Abstract

Fundo

Para descobrir novos marcadores para melhorar a eficácia de câncer pancreático (PC) diagnóstico , o secretome de duas linhas celulares PC (BxPC-3 e MIA PACA-2) foi perfilado. proteína de ligação UL16 2 (ULBP2), uma das proteínas identificadas no secretoma de células PC, foi seleccionada para avaliação como um biomarcador para a detecção de PC, porque o seu nível de mRNA também foi encontrada para ser significativamente elevados em tecidos de PC.

métodos

expressão ULBP2 em tecidos de PC de 67 pacientes foi estudada por imuno-histoquímica. Os níveis séricos ULBP2 em 154 pacientes de PC e 142 controlos saudáveis ​​foram medidos por imunoensaio baseado em grânulo, e a eficácia de soro ULBP2 para a detecção de PC foi comparado com o antigénio utilizado serológica PC marcador de hidratos de carbono 19-9 (CA 19-9).

Resultados

análises de imuno-histoquímica revelou uma expressão elevada de ULPB2 em tecidos de PC em comparação com os tecidos não cancerosos adjacentes. Enquanto isso, os níveis séricos de ULBP2 entre todos os pacientes de PC (n = 154) e em pacientes com câncer em estágio inicial foram significativamente maiores do que os controles saudáveis ​​(

p Art 0,0001). A combinação de ULBP2 e CA 19-9 superou cada marcador isoladamente em pacientes PC distintivas de indivíduos saudáveis. É importante ressaltar que uma análise da área sob curva ROC mostrou que ULBP2 foi superior ao CA 19-9 em discriminar pacientes com PC em estágio inicial de controles saudáveis.

Conclusões

Em conjunto, a nossa resultados indicam que ULBP2 pode representar um romance e biomarcador de soro útil para rastreio primário câncer de pâncreas

Citation:. Chang YT, Wu CC, Shyr YM, Chen TC, TL Hwang, Yeh TS, et al. (2011) Identificação secretoma-base de ULBP2 como um Novel Serum marcador para detecção de cancro do pâncreas. PLoS ONE 6 (5): e20029. doi: 10.1371 /journal.pone.0020029

editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 21 Janeiro, 2011; Aceito: 10 de abril de 2011; Publicado em: 20 de maio de 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Chang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por subvenções do Conselho Nacional de Ciência Taiwan (NSC 96-2320-B-182-031-MY3), Departamento de Saúde (DOH-99-TD-C-111-006), e Ministério da Educação (EMRPD180241 e EMRPD180091). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas (PC) é a quarta principal causa de mortalidade relacionada ao câncer nos Estados Unidos com uma sobrevida de 5 anos menos de 7% [1], [2]. Em 2010, mais de 43000 novos casos de PC foram estimados para desenvolver e 36.800 mortes foram esperado nos Estados Unidos [1]. Em Taiwan, é ocupava o décimo lugar entre as mortes relacionadas com cancro em 2008 e mostra aumento da taxa de mortalidade na última década [3]. Devido à disseminação precoce de PC e o aparecimento tardio dos sintomas aparentes, menos de 8% de pacientes são diagnosticados de PC na fase localizada quando uma cura cirúrgica é possível [1], [4], [5]. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de desenvolver melhores estratégias para a detecção precoce do PC.

As abordagens atuais para o diagnóstico PC são baseados principalmente em imagem e métodos endoscópicos [6], que, devido à localização retroperitoneal do pâncreas , têm uma probabilidade limitado de diagnóstico precoce [7], [8]. Uma elevação dos níveis séricos de antigénio de carbohidrato 19-9 (CA 19-9) tem sido amplamente utilizado para a detecção de PC; No entanto, esta abordagem é insuficiente no que diz respeito à especificidade e sensibilidade, tanto [6], [9], [10]. Além de CA 19-9, mais de 40 proteínas têm sido relatados como potenciais marcadores serológicos para a detecção de PC [11]. Infelizmente, a maioria tanto têm limitado especificidade e /ou sensibilidade, ou esperar validação com uma coorte em larga escala de espécimes [11] – [17], apesar da evidência de que o uso de um painel de biomarcadores combinatória melhora a precisão do diagnóstico do PC [12] . Portanto, a descoberta de novos e marcadores séricos úteis poderiam facilitar a melhoria do diagnóstico PC e /ou prognóstico.

