershire, RU) a 25 ° C. A microscopia electrónica de transmissão (MET) foi efectuada por análise de tamanho adicional e caracterização do agente de contraste. Os lipossomas foram em uma grade filme de carbono seca local e fotografada usando uma FEI Tecnai G

2 Cama TEM (FEI, Hillsboro, OR) a uma tensão de 120 mV. diâmetro da partícula foi medido para 200 lipossomas utilizando o ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/, NIH). A concentração de iodo na solução final lipossómica foi quantificada medindo a absorvância de UV a 245 nm utilizando um espectrofotómetro Cary 50 (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA).

In vitro

estabilidade dos lipossomas foi verificada por medição da libertação de iodixanol dos lipossomas após incubação em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 37 ° C durante 72 horas. A concentração de iodixanol libertado após incubação foi determinada por diálise os lipossomas contra 500 mL de PBS e medindo a absorvância de UV do dialisado numa cuvete de quartzo.

nanopartículas de ouro Fabrication

Nanopartículas de ouro (AuNPs) foram produzidos utilizando o método de Frens [26]. 500 mL de uma solução 1 mM de HAuCl

4 em água ultrapura foi levada à ebulição. Uma solução pré-aquecida de 540 mg de citrato de sódio dissolvido em 3 mL de água foi rapidamente injectado na solução de ouro e a mistura resultante foi agitada vigorosamente. A cor mudou de amarelo para incolor para vermelho escuro ao longo de 30 segundos. A reacção foi continuada à ebulição durante 15 minutos, após o que o recipiente de reacção foi removido da fonte de calor e deixou-se arrefecer com agitação contínua durante 1 hora. Após arrefecimento, as nanopartículas foram filtradas utilizando um filtro de 0,45 mícrons de polietersulfona. Para passivar as nanoparticulas produzidas, um grande excesso de 5 kDa de polietileno-glicol terminado em tiol (PEG; Immutabilis Bio, árabe, AL) foi adicionado às nanopartículas filtrados, que foram então agitadas a temperatura ambiente durante 4 horas. moléculas de PEG não ligados foram removidos e as partículas de concentrado utilizando um filtro de centrífuga de 100 kDa.

nanopartículas de ouro Caracterização

A distribuição de tamanho e carga de superfície das nanopartículas de ouro foram caracterizados por DLS e potencial zeta usando um Malvern Zetasizer Nanoseries a 25 ° C. distribuição de tamanho de DLS foi confirmada por TEM utilizando uma FEI Tecnai G

2 Cama TEM operando a 200 mV. diâmetro da partícula e relação de aspecto foram medidos por 200 AuNPs usando ImageJ. Os espectros de absorvância de AuNPs suspensas em água ultrapura foram recolhidas a partir de 400 a 650 nm utilizando um espectrofotómetro de UV-Vis. A estabilidade das nanopartículas PEGuilados contra a agregação foi confirmada por monitorização do espectro de UV-Vis de 6 horas após a adição de soluções salinas fisiológicas de NaCl a 0,9% ou Eagle Médium meio de cultura de Dulbecco modificado (DMEM) com 10% de soro fetal de bovino (FBS) para soluções de nu ou PEGylated AuNPs. A concentração final de ouro na solução AUNP concentrada foi determinada por espectroscopia UV-Vis absorvância utilizando o coeficiente de extinção publicado de 12 AuNPs nm a 450 nm [27] e foi subsequentemente correlacionados com as medições de plasma indutivamente acoplado a espectroscopia de emissão óptica (ICP-OES ), conforme descrito abaixo.

