Abstract
No presente estudo, investigamos o
in vitro
funções anti-tumor de um derivado de chalcona 4,3 ‘, 4′, 5’-tetramethoxychalcone (TMOC) em células de cancro do ovário. Descobrimos que TMOC inibiu a proliferação e a formação de colónia de células sensíveis a cisplatina A2780 linha e linha de células A2780 resistentes /CDDP, bem como a linha celular de cancro do ovário SKOV3, de forma tempo e dose-dependente. O tratamento de células A2780 com TMOC resultou em L
0 /G
1 célula de paragem do ciclo através da infra-regulação da ciclina D1 e CDK4, eo aumento da regulação das proteínas p16, p21 e p27. Nós demonstramos que TMOC pode induzir a apoptose das células por meio de supressão da Bcl-2 e Bcl-xL, mas aumentando a expressão do Bax e a clivagem de PARP-1. Tratamento de TMOC também reduziu a invasão e a migração de células A2780. Finalmente, descobrimos que TMOC inibiu a activação constitutiva de STAT3 e via de sinalização induzida a expressão do PTEN supressor de tumor, independentemente do estado de p53 em linhas celulares. Estes dados sugerem que TMOC pode ser desenvolvido como um potencial agente quimioterápico para tratar eficazmente certos tipos de cancro, incluindo o cancro do ovário
Citation:. Qi Z, Liu M, Liu Y, Zhang M, Yang G (2014) Tetramethoxychalcone, um chalcona Derivada, suprime a proliferação, Blocos ciclo celular progressão, e induz a apoptose de células do cancro do ovário humano. PLoS ONE 9 (9): e106206. doi: 10.1371 /journal.pone.0106206
editor: Chih-Pin Chuu, Institutos Nacionais de Pesquisa em Saúde, Taiwan
Recebido: 16 de abril de 2014; Aceito: 03 de agosto de 2014; Publicação: 02 de setembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Qi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão incluídos dentro do papel
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 81071839 M. Liu, e nºs 91129721 e 81372797 para G. Yang. ), pela China de Pós-Doutorado Science Foundation (No. 2013M531126) para M. Liu, pelo Programa de Pujiang Xangai (11PJ1402200) do Governo Municipal de Xangai da China por G. Yang, e pelo Fundo de Doutorado do Ministério da Educação da China (20120071110079 ) para G. Yang. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de ovário é a principal causa de morte por doenças malignas ginecológicas em mulheres. Devido à falta de métodos sensíveis e específicos para a detecção precoce, cerca de 60-70% dos pacientes com câncer de ovário são diagnosticados em estágios avançados [1], [2]. Apesar dos avanços no tratamento do câncer de ovário, que envolve predominantemente cytoreductive cirurgia seguida por quimioterapia à base de platina, a taxa de sobrevivência de pacientes com câncer de ovário continua a ser muito baixo [3]. problemas clínicos, incluindo a resistência adquirida a quimioterapias convencionais, bem como a capacidade metastática e invasiva da doença foram severamente prejudicada o sucesso do tratamento [4], [5]. Por conseguinte, a continuação do desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para o cancro do ovário, especialmente para as células resistentes à platina, ainda é urgente.
de ocorrência natural a partir de produtos de várias plantas são sempre importante na descoberta de novos agentes terapêuticos [6], [7]. Por exemplo, derivados de calcona (contendo moléculas de 1,3-difenil-2-3propen-1-ona), grupos de uma das principais classes de produtos naturais com ampla distribuição em especiarias, chá, cerveja, frutas e vegetais, exiba várias interessante biológica incluindo actividades anti-inflamatória, antimicrobiana, anti-oxidante, e propriedades anticancerígenas [8] – [10]. Especificamente, como uma estrutura imita de combretastatina A-4 (CA-4), 3 ‘, 4′, 5’-trimethoxychalcone foi relatado que exibem propriedades anti-mitóticos causada pela inibição de polimerização da tubulina [11] – [14].
em nossos esforços para descobrir agentes citotóxicos contra células de cancro do ovário, uma série de CA-4 compostos relacionados foram sintetizados e avaliados por suas atividades anti-proliferativa em linhagem celular de câncer epitelial de ovário humano A2780
in vitro
(dados não mostrados). Entre estes compostos, 4,3 ‘, 4′, 5’-tetramethoxychalcone (TMOC, Fig. 1A) possuía a maior potência inibitória contra as células A2780. No entanto, após
in vitro
ensaios mostraram que TMOC não interrompeu a polimerização da tubulina (Fig. 1B), indicando que o mecanismo anti-câncer do TMOC ainda continua a ser elucidado.