Recentemente, as abordagens baseadas em secretoma têm sido amplamente aplicada na identificação de biomarcadores potenciais de câncer [18], [ ,,,0],19]. No presente estudo, analisamos o secretoma de duas linhas de células PC, BxPC-3 e MIA PaCa-2 e avaliada uma das proteínas identificadas, proteína UL16 de ligação 2 (ULBP2), como um biomarcador potencial de PC. resultados de coloração imuno-histoquímica confirmou os níveis elevados de ULBP2 em tecidos de PC em comparação com os seus homólogos não-cancerosas adjacentes. imunoensaios baseados em grânulo validado ainda mais os níveis séricos elevados de ULBP2 em pacientes de PC em comparação com indivíduos saudáveis. Mais importante ainda, o uso combinado de ULBP2 com CA 19-9 melhorou a sensibilidade e precisão da detecção precoce PC neste estudo de caso-controle, proporcionando uma abordagem promissora para o diagnóstico PC em um estágio inicial.

Materiais e Métodos

população de pacientes e amostras clínicas

amostras tumorais de pacientes com 67 PC (idade média, 64; intervalo: 35-82) foram coletadas no Chang Gung Memorial Hospital (CGMH), Lin-Kou, Taiwan. As amostras de tecido foram recolhidas no momento da cirurgia, avaliada por patologistas, e armazenado no Banco de Tecidos CGMH até à sua utilização. Amostras de soro de 154 pacientes PC (idade média, 70; alcance, 31-87) foram coletadas em Taipei Veterans General Hospital, Taipei, Taiwan. amostras de sangue adicionais, incluindo 142 amostras de soro de doadores saudáveis ​​(idade média, 58; alcance, 34-86), 25 amostras de plasma de dadores saudáveis ​​(idade média, 54; alcance, 29-79), 28 amostras de soro de carcinoma da nasofaringe ( NPC) pacientes (idade média, 46; gama, 31-80), 29 amostras de soro de carcinoma colorretal (CRC) pacientes (idade média, 61; pacientes intervalo, 30-83), e 30 amostras de plasma de câncer gástrico (GC) (idade média, 66; gama, 33-83), foram coletadas no CGMH, Lin-Kou, Taiwan. Alíquotas destas amostras foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. Esta pesquisa seguiu os princípios da Declaração de Helsinki e todos os sujeitos assinaram um consentimento informado aprovado pela Revisão Institucional Conselho de Chang Gung Memorial Hospital ou Taipei Veterans General Hospital, Taiwan antes de sua participação neste estudo e para a utilização de amostras de tecido ou sangue coletadas antes do tratamento.

cultura celular

As linhas celulares PC BxPC-3, MIA PaCa-2, PANC-1 e AsPC-1 foram comprados da coleção Bioresource e Centro de Pesquisa (Hsinchu, Taiwan) . BxPC-3 e AsPC-1 foram mantidas em soro fetal bovino a 10% (FBS, Biological Industries, Israel) -supplemented meio RPMI-1640 (Invitrogen, CA, EUA). MIA PaCa-2 e PANC-1 foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen) com FBS a 10% mais soro de cavalo a 2,5% (Biological Industries) e FBS a 10%, respectivamente. As quatro linhas de células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 ambiente.

Geração de secretoma conjunto de dados de linhas celulares de cancro

Os métodos utilizados para a preparação de células de cancro meio condicionado (CM) e profiling secretome foram descritos anteriormente [20] e detalhada em Materiais e Métodos S1.