In Vivo Imaging tumor

Os tumores de pulmão foram gerados por injecção intra-nasal de adenovírus expressando Cre recombinase (Transferência de Gene Vector core, Universidade de Iowa) em

LSL-Kras

G12D; p53

FL /FL

ratinhos mutantes composto tal como descrito anteriormente [28] – [30]. Os ratinhos com tumores primários de pulmão foram utilizados para o estudo de imagem com 12 semanas pós-infecção adeno-Cre, altura em que vários adenocarcinomas do pulmão agressivos (~0.5-1.5 mm de diâmetro) estavam presentes dentro de cada rato. Todos os animais foram fotografadas em 24-30 semanas de idade. Um total de cinco animais foram usados ​​para o estudo de imagem. Devido à natureza longitudinal deste estudo, cada rato serviu como seu próprio controlo.

longitudinal DE imagiologia micro-TC foi realizada em todos os animais, como mostrado na Figura 1. As varreduras Três DE micro-TC foram realizados para cada mouse, a fim de comparar o método single-prima (TC 1 e 2) com o nosso novo método de dois materiais (TC 3). Notamos que, ao contrário do nosso estudo anterior [14], DE-micro-CT foi realizada mesmo quando se usa um único agente de contraste, o que nos permitiu medir a concentração de ouro sem a necessidade de uma comparação de exame de pré-contraste. No dia 1, o agente de contraste foi injectado intravenosamente AUNP pela veia da cauda a uma dose de volume de 0,32 mL /25 g de peso corporal e exames pós-injecção (TC 1) foram imediatamente adquiridas. Então, esperou 48 horas para que haja tempo suficiente para a acumulação de ouro para ocorrer nos tumores. Após este atraso (dia 3) uma segunda tomografia computadorizada de dupla energia (TC 2) foi obtido. Imediatamente após a segunda varredura, o agente de contraste lipossomal iodo foi injetado por veia da cauda, ​​numa dose de volume de 0,3 mL /25 g de peso corporal e uma terceira tomografia computadorizada de dupla energia (TC 3) foi realizada. Após a terceira varredura, os ratos foram sacrificados e os tecidos foram colhidas para estudos de validação, conforme descrito abaixo.

AuNPs foram injetados no dia 1, seguido imediatamente por tomografia computadorizada 1. Dois dias depois, tomografia computadorizada 2 foi feito , seguido imediatamente por Lip-I injeção e TC 3. Todos os exames foram dual-energia aquisições micro-CT.

dual-Energy micro CT-System

A custom-built sistema de imagem de micro-CT dupla fonte foi utilizada para o estudo [31]. Os animais foram digitalizada, enquanto a respiração livre sob anestesia utilizando 2-3% de isoflurano entregue pelo nariz-cone. A temperatura corporal foi mantida com lâmpadas de calor, uma sonda retal, e um controlador de feedback (Digi-Sense®, Cole Parmer, Chicago, IL). gating respiratório prospectivo foi usado para minimizar os efeitos do movimento respiratório de animais durante as verificações [32]. Uma almofada pneumática posicionado no tórax dos animais ligado a um transdutor de pressão foi usado para monitorizar a respiração. Uma aplicação em LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) foi utilizado para monitorizar o sinal respiratório e desencadear os tubos de raios-X no final da expiração pelo cálculo de um retardo de tempo fixo a partir do sinal respiratório de pico. Aquisições foram realizadas para ambas as cadeias de imagem em cada ângulo de rotação, com um atraso de 10 ms entre as duas posições de tubos de raios-x para minimizar transversal de dispersão. Uma vez que este é um atraso muito curto em relação à duração da fase expiratória final plana, que não afecta o desempenho de gating respiratório. Um total de 360 ​​foram adquiridas por cada cadeia de imagem através da rotação de 360 ​​°. Cada varredura prospectivamente-fechado levou cerca de 7 minutos para ser concluído. Os parâmetros de digitalização para os exames de dupla energia foram: 80 kVp, 160 mA, 10 ms /exposição para a primeira cadeia de imagem e 40 kVp, 250 mA, 16 ms /exposição para a segunda cadeia de imagem. A dose total de radiação associada com os três tomografias foi de 0,39 Gy.