Materiais e Métodos
Materiais
TMOC foi sintetizado de acordo com o relatório anterior e foi determinada por espectros incluindo
RMN-1H,
13 C-RMN e espectro de massa de alta resolução (HRMS), que foram grande concordou com as literaturas [14], [15]. A pureza de TMOC foi mais do que 98% o qual foi analisado por HPLC.
RPMI-1640 e soro fetal de bovino (FBS) foram adquiridos a Thermo Scientific (Sul Logan, UT, EUA). MTT, indide de propídio (PI), 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), o anticorpo e a p-actina foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). violeta de genciana foi comprado de Solarbio (Pequim, China). O kit de anexina V-FICT /PI de detecção de apoptose, câmaras de invasão, matrigel, e o anticorpo para p21 foram adquiridos a BD Biosciences (Franklin Lakes, Nova Iorque, EUA). tampão de lise celular e BCA kit de ensaio de proteína foram adquiridos de Beyotime (Xangai, China). membrana de PVDF e reagentes quimioluminescentes eram da Millipore (Billerica, MA, EUA). Os anticorpos para ciclina D1, CDK4, p16, p21, Bcl-xL, Bax, STAT3, p53, PTEN, c-myc foram de Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos para fosfo-Src (Tyr416), Src, fosfo-STAT3 (Tyr705) e cindiu-PARP-1 foram adquiridos da Cell Signaling Technology.
Cultura de células e transfecção
O epitelial de ovário humano linhas celulares de cancro A2780 e SKOV3 foram adquiridas a partir da ATCC. A linha de ovário resistentes a cisplatina célula cancerosa A2780 /CDDP foi gentilmente cedido pelo Prof. Ling-Ya, Pan [16]. Imortalizado, mas células epiteliais pré-neoplásicas do ovário humano T29 foi derivado a partir de linhas de células epiteliais da superfície do ovário Iosé-29, como descrito anteriormente [17]. As células foram rotineiramente cultivadas com meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, 100 U /mL de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina, numa incubadora humidificada a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO
2. Para estudos de transfecção, as células foram transfectadas transitoriamente com STAT3-CA (mutante activa constitutiva, A661C e N663C) [18], [19], STAT3-DN (mutante negativo dominante, Y705F) [20] ou o vetor de controle usando Fugene� HD ( Promega). As construções STAT3 foram presentes de Dr. Hesham M. Amin (MD Anderson Cancer Center, em Houston, Texas, EUA).
In vitro
anti-proliferação ensaio
A
in vitro
actividade anti-proliferativa de TMOC foi medida por o reagente MTT, tal como descrito na literatura [21]. Resumidamente, 5 x 10
3 células em 100 ul de meio por poço foram plaqueadas em placas de 96 poços. Depois incubou-se durante 24 h, as células foram tratadas com diferentes concentrações de TMOC ou DMSO (como controlo negativo) durante 24 h, 48 h ou 72 h. Então, o meio com o composto ou de DMSO foi substituído por 200 ul de meio fresco contendo 10% de MTT (5 mg /ml em PBS) em cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 4 h. Por último, o meio contendo MTT foi eliminado e 150 mL de DMSO foi adicionado por poço para dissolver os cristais de formazano formados recentemente. A absorvância de cada poço foi determinada com um leitor de microplacas (Synergy H4, Bio-Tek) em um comprimento de onda de 590 nm. As taxas de inibição de proliferação foi calculada com a seguinte equação:
ensaio de formação de colónias
5 × 10
2 células por poço foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de célula única. 48 h mais tarde, as células foram tratadas com diferentes concentrações de TMOC ou DMSO (como controlo negativo) durante 48 h. Em seguida, o meio foi substituído com meio fresco para permitir o crescimento de células durante uma semana. As células foram fixadas com álcool metílico durante 15 minutos e coradas com violeta de genciana, durante 30 min. As colónias constituídas por mais do que 50 células foram contadas.