Pesquisa de banco de dados de domínio público para os perfis de genes alvo seleccionados expressão

os perfis da expressão proteínas secretadas em tecidos de PC foram pesquisados ​​no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) Gene Expression Omnibus de banco de dados (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). O conjunto de dados GSE1542 foi seleccionada para a identificação de genes candidatos com os níveis de expressão elevados em células PC [21]. O conjunto de dados GSE1542 contém os perfis de células do ducto pancreático isoladas de 24 pacientes com adenocarcinoma ductal pancreático e 25 doadores com um pâncreas normal, [21] de expressão gênica. As intensidades médias de cada sonda do gene em grupos saudáveis ​​e cancerosas foram calculados para se obter a Tumor /Normal (T /R); genes com relações N /T ≥2 foram considerados up-regulamentado candidatos. Entre eles, aqueles com

p

-Valores inferior a 0,05 calculado pela

t

-test foram ainda selecionados como os candidatos mais promissores para a expressão elevada em tecidos cancerosos.

Western análise de mancha

proteínas em extractos celulares e CM foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para membranas de PVDF (Millipore, MA, EUA), e sondados com os anticorpos contra a transformação do crescimento induzida pelo factor-β-proteína IG-H3 ( BIGH3) (diluição 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), ULBP2 (1:1000 diluição; R D Systems, MN, EUA) ou α-tubulina (1:10000 diluição; Millipore). As proteínas de interesse foram detectados por incubação durante 1 hora com a peroxidase de rábano apropriado (HRP) -conjugated anticorpos secundários (Santa Cruz Biotechnology), e visualizada utilizando um sistema de quimioluminescência aumentada (Perkin Elmer, MA, EUA).

A imuno-histoquímica

A coloração imuno-histoquímica foi realizada com anticorpos contra BIGH3 (1:100 diluição; Santa Cruz Biotechnology) e ULBP2 (diluição 1:20; R D Systems). Os protocolos de coloração são descritos nos Materiais e Métodos S1. Expressão de proteínas alvo foi avaliada de acordo com o sistema simplificado pontuação H, que se baseia na intensidade de coloração das células (3, forte; 2, moderada; 1, fraco; 0, sem coloração de células) e a percentagem de coloração das células [3 , ≥90%; 2, 50-89%; 1, 10-49%; 0, 0-9%)]. As duas pontuações foram multiplicados e depois dividido por 3 para obter a pontuação final. A coloração positiva foi definida como uma pontuação final ≥0.67 [22], [23]

analisa Serum

Serum BIGH3 e CA 19-9 níveis foram determinados utilizando os kits ELISA de R . D sistemas de diagnóstico e alfa (TX, EUA), respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante respectivo. Para determinar a concentração sérica ULBP2, o imunoensaio baseado no talão in-house sanduíche ELISA e foram estabelecidos em nosso laboratório (ver Materiais e Métodos S1 para detalhes).

A análise estatística

As diferenças de imuno-histoquímica pontuações e níveis séricos de proteínas-alvo entre os grupos foram testadas usando o teste de Wilcoxon ou teste de Kruskal-Wallis. Correlações entre os níveis séricos de proteínas-alvo foram calculados utilizando a correlação de Pearson, e dezenas de imuno-histoquímica de amostras pareadas de o mesmo assunto foram comparados utilizando emparelhado

t

-Testes. operador receptor característica (ROC) foram construídas por plotagem da sensibilidade versus 1-especificidade e as áreas sob as curvas ROC (AUC) foram analisadas pelo método de Hanley e McNeil. Todos os testes foram em frente e verso, e uma

p

-valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os dados foram processados ​​usando o software SPSS versão 13.0 (IL, EUA).