Pós-processamento e Dual-Energy decomposição

processamento de dados DE micro-CT seguido o fluxograma na Figura 2. Raw 40 kVp e 80 conjuntos de dados de kVp foram reconstituídas usando o algoritmo de Feldkamp [33] numa matriz de 512 x 512 x 512 de tamanho de voxel isotrópico 88 mícrons. foi realizado o registro afim de melhorar o registo entre correspondente 40 e 80 kVp reconstruída volumes usando formigas, um open-source, baseado em ITK kit de ferramentas de registro (Ferramentas Avançadas de normalização, https://picsl.upenn.edu/ANTS/; svn 1409; [ ,,,0],34], [35]). Para melhorar a decomposição, cada conjunto de dados foi denoised usando filtração mista bilateral (BF). BF conjunta é uma extensão espectral do filtro de aguçamento de borda bem caracterizado que considera a distribuição dos voxels vizinhos no espaço e intensidade. Joint BF foi implementado usando MATLAB (MathWorks, Natick MA), e geralmente concluído no prazo de 15 a 20 minutos por conjunto de energias. Detalhes da aplicação da BF conjunta para murino de dados micro-CT [36] e uma avaliação quantitativa da aplicação da BF para DE micro-CT [13] têm sido descritos anteriormente.

Raw 40 kVp e 80 kVp conjuntos de dados foram adquiridos e, em seguida, eles foram submetidos a registro afim e filtração mista bilateral para produzir conjuntos de dados filtrados. decomposição dupla energia foi realizada sobre estas imagens filtradas, o que resultou em duas imagens independentes (mapas) que representam o iodo e concentração de ouro em cada voxel. Depois de obter os dois mapas, as imagens foram sobrepostas e os ossos foram segmentados out (cor branca) para formar a sobreposição final dos mapas concentração. Estas imagens foram tiradas de TC 3, em que tanto o iodo e o ouro estava presente na corrente sanguínea. A barra de escala representa 1 cm de todas as imagens. As imagens 40 e 80 são kVp janelas de -300 a 1200 HU, os mapas são iodo em janelas 0,25-15 mg /mL, e mapas de ouro são janelas 0,25-6 mg /ml.

dE decomposição de ouro e iodo foi realizada após o registo e filtração, usando as correspondentes 80 e 40 de dados kVp filtradas, como descrito anteriormente [14], [37]. Para cada voxel, a decomposição envolvido resolvendo um sistema de duas equações com duas incógnitas, C

I e C

Au, que representam as concentrações de iodo e de ouro, respectivamente, dentro do voxel dado. O valor de medição de atenuação CT em cada voxel representa uma combinação linear das concentrações desconhecidas de ouro e de iodo em mg /mL, multiplicado pelos coeficientes da matriz sensibilidade TC como se mostra nas equações seguintes:

Aqui, C

I e C

Au são as concentrações desconhecidas de iodo e de ouro, respectivamente, em um dado voxel, CT

40 e CT

80 são as atenuações medidos no voxel a 40 e 80 kVp, e CT

I, 40, CT

I, 80, CT

Au, 40, e CT

Au, 80 são coeficientes da matriz de sensibilidade constante para o iodo e ouro empiricamente determinada a 40 e 80 kVp na atenuação medida (unidades HU) por concentração do agente de contraste (mg /mL). As concentrações desconhecidas de iodo e de ouro em cada voxel foram determinadas, invertendo esta matriz de sensibilidade e encontrar a solução de mínimos quadrados do seguinte sistema de equações em MATLAB:

energias Verificação de ouro ideal e decomposição de iodo foram escolhidos seguindo o resultados de nossas simulações anteriores e

in vitro

estudos [37]. Estes estudos mostraram que a diferença espectral máxima entre o ouro e o iodo para fontes de raios-X policromáticos ocorreu às tensões de funcionamento de 40 e 80 kVp. Os valores para os coeficientes da matriz a sensibilidade em cada energia (CT

I, 40, CT

I, 80, CT

Au, 40, e CT

Au, 80), foram determinadas empiricamente utilizando um fantasma de calibração conforme descrito anteriormente [14]. Para a calibração do fantasma, a atenuação CT de frascos de concentração de ouro e iodo conhecida foram medidos a 40 e 80 kVp, e os coeficientes para a matriz de sensibilidade foram determinados através do ajuste do ouro conhecido e as concentrações de iodo para a atenuação CT medido usando um linear de mínimos regressão de quadrados em cada nível de energia. Os valores derivados para CT

I, 40, CT

I, 80, CT

Au, 40 e CT

Au, 80 utilizado neste estudo foram 28,7, 42,6, 88,5, e 58,8 HU /mg /mL, respectivamente. Após decomposição, voxels com concentrações negativos de ambos os materiais foram definidas para zero. Voxels com uma concentração negativo de um material e uma concentração positiva da outra material foram projectados sobre o subespaço de concentração positivo.