análise do ciclo celular
estado do ciclo celular foi detectada por citometria de fluxo de acordo com um método previamente publicado [22], e foram analisados por Multicycle AV ( para Windows, versão 320) software. Resumidamente, as células foram primeiro tratados com várias concentrações de TMOC ou DMSO durante 24 h, e, em seguida, recolhidas, lavadas duas vezes com 1 x PBS, e ressuspenso em 200 ul de 1 x PBS. As células foram fixadas em 4 mL de gelo frio de 75% de etanol a -20 ° C durante a noite e coradas com 500 mL de PI (50 ug /mL, Sigma) contendo 0,1% de RNase (1 mg /mL, Sigma) durante 15 min em condição escuro à temperatura ambiente. As células foram depois analisadas por citometria de fluxo (FC 500 Cytomics MPL, Beckman Coulter). Os resultados foram indicados como valores médios de três determinações independentes.
apoptose celular análise
Para detectar a apoptose, as células foram incubadas com as diferentes concentrações de TMOC ou DMSO (como controlo negativo) durante 24 h . As células foram colhidas, lavadas duas vezes com PBS frio 1 ×, e ressuspenderam-se em 200 uL de tampão de ligação a uma densidade de 1 x 10
5 células /mL. As células foram então coradas com 5 uL Anexina-V e PI, durante 15 minutos em condições de escuro, à temperatura ambiente e submetida a análise por citometria de fluxo. A apoptose precoce foi avaliada com base na percentagem de células com anexina V + /PI-, enquanto o final de apoptose foi o de células com Anexina V + /PI +. Os resultados foram indicados como valores médios de três determinações independentes.
DAPI e coloração PI
mudanças integrais morfológicas e membrana nuclear de apoptose foram determinadas por DAPI e PI coloração respectivamente, como [23 descrito anteriormente ], [24]. 3 × 10
5 as células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas durante 48 h, seguido por tratamento com diluente ou com as concentrações desejadas de TMOC durante 24 h. Para a coloração DAPI, as células foram lavadas com PBS três vezes, fixadas com mentol, e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100, seguido por coloração com DAPI (1:2000 diluição, em 1x PBS) a 37 ° C durante 15 min em escuro. Para a coloração de PI, as células foram lavadas por três vezes PBS e coradas com PI directamente a 37 ° C durante 15 min no escuro. Após a coloração, as células foram lavadas com PBS para remover o corante não ligado (PI) e observadas utilizando microscopia de fluorescência (Olympus). As imagens fluorescentes foram registados utilizando uma câmara CCD arrefecida.
cicatrização de feridas ensaio
Para detectar a motilidade celular, as células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas a 90% de confluência. A única ferida de zero foi criado em monocamada de células usando uma ponta de micropipeta estéril. Subsequentemente, o meio com detritos celulares foram removidos, e adicionou-se meio fresco isento de soro (sem suplemento de FBS) contendo diferentes concentrações de DMSO ou TMOC. As células foram incubadas a 37 ° C e as imagens de cada monocamada ferida foram tomadas a 0, 36 e 72 h.
Transwell ensaio de invasão
invasão celular foi ensaiada utilizando câmaras de pré-revestidos com Matrigel [ ,,,0],25]. Resumidamente, 5 x 10
4 células em 300 uL de soro livre RPM-1640 foram semeadas para dentro da câmara superior. A câmara foi colocada numa placa de 24 poços e os poços inferiores continha meio RPM-1640 com FBS a 10% e diferentes concentrações de DMSO TMOC ou (como um controlo negativo). Após 24 h de incubação, as células na superfície superior da câmara foram cuidadosamente esfregadas com uma mecha de algodão. As células que migraram através da câmara foram fixadas com metanol, coradas com violeta de cristal e em seguida contados a partir de 5 domínios diferentes de cada poço sob microscópio invertido. Pelo menos três experiências independentes foram executadas.
análise Western blot
As células foram tratadas com diferentes concentrações de DMSO TMOC ou (como um controlo negativo) durante 24 h, e depois foram colhidas, lavadas com frio 1 × PBS duas vezes, lisadas com tampão de lise celular durante 30 min em gelo, e centrifugado a 12000 rpm durante 15 min a 4 ° C. A concentração de proteína total foi determinada pelo kit de ensaio de proteína BCA. Quantidades iguais (30 ug por carga) de amostras de proteína foram sujeitos a electroforese em SDS-PAGE e transferidos para fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas que foi, em seguida, bloqueadas em leite a 10% sem gordura, e reagiu com anticorpos primários. Após incubação com os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP), as bandas de proteína foram reveladas com os reagentes quimioluminescentes.