Resultados

análise secretoma de duas linhas celulares de cancro pancreático

Para descobrir potenciais biomarcadores PC do soro, as proteínas secretadas de linhas celulares de PC foram analisados ​​sistemicamente. A representação esquemática do diagrama de fluxo utilizado é ilustrado na Fig. 1A. As proteínas presentes na CM isento de soro 24 h de PACA-2 células BxPC-3 e MIA foram separadas por SDS-PAGE, visualizadas por com azul de Coomassie (Fig. 1B, painel superior), cortado em 40 fracções, digeridos individualmente com tripsina e analisada por C-18 de fase reversa, cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS /MS). O padrão de coloração das proteínas do ligado celular é também mostrada em paralelo para demonstrar que as proteínas segregadas foram enriquecidas em CM, e o seu padrão foi muito diferente do que gerado por proteínas intracelulares (Fig. 1B, painel superior). A distribuição da proteína, alfa-tubulina citosólica, foi ainda analisada como controlo. Alfa-tubulina foi claramente detectada nos extractos celulares, mas não na do MC (Fig. 1B, painel inferior), indicando que as proteínas recuperadas a partir do CM não foi devido à morte das células.

(A), A secretoma estratégia consiste em cancro e análise tranacriptome tecido. (B), as proteínas (50 pg) em CM e extractos celulares (CE) das células de cancro foram resolvidas por 10% SDS-PAGE e coradas com azul de Coomassie (painel superior) ou análise de imunotransf erência foram submetidos com alfa-tubulina (painel inferior ). (C), a análise Immunoblot com anticorpos anti-BIGH3 e ULBP2.

Depois de pesquisar com o algoritmo da mascote e estabelecendo um corte de 95,0% de probabilidade peptídeo e proteína probabilidade de 95,0% em software de andaime, de 1011 e de 1141 proteínas com múltiplas (≥2) visitas de péptidos foram encontrados no BxPC-3 e MIA PaCa-2 cm, respectivamente (Tabelas apoio S1 e S2), resultando em proteínas não redundantes 1427 e 725 se sobreponham.

Geração de lista biomarcador candidato para detecção de PC

para diminuir a lista de candidatos, os níveis das 725 proteínas comuns em células do ducto pancreático expressão foram examinados em uma análise baseada em array publicada por Ishikawa et al. [21], em que se comparou a expressão do gene em células do ducto pancreático derivados a partir de 24 pacientes com adenocarcinoma ductal do pâncreas e 25 dadores com um pâncreas normal (Fig. 1A). Esta análise revelou que 10 dos 725 proteínas foram significativamente regulada positivamente (≥2 vezes a sobre-expressão,

P

0,05) em carcinoma ductal pancreático em comparação com células que não de tumor do ducto pancreático (Tabela 1). Entre eles, ceruloplasmina foi confirmado para ser sobre-expresso em tecidos de PC [24], e elevado nível sérico de proteína alfa ERO1 semelhante tem sido relatada em doentes de PC em comparação com controlos saudáveis ​​[17], o que indica que a análise combinada do secretoma e transcriptoma é uma estratégia viável para a descoberta de marcadores candidato PC novos.

a superexpressão de ULBP2 e BIGH3 em tecidos PC

Nós concentramos nossa atenção sobre ULBP2 e BIGH3 como marcadores potenciais PC (Tabela 1) porque a outra análise à base de matriz também tinham demonstrado que os seus níveis de ARNm foram significativamente aumentados em tecidos PC [25], e ainda não tinham sido estudados em PC. Foi confirmada a presença de BIGH3 e ULBP2 na CM recolhidas a partir de quatro linhas de células PC (BxPC-3, MIA PACA-2, PANC-1 e AsPC-1) por análise de Western blot (Fig. 1C). Outras análises imuno-histoquímicos mostraram coloração positiva para BIGH3 ULBP2 e em 41,9% (13/31) e 100,0% (67/67), respectivamente, das secções de tecido de PC. Inspecção de cada secção de tecido contendo tecido ductal tanto não-cancerosas e cancerosas revelou maior expressão de ambas as proteínas nos tecidos cancerosos do que nos homólogos não-cancerosas na maioria das secções de tecidos examinados (figura 2A;. Apoiando Figuras S1 e S2). As pontuações de imuno-histoquímica de ambas as proteínas em tecidos tumorais foram estatisticamente superiores aos homólogos não-cancerosas: 0,54 ± 0,46 contra 0,14 ± 0,27 para BIGH3 (