In vitro

validação deste método de decomposição usando fantasmas tanto físicos e digitais tem sido demonstrado em nosso trabalho anterior [14]. Estes estudos de validação demonstraram a capacidade deste método de decomposição de medir com precisão as concentrações de ouro e iodo tanto quando eles são independentes um do outro e quando estão presentes no mesmo voxel.

Análise de Imagem

CT imagens foram analisadas usando Avizo (FEI Visualization Sciences Group, Burlington, MA). Regiões correspondentes ao sangue (Lumen ventriculares e grandes vasos) e baço foram automaticamente segmentado usando o conjunto de 80 dados kVp, enquanto as regiões correspondentes ao fígado e rins eram semi-automaticamente segmentado utilizando o mesmo conjunto de dados. Cada região segmentado incluído o órgão inteiro, mas excluído grandes vasos sanguíneos dentro do órgão. Os tumores foram segmentados semi-automaticamente usando o mapa de ouro a partir da decomposição de dupla energia. regiões ásperas foram desenhados manualmente fora das fronteiras do tumor, sendo estas regiões thresholded a seleccionar apenas os voxels que continham uma concentração de ouro entre 0,25 mg /mL e 3 mg /mL. Estes valores limiar foram escolhidas de modo a excluir parênquima pulmonar normal, os vasos sanguíneos grandes, e osso a partir dos tumores segmentados. Um total de 27 tumores de pulmão nos 5 murganhos foram identificados e segmentado em cada uma das verificações de micro-CT 3 De.

Seguindo segmentação, concentrações de iodo de ouro e foram medidos em cada região segmentado de interesse através do cálculo da média valor do ouro e mapas de iodo ao longo de toda a região de interesse. Uma vez que ambas as nanopartículas são agentes de contraste de meia-vida longa, eles permanecem quase inteiramente dentro da vasculatura imediatamente após a injecção. O volume de sangue fraccionada (FBV) de cada órgão pode, por conseguinte, ser estimado medindo-se a concentração de iodo ou de ouro dentro do órgão imediatamente após a injecção de nanopartículas. Calculamos FBV no dia 1 usando os AuNPs e novamente no dia 3 utilizando o Lip-I. FBV foi calculado pelas seguintes equações: onde C

Au, day1, a concentração média de ouro em um lenço de papel imediatamente após a injeção de ouro no dia 1, C

Au, sangue, day1, a concentração média de ouro no sangue segmentado no dia 1, C

I, Dia3 é a concentração média de iodo num tecido imediatamente após Lip-I injecção, e C

I, de sangue, Dia3 é a concentração média de iodo medido no sangue segmentada no dia 3. FBV foi calculada para cada tumor segmentada, baço, fígado, rim e em ambos os pontos de tempo. Este FBV calculado é uma estimativa da densidade vascular no interior do tecido e se correlaciona com a densidade microvascular calculada por análise de imagens de cortes histológicos de tecido, como descrito a seguir.