A análise estatística
Os dados foram calculadas utilizando Graph Pad Prism e expressos como média ± SE Os valores de IC
50 foram ajustados utilizando um modelo de regressão não-linear com uma resposta a dose sigmoidal. As comparações entre os grupos controle e tratado foram determinadas por emparelhado
t
teste ou one-way ANOVA seguido por testes de comparações múltiplas de Tukey. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos a
p
. 0,05
resultados
TMOC suprime o crescimento de células
Em primeiro lugar, determinou os efeitos anti-proliferativa de TMOC em células de carcinoma do ovário humano A2780, incluindo (a p53 de tipo selvagem), células A2780 /CDDP (sublinha resistente a cisplatina de A2780, mutante p53) e SKOV3 (p53 nulo), assim como células T29 epiteliais do ovário pré-neoplásicas. As células foram tratadas com várias concentrações (variando de 0,3125-40 uM) de TMOC para 24, 48, e 72 horas. Como mostrado na Fig. 2A, o tratamento de células A2780 com TMOC resultou numa diminuição correspondente da proliferação celular e a viabilidade de uma maneira dose e dependente do tempo. Efeitos semelhantes foram obtidos no tratamento de A2780 /CDDP e células SKOV3 (Fig 2A). Em contraste, a sensibilidade das células T29 para TMOC foi muito baixa, como a concentração de TMOC eficaz em células T29 foi detectada em 40 uM, em 72 h. Os sub
50 valores IC foram calculados e listados na Tabela 1. Assim, estes dados sugerem que TMOC tem um efeito citotóxico sobre as células do tumor dos ovários, independentemente da p53 status, mas processa menos citotoxicidade em células epiteliais do ovário pré-neoplásicas. Além disso, também testada a actividade anti-proliferativa de chalcona (1,3-difenil-2-propen-1-ona), que é o composto mãe de TMOC (Tabela 1). Comparado com TMOC, chalcona exibiram efeito muito fraco na inibição de tanto o crescimento de células neoplásicas e pré-neoplásico, e apresentou uma fraca solubilidade em água, o que pode indicar que os quatro grupos metiloxi são essenciais para a actividade anti-cancro e as propriedades físico-químicas.
(a) TMOC inibiu a proliferação das células de uma maneira dose e dependente do tempo. A viabilidade celular foi determinada por ensaios MTT. (B) Imagens representativas de colónias de células após o tratamento com várias concentrações de TMOC durante 24 h. taxa de formação (C) Colony após o tratamento com TMOC durante 24 h.
Nas seguintes experiências, foi determinado o efeito de TMOC sobre a capacidade de formação de colónias das linhas celulares do cancro do ovário. ensaio de formação de colónias é um
In vitro
ensaio de sobrevivência de células com base na capacidade de uma única célula a proliferar indefinidamente, retendo assim a sua capacidade de reprodução de modo a formar uma colónia que consiste de pelo menos 50 células. ensaio de formação de colónias é o método de escolha para determinar a morte celular reprodutivo após o tratamento com agentes citotóxicos, e agora amplamente utilizados para determinar a citotoxicidade induzida por vários agentes quimioterapêuticos [26]. Neste estudo, como mostrado na Fig. 2B, o tratamento de A2780, A2780 /CDDP células, e SKOV3 com TMOC em concentrações de 0,3125, 0,625, 1,25 e 2,5 | iM durante 48 horas a formação de colónias inibiu dependentemente da dose, quando comparado com o tratamento com diluente (DMSO). O número de colónias formadas pelas células tratadas com TMOC ou diluente foram resumidos na figura 2C, a qual confirmou o efeito inibido de TMOC sobre o crescimento de células de cancro do ovário.
TMOC induz L
0 /L
uma fase de paragem do ciclo celular
agentes anti-tumorais químicos podem inibir a proliferação celular através da indução da paragem do ciclo celular. Portanto, compreender como o crescimento celular foi inibido por TMOC, a progressão do ciclo celular foi analisada por quantificação do conteúdo de ADN por citometria de fluxo. Foram tratados com células A2780 TMOC durante 24 horas e examinou o conteúdo de DNA de iodeto de propídio (PI) a coloração (fig. 3A). Como ilustrado na Fig. 3B, em comparação com células de controlo tratadas com o diluente, quando as células A2780 foram tratados com altas concentrações de TMOC aos 5, 10 e 20 uM, a percentagem de células em G
0 /L
1 fase foi elevada de 42,3 % a 64,1%, e a percentagem de células em S e G
fase 2 /M foi reduzida concomitantemente. Uma vez que a progressão do ciclo da célula é regulada por complexos de ciclina /cinase dependente de ciclina (CDK), as expressões descontrolados de ciclinas e /ou CDKs podem levar à desregulação do ciclo celular e a tumorigénese [27]. Portanto, nós examinamos se TMOC afetados ciclinas ou expressões CDK. Como mostrado na Fig. 3C, o tratamento de células com TMOC regulada para baixo as expressões de ciclina D1 e CDK4, mas regulado para cima as expressões de p16, p21
Cip1 e p27
Kip em uma forma dependente da dose. Tomadas em conjunto, as expressões alterados de ciclinas celulares e inibidores de CDK podem ser associados com a paragem do ciclo celular causado por TMOC.