p Art 0,0001) e 2,71 ± 0,49 contra 1,89 ± 0,74 para ULBP2 (

p Art 0,0001) (Fig. 2B). Outras análises mostraram que os níveis de expressão em tecidos tumorais não foram estatisticamente associados com a idade, sexo, grau histológico, estágio global tumor ou tumor-nódulo-metástase (TNM) classificação de câncer pancreático (Armários S3 e S4).

(a), coloração imuno-histoquímica para BIGH3 (painel da esquerda) e ULBP2 (painel da direita) em emparelhado pericancerous adjacente não cancerosos (painel inferior) e tecidos tumorais (painel superior). barra de escala, 100 mm. ampliação original, × 400. (B), a análise Box-plot das pontuações de coloração imuno-histoquímica em não-cancerosos (a) e tumorais tecidos adjacentes emparelhados. A caixa indica o th 25

e 75

th percentis da gama de dados; a linha do meio indica a mediana; a linha tracejada mostra a distribuição média de 90%.

Os níveis séricos de BIGH3 e ULBP2 em pacientes PC

Para avaliar o potencial de BIGH3 e ULBP2 como marcadores PC soro, examinamos a sua os níveis no soro de pacientes de PC (n = 154) e controlos saudáveis ​​(n = 142). Medimos níveis BIGH3 soro utilizando um kit de ELISA comercial e níveis ULBP2 séricos determinados utilizando um imunoensaio baseado em grânulo desenvolvido no nosso laboratório que é capaz de detectar as normalmente níveis muito baixos de ULBP2 soro ( 1 ng /mL) de que não pode ser medido com precisão, usando o nosso in-house sanduíche ELISA. O nosso imunoensaio baseado em grânulo pode detectar com precisão os níveis ULBP2 ao longo de um intervalo de 4,3 pg /ml para 31,9 ng /mL (Figura Apoiando S3). Verificou-se que os níveis séricos de ULBP2, mas não BIGH3, foram significativamente elevados em pacientes de PC em comparação com as dos controlos saudáveis: 1,87 ± 1,67 contra 1,29 ± 0,49 ug /mL para BIGH3 (

P

= 0,328; Figura 3A) e 200,2 ± 51,4 168,6 ± 64,6 contra pg /mL para ULBP2 (

P

. 0,0001; Fig. 3B). Usando um valor de corte de 60 pg /mL para ULBP2, descobrimos que os valores de sensibilidade e especificidade para detecção de câncer foram 83,8% e 73,9%, respectivamente. Serum BIGH3 e níveis ULBP2 não foram estatisticamente correlacionada com a idade, sexo, grau histológico, estágio global tumor, ou classificação TNM de PC neste estudo de caso-controle (Apoio Tabela S5). Estes resultados indicam que ULBP2 pode ser um novo marcador para a detecção de soro de PC.

Os níveis séricos de BIGH3 (A), ULBP2 (B), e CA 19-9 (C) foram medidas em 154 doentes com cancro pancreático (PC) e 142 controles saudáveis ​​(Ctrl). Os dados são apresentados como gráficos de caixa. (D), a curva ROC análises da capacidade de BIGH3, ULBP2, CA 19-9, eo painel de dois marcadores compreendendo ULBP2 e CA 19-9 para discriminar pacientes de PC de controles.