Após a determinação da FBV em cada tecido, a concentração de ouro acumulado dentro de cada tecido foi calculado. Devido à sua semi-vida no sangue de comprimento, mais de metade do agente de contraste injectado permaneceu no fluxo de sangue no dia 3. Assim, a concentração de ouro tecido medido no mapa ouro CT inclui tanto ouro que extravasado para o tecido e o ouro que permanece intravascular dentro do tecido. A FBV calculado acima pode ser utilizado para subtrair a concentração de ouro intravascular de acordo com as seguintes equações: onde C

Au, accum é o (extravascular) concentração acumulada de ouro num tecido, C

Au, tot é o total de ouro concentração num tecido calculado a partir do mapa de ouro CT no dia 3, C

Au, iv representa a concentração de ouro dentro de um tecido que permanece intravascular, e C

Au, o sangue é a concentração de ouro no sangue grandes quantidades calculado a partir do mapa de ouro CT no dia 3. Estas equações foram utilizadas para calcular o ouro acumulado no interior de cada tumor e órgão. Para o método único agente de contraste, o FBV de TC 1 e as concentrações de ouro a partir de TC 2 foram usadas nestes cálculos. Para o método de agente de duas contraste, as concentrações FBV e ouro eram ambos de tomografia computadorizada 3. Para a validação, estas concentrações de ouro acumuladas foram comparadas com concentrações de ouro em cada órgão medido pelo ICP-OES.

Estudos de Validação

processamento de tecidos.

As amostras de sangue, os tumores do pulmão e outros órgãos (rins, fígado, baço) foram extraídos a partir de todos os murganhos para análises. Foi colhido sangue dos ratos após a primeira tomografia computadorizada da veia facial. A coleta de sangue e Órgãos do terminal foram realizadas seguindo a terceira tomografia computadorizada. Cada rato foi colocado sob anestesia profunda por uma injecção intraperitoneal de pentobarbital. A anestesia foi verificada por pitada dedo do pé. A cavidade abdominal foi aberta e foi retirado sangue lentamente a partir da veia cava inferior, enquanto o coração ainda batendo foi. 0,5-1,0 ml de sangue foi colhido de cada ratinho, após o que a veia cava inferior e aorta foram cortados e o restante sangue foi deixado a drenar para dentro da cavidade abdominal. A traqueia foi canulada, em seguida, com uma agulha de calibre 20, através do qual uma mistura 01:01 de cryoembedding médio (OCT) e sacarose a 30% foram injectados para dentro dos pulmões para encher os espaços de ar para o seccionamento do tecido posterior. Após uma inflação com incorporação forma, os pulmões foram retirados do rato e quer imediatamente dissecados para os tumores pulmonares ou incorporado em OCT e congelados em gelo seco. tumores pulmonares extraídos dos pulmões dissecados foram embebido em PBS durante 5 minutos para enxaguar o sangue residual e, em seguida, congeladas a -80 ° C para análise ICP-OES. Após a extracção do pulmão, o fígado, o baço e os rins de cada ratinho foram colhidos e cortados ao meio. A primeira metade de cada órgão foi imediatamente incorporado em outubro em gelo seco para o corte. A segunda metade foi embebida em PBS durante 5 minutos e congelou-se a -80 ° C para análise ICP-OES. Todos os tecidos foram mantidas congeladas a -80 ° C até estar pronto para posterior processamento.

Histologia.

8 mícrons secções de tumor congeladas foram imunocoradas para a CD31 marcador de células endoteliais. Antes da coloração, as secções foram fixadas com paraformaldeído a 4%, lavadas com PBS, e bloqueadas com 10% de FBS em PBS durante uma hora. As secções foram então incubadas com o anticorpo primário (rato anti-ratinho CD31, BD Pharmingen) diluído em tampão de bloqueio 1:250 durante 2 horas à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas três vezes com PBS durante 10 minutos para remover o anticorpo primário não ligado, após o que o anticorpo secundário (conjugado com Alexa Fluor488-IgG de burro anti-rato, Invitrogen) diluiu-se em 1:500 de bloqueio, foi adicionado tampão e incubou-se durante 1 hora em o escuro. Os núcleos foram contrastadas com DAPI. Alguns troços 8 mícrons também foram utilizados para hematoxilina e eosina (H E) coloração. Para a H E de coloração, as amostras foram coradas com hematoxilina, lavado com água e etanol, coradas com eosina Y, em seguida, lavado com etanol e xileno e montadas para microscopia

secções foram fotografadas utilizando um Zeiss Axiovert 135 invertida.