(A), a distribuição do ciclo celular após tratamento com diferentes concentrações de TMOC durante 24 h. (B) Análise quantitativa das células tratadas com TMOC. (C) O Regulamento de proteínas associadas com o ciclo celular em células A2780. As experiências foram repetidas três vezes, e de uma experiência representativa é mostrada. *
p Art 0,05, **
p
. 0,01 em relação ao controle
TMOC induz apoptose celular
DAPI núcleos coloração foi usado para visualizar a apoptose induzida por TMOC. Como mostrado na Fig. 4A, a apoptose nuclear de células A2780-tratados TMOC foram caracterizados por cromatina condensada e fragmentada manchado com fortes pontos fluorescentes azuis, enquanto que as células de controlo foram coradas com uniforme azul [24]. Além disso, a apoptose também foi indicado por tingimento com PI, um corante nuclear insuficiência membrana, como mostrado na Fig. 4B. Estes resultados indicaram que TMOC poderia induzir a apoptose celular. Para determinar ainda mais o número e fase de células apoptóticas, Anexina-V /PI dupla coloração foi aplicado para quantificar o número de células apoptóticas tratadas com TMOC [22]. Como ilustrado na Fig. 4C e 4D, as proporções totais de células coradas com anexina V + /PI
– (quadrante inferior direito representando apoptose precoce) e anexina V
+ /PI
+ (quadrante superior direito representando tarde apoptose e de necrose), as células foram aumentou de 1,2% para 35,5% depois do tratamento de células A2780 com TMOC aos 5, 10 e 20 uM, durante 24 h. Estes dados confirmaram ainda que TMOC poderia induzir fortemente apoptose celular de células de cancro do ovário de um modo dependente da dose.
(A) DAPI núcleos de coloração foi usado para visualizar a apoptose induzida por TMOC. As setas representam as células apoptóticas. Barra de escala = 10 mm. captação (B) PI foi analisada sob um microscópio fluorescente. Barra de escala = 50 mm. (C) de fluxo representativas perfis de citometria de apoptose e (d) os resultados quantitativos obtidos através de coloração /PI Anexina V. (E) As transferências de Western de proteínas relacionadas apoptóticos. O ensaio foi repetido três vezes, e um resultado representativo é mostrado. *
p Art 0,05, **
p Art 0,01 em relação ao controle
Em seguida, investigou-se a via de sinalização envolvida na TMOC apoptose induzida por. A análise de western blot. Mostrámos que (Fig. 4E), TMOC-regulada a expressão da proteína Bax pró-apoptótica, mas sub-regulada das expressões das proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-XL em uma maneira dependente faz. Além disso, em comparação com células de controlo, a exposição a TMOC induziu a clivagem de poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP-1), um marcador de células que sofrem apoptose [28]. Estes resultados sugerem que TMOC pode induzir a apoptose celular através destas proteínas.
TMOC suprime a migração celular e invasão
metastático propagação, uma das características das células de câncer de ovário, é um fator importante para a baixa taxa de sobrevivência dos pacientes [29], enquanto que os agentes anti-cancro pode não só inibem o crescimento de células de cancro, mas também podem travar metástases de células. Neste estudo, para determinar se TMOC suprime invasão e migração em células de câncer de ovário, foi realizada a cicatrização de feridas e transpo� ensaios de invasão. No ensaio de cura da ferida, após uma única ferida foi riscada em monocamada de células A2780, o meio foi substituído por meio isento de soro contendo TMOC ou diluente (como controlo), a fim de evitar a influência de proliferação celular. Como mostrado na Fig. 5A e 5B, a migração de células foi significativamente diminuído por TMOC. A supressão de migração não foi devido a apoptose ou paragem do crescimento medida que a concentração de TMOC a 0,5 uM ou 1 uM induziu somente uma toxicidade relativamente baixa em células A2780. Os resultados obtidos a partir do ensaio Transwell, mostrou que TMOC inibiu a invasão e a migração de células A2780 de um modo dependente da dose (Fig. 5C e 5D).