O eficácia de ULBP2 e CA 19-9 para o rastreio PC

os níveis séricos de CA 19-9, um biomarcador PC soro actualmente utilizados, adicionalmente, foram ensaiadas nas mesmas amostras. Descobrimos que os níveis séricos de CA 19-9 foram maiores nos pacientes de PC do que nos controles saudáveis ​​(63,4 ± 24,4 versus 28,3 ± 20,2 U /mL,

p Art 0,0001, Fig 3C.); como ULBP2, CA 19-9 níveis não se correlacionaram com características clínico-patológicas (apoiando Tabela S5). Outras análises mostraram que não houve correlação entre as duas moléculas no grupo de pacientes (r = 0,061,

p

= 0,453 por correlação de Pearson; Apoio Figura S4). Aos 40 U /mL, o valor de corte aplicado atualmente para o rastreio PC, os valores de sensibilidade e especificidade para o CA 19-9 foram 84,4% e 74,6%, respectivamente. Notavelmente, a aplicação de um valor de corte de 60 pg /mL para ULBP2, fomos capazes de discriminar 21 de 24 pacientes com PC CA 19-9 níveis 40 U /mL de indivíduos saudáveis. Além disso, 24 dos 36 indivíduos saudáveis ​​com CA 19-9 níveis 40 U /mL poderia ser mais distinto de pacientes com base nos níveis ULBP2 . 60 pg /mL

O utilitário de ULBP2 e CA 19 -9 como marcadores de detecção foi ainda testada através da aplicação de uma análise da curva ROC. Esta análise demonstrou que ULBP2 (AUC = 0,862; 95% intervalo de confiança [IC], 0,821-0,904) realizaram um pouco melhor do CA 19-9 (AUC = 0,856; 95% CI, 0,809-0,902) como um marcador de rastreio (Fig. 3D). Mais importante ainda, um modelo de regressão logística [26] mostraram que a capacidade de diagnóstico da combinação de ULBP2 e CA 19-9 foi maior do que a de qualquer um dos marcadores sozinho (AUC = 0,910, IC de 95%, 0,877-0,943; A Fig. 3D) . Colectivamente, estes resultados indicam que ULBP2 pode ser um marcador PC soro útil, especialmente quando usado em conjunto com CA 19-9.

A adequação de ULBP2 e CA 19-9 para a detecção precoce PC

em seguida, avaliamos a adequação de ULBP2 como um marcador de detecção precoce do PC por níveis séricos de testes ULBP2 em pacientes com tumores em estágio inicial primárias (TNM-T1 /T2), sem metástase ganglionar (TNM-N0), e pelo tumor geral início estágios (fase I-II). Descobrimos que os níveis séricos ULBP2 foram significativamente maiores em pacientes com tumores primários em estágio inicial (205,7 ± 184,3 pg /mL,

p Art 0,0001, n = 34), sem metástase ganglionar (191,6 ± 155,2 pg /mL,

p Art 0,0001, n = 57), e em um estágio inicial do tumor geral (181,2 ± 158,8 pg /mL,

p Art 0,0001, n = 106) do que em controlos saudáveis ​​(51,4 ± 64,6 pg /ml, n = 142; Fig. 4A). Soro CA 19-9 níveis também foram elevados nos estágios iniciais do tumor primário (56,3 ± 26,9 U /ml,

P

0,0001), metástase linfática (62,1 ± 25,5 U /ml,

p Art 0,0001), e estágio global tumor (60,7 ± 24,4 U /mL,

p Art 0,0001) em comparação com controles saudáveis ​​(28,3 ± 20,2 U /mL, n = 142), ( A Fig. 4B). As análises curva ROC mostrou ainda que ULBP2 era mais apropriado do que CA 19-9 para discriminar controles saudáveis ​​de pacientes com PC diagnosticado como TNM-T1 /T2 (AUC = 0,854 [IC 95%, ,778-,930] versus AUC = 0,796 [95% Cl, 0,690-0,901]), TNM-N0 (AUC = 0,866 [IC de 95%, 0,811-0,920] versus AUC = CI 0,841 [95%, ,764-0,917]) ou fase I /II (AUC = 0,846 [95% Cl, 0,798-,895] versus AUC = 0,839 [IC de 95%, 0,782-0,896]; A Fig. 4C). Mais importante ainda, a combinação dos dois marcadores foi melhor para distinguir entre indivíduos saudáveis ​​e TNM-T1 /T2- (AUC = 0,883, IC de 95%, 0,816-0,949), TNM-N0- (AUC = 0,893, IC de 95%, pacientes 0,841-0,946), ou a fase I /II-PC (AUC = 0,897, IC 95%, 0,856-0,937) do que qualquer um dos marcadores sozinho (Fig 4C).. Estes resultados implicam que ULBP2 é um marcador do soro potencialmente útil para a detecção precoce de PC, em particular em conjunto com o CA 19-9.

Os níveis séricos de ULBP2 (A) e CA 19-9 (B) em controlos saudáveis ​​( Ctrl) foram comparados com os de pacientes com PC-fase precoce. Os dados são apresentados como gráficos de caixa. (C), a curva ROC análises da capacidade de ULBP2 (linha preta), CA 19-9 (linha tracejada), e uma combinação de ambas as proteínas (linha grossa) para discriminar pacientes de PC em estágio inicial de controles.

níveis sanguíneos ULBP2 em pacientes com outros tipos de câncer

para testar se ULBP2 também é um marcador para outras doenças malignas, determinamos níveis ULBP2 no sangue de pacientes com CCR, NPC, e GC. Descobrimos que os níveis séricos ULBP2 tendeu a ser maior em doentes que sofrem de NPC (65,5 ± 74,3 pg /mL,

p

= 0,122, n = 28) em comparação com controles saudáveis ​​(51,4 ± 64,6 pg /mL) e eram moderadamente, mas significativamente, mais elevado em pacientes de CRC (70,6 ± 73,8 pg /ml,

P

= 0,038, n = 29; a Fig. 5A); Os níveis plasmáticos de ULPB2 não foram significativamente diferentes entre os indivíduos saudáveis ​​(86,1 ± 101,2, n = 25) e pacientes GC (78,1 ± 79,7 pg /ml, n = 30,

P

= 0,673; A Fig. 5B). No entanto, os níveis séricos foram ULBP2 surpreendentemente elevados em pacientes de PC em comparação com aqueles em CRC (200,2 ± 168,6 ± 70,6 contra 73,8 pg /ml,

P

0,0001) e NPC (200,2 ± 168,6 ± 74,3 contra 65,5 pg /mL,

P

0,0001) dos pacientes (Fig 5A).. A observação de que níveis ULBP2 foram inalterado ou apenas marginalmente elevada em dois outros cancros gastrointestinais, CRC e GC, sugere que ULBP2 pode representar um marcador relativamente específico PC.

(A), os níveis séricos ULBP2 em controles saudáveis ​​(Ctrl ) foram comparados com os de pacientes com carcinoma nasofaríngeo (CNP, n = 28) e carcinoma colorrectal (CRC, n = 29). (B), os níveis plasmáticos ULBP2 em controles (Ctrl, n = 25) foram comparados com os de pacientes com câncer gástrico (GC, n = 30).

Discussão

CA 19 -9 é actualmente considerado como o mais viável marcador PC soro [27], [28]. No entanto, porque o CA 19-9 também é elevada em outras doenças gastrointestinais, incluindo pancreatite, hepatite, obstrução biliar, e outros cancros gastrointestinais, [9], [27], [28], a sua especificidade não é fiável. Além disso, não é expressa em sujeitos com uma Lewis-B- genótipo [29], e PC pobremente diferenciadas aparece a produzir menos CA 19-9 de cancros moderadamente ou bem diferenciados [28], limitando assim a sua sensibilidade de detecção. Claramente, a identificação de novos marcadores de PC que contornadas essas limitações seria um desenvolvimento bem-vindo.