(A) TMOC inibiu a migração de células. Fotografias representativas das células foram tomadas no tempo 0, 36 ou 72 h. (B) Quantificação da cicatrização de feridas. As experiências foram repetidas três vezes. (C) fotografias representativas das células invasoras em transpo� ensaios invasivos. Barra de escala = 20 mm. (C) Quantificação de células A2780 invasivos. As experiências foram repetidas três vezes. *
p Art 0,05, **
p
. 0,01 em relação ao controle
efeitos anti-câncer Vias de sinalização envolvidas no TMOC mediadas
transdutor de sinal e activador de transcrição-3 (STAT3), um factor de transcrição oncogénica, muitas vezes é constitutivamente activa nas células de cancro humano [18]. Estudos recentes têm mostrado que a activação da STAT3 desempenha um papel fundamental na sobrevivência, hiper-proliferação e progressão metastática do cancro do ovário [30], [31]. Uma vez activada, a STAT3 fosforilado podem sobre-regular a expressão de genes, tais como os inibidores da apoptose (Bcl-XL, Bcl-2), reguladores do ciclo celular (ciclina D1) e factores oncogénicos de transcrição (c-myc) em tumorigénese [32], [33]. Portanto, utilizou-western blot para testar se a supressão da via de sinalização da STAT3 foi envolvido nos efeitos anti-cancro TMOC-mediadas. Com efeito, como mostrado na Fig. 6A, com o aumento da concentração TMOC, a fosforilação da STAT3, bem como a expressão de c-myc, um alvo a jusante conhecido da STAT3 [33], [34], foi dependente da dose, suprimida em células A2780, A2780 /CDDP e SKOV3 células, ao passo que nenhum efeito sobre os níveis de expressão de STAT3 totais foi observada.
(a) tratamento TMOC inibiu a fosforilação STAT3 e regulada para baixo o nível de c-myc de uma forma dependente da dose. (B) células /CDDP A2780 A2780 e foram transfectadas com STAT3 constitutivamente ativo (S3-CA) plasmídeo, STAT3 dominante negativo (S3 DN) plasmídeo ou controle de vetores. (C) Introdução de S3-CA significativa bloqueou a actividade anti-proliferativa de TMOC. Em contraste, a introdução de S3-DN sensibilizados as células cancerosas para o tratamento TMOC. (D) TMOC inibiram a fosforilação de c-Src quinase e regulado para cima do tumor PTEN surpressor em todas as três linhas de células, mas apenas p53 em células A2780-regulado. β-actina foi utilizado como um controlo de carga igual. As experiências foram repetidas três vezes e uma experiência representativa é mostrada. *
p Art 0,05, **
p
. 0,01 em relação ao controle
Para confirmar ainda mais o papel da STAT3 na citotoxicidade induzida TMOC, que transfectadas células A2780 e A2780 /CDDP com STAT3 constitutivamente activa (S3-CA) plasmídeo, STAT3 negativo dominante (DN-S3) plasmídeo ou vector de controlo, respectivamente, e depois determinou-se a efeito anti-proliferativo de TMOC nas células transfectadas. Como mostrado na Fig. 6C, introdução de S3-CA resecued significativamente o efeito anti-proliferativo de TMOC. Em contraste, a introdução de S3-DN sensibilizados células cancerosas para o tratamento TMOC. Colectivamente, estes dados sugerem que TMOC pode provocar a sua actividade anti-cancro através da inibição da via de sinalização da STAT3.
Vários estudos têm demonstrado que a activação constitutiva de STAT3 é frequentemente desencadeada por o não-receptor de tirosina-cinase c-Src e negativamente regulado pelo p53 supressores de tumor e PTEN [35], [36]. Deste modo, nós também examinado se TMOC poderia suprimir a activação de c-Src quinase e modulam a expressão de p53 e PTEN nas três linhas de células de cancro do ovário. Como mostrado na Fig. 6D, descobrimos que TMOC dependentemente da dose inibiu a fosforilação de c-Src quinase, enquanto que o nível total de c-src manteve-se inalterada. Enquanto isso, TMOC supra-regulados os níveis de expressão de PTEN em todas as três linhas de células, mas apenas sobre-regulada p53 em células A2780.
Discussão
Numa tentativa para desenvolver novos agentes quimioterápicos com efeitos colaterais menos prejudiciais para tratar o cancro, produtos naturais e seus análogos sintéticos têm recebido grande atenção [37]. Por exemplo, muitos estudos têm mostrado que vários compostos de calcona, ambos derivados da natureza e versões sintéticas, citotóxicos exibem actividades antitumorais e [38]. Neste estudo, destina-se a estudar a actividade anti-cancro e o mecanismo subjacente de TMOC, um composto chalcona, em linhas celulares de cancro do ovário. Mostrámos que TMOC inibiu significativamente a proliferação de colónias e a formação de A2780, A2780 /CDDP células, e SKOV3 (Fig. 2), o que sugere que TMOC pode ser um agente quimioterapêutico eficaz contra ambas as células de cancro do ovário sensíveis e resistentes a cisplatina. Importante, descobrimos que TMOC exibiram menor toxicidade para pré-neoplásicas células epiteliais do ovário humano do que para células neoplásicas sob a mesma concentração.
Nós descobrimos que TMOC induzida G
0 /G ciclo 1 célula
parada através da sub-regulação da ciclina D1 e CDK4, e a regulação das proteínas p16, p21 e p27 (Fig. 3C). A ciclina D1 /complexo de CDK4 é responsável pela progressão do ciclo celular no início de G
1 fase e é frequentemente sobre-expressos em vários carcinomas humanos, incluindo cancro do ovário [39] – [41]. A proteína p16 é um inibidor específico de complexo D CDK-ciclina, impedindo a fosforilação de Rb e reentrada do ciclo celular em G
0 /L
1 fase [39]. p21 e p27, que pertencem à família Cip /Kip, regulam negativamente a progressão do ciclo celular através da inibição de CDK-ciclina complexos [42].
A apoptose é normalmente um sistema equilibrado fortemente regulada por anticorpos anti-apoptóticas e pro efectores de apoptose, incluindo as proteínas da família Bcl-2. As proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-xL promover a sobrevivência de células enquanto que a proteína pro-apoptótica Bax induz a morte celular programada. A proporção de Bax /Bcl-2 é essencial para a indução de apoptose e determina se as células serão submetidos a apoptose [43]. No presente estudo, o tratamento TMOC resultou no aumento da Bax, mas levou à diminuição de Bcl-2 e Bcl-xL (Fig. 4E). O aumento da relação de Bax /Bcl-2 0,07-1,90 pode ser responsável pela apoptose concomitante devido ao rompimento do potencial de membrana mitocondrial e a inactivação de proteínas celulares chave, tais como a PARP-1.
Acumulando estudos fornecem fortes evidências de que a activação da STAT3 tem sido associada com uma variedade de tumores incluindo o mieloma múltiplo, cancro do ovário, cancro da mama, cancro da próstata, e assim por diante [44]. Assim, a supressão da via de sinalização da STAT3 tem emergido como uma forma eficaz para a terapia do cancro. Na nossa presente investigação, os resultados a partir de transferências de Western mostraram que a fosforilação da STAT3 e as suas tirosina-quinases de proteína a montante c-Src (Fig. 6A e 6D) foi inibida por TMOC, que também foi apoiada pela regulação negativa da transcricionalmente regulados alvos, tais como ciclina D1, Bcl-xL e c-myc [33]. Além disso, identificou-se que TMOC pode sobre-regular a expressão de PTEN em todas as três linhas de células, mas apenas sobre-regulada a expressão de p53 em células A2780. Embora, a p53 é relatado para regular negativamente a fosforilação e a actividade de ligação ao ADN de STAT3, facilitando o supressor de tumor PTEN, [36], [45], os nossos dados revelou que TMOC eliciada função anti-proliferação e inibiu a fosforilação da STAT3 independentemente p53 status o que pode indicar que a actividade anti-cancro de TMOC é independente de p53.
Em conclusão, nós fornecemos uma forte evidência de que TMOC inibe o crescimento celular e a motilidade, e induz a paragem do ciclo celular e a apoptose de células cancerosas do ovário humano através reprimindo STAT3 e c-Src de activação. No entanto, um estudo mais aprofundado pode ser necessária para validar o potencial de aplicação TMOC no tratamento do câncer.