Neste estudo, foi utilizada uma abordagem integrada, análises combinadas do secretome células PC e transcriptoma para identificar candidatos PC novo marcador, e fornecem a primeira evidência de que ULBP2 é um potencial marcador sérico novo candidato para o diagnóstico de PC. ULBP2 foi sobre-expresso em células PC em comparação com os tecidos adjacentes não cancerosos (Fig. 2). imunoensaios baseados em grânulo realizados com mais de 150 amostras de soro de pacientes com PC revelaram que os níveis séricos ULBP2 não apenas discriminados pacientes a partir de dadores saudáveis, mas também demonstrou um grande potencial para a detecção precoce de PC (Figs. 3 e 4). Embora vários marcadores potenciais PC no soro têm sido relatados, muito poucas têm sido mostrado para ser superior ao CA 19-9 [30], [31]. Importante, a nossa comparação de ULBP2 soro com CA 19-9 neste estudo de caso-controle mostrou que ULBP2 soro é superior ao CA 19-9 como um marcador de diagnóstico precoce (Fig. 4). Esta descoberta é particularmente significativo à luz do facto de que a maioria dos pacientes de PC morrem dentro de um ano, porque eles não são diagnosticados até que o cancro atinge uma fase avançada [1]. O potencial diagnóstico e prognóstico de ULBP2 num ambiente clínico será necessário ser verificado através de uma série maior de amostras de soro. Além disso, os candidatos adicionais listados na Tabela 1 não foi estudada em detalhe para o PC, mas os seus níveis de expressão pode ser analisado em tecidos PC utilizando Atlas base de dados de Proteína Humana (HPA), que contém a imuno-histoquímica (IHC) A coloração por perfis de 10118 proteínas numa variedade de tecidos cancerosos e não cancerosos baseada em anticorpos 13154 (versão 7.1, https://www.proteinatlas.org/) [32]. Foram pesquisados ​​8 proteínas na base de dados e HPA encontrado cinco deles foram detectados em mais de 50% das secções de PC examinados. Noteworthily, proteína de ligação solúvel NSF-alfa, anexina A11, e alfa-proteína ERO1 como foram expressas em mais de 50% das secções de PC com moderada a forte coloração IHC (Apoiando Tabela S6). Estas três proteínas podem representar como potenciais biomarcadores de PC que merecem uma investigação mais aprofundada.

Um consenso se formou em volta da ideia de que a detecção eficaz e preciso de câncer em estágio inicial provável contará com painéis de marcadores que possuem uma melhor especificidade e sensibilidade do que cada marcador isoladamente [26], [33]. Como observado acima, CA 19-9 é actualmente utilizado para a detecção de PC, mas o seu uso como um agente de rastreio primário é problemática. Assim, um painel de marcadores que combinada CA 19-9 com outros marcadores úteis, tais como ULBP2, poderia aumentar a capacidade de detecção e monitorização do cancro. De facto, a combinação de ambos os marcadores de diagnóstico evidenciou uma eficácia melhorada em comparação com a abordagem tradicional usando CA 19-9 sozinho, especialmente no que diz respeito à detecção de PC na fase inicial (fig. 4).

Embora tem ULBP2 foi avaliado como um marcador de prognóstico tecido e no soro para o cancro do ovário [34] e melanoma [35], respectivamente, acreditamos que ULBP2 ainda tem potencial como um teste de soro relativamente específica e útil para o diagnóstico de PC. Uma série de linhas de evidência apoiar este: (a) de soro ULBP2 /níveis plasmáticos não foram significativamente elevados em pacientes GC, CRC ou NPC em comparação com indivíduos saudáveis ​​neste estudo; (B) Li et ai. relataram que ULBP2 não era detectável no soro de pacientes de cancro do ovário [34]; (C) de Paschen et ai. mostraram que não era mensurável ULBP2 em mais de 20% dos soros testados a partir de pacientes com melanoma, particularmente em doentes em fase inicial [35]; e (d) ULBP2, ao contrário de CA 19-9, não parece ser expresso em níveis mais baixos em PC pouco diferenciado do que em moderadamente ou bem cânceres diferenciados (quadros de apoio S4 e S5). No entanto, a avaliação da ULBP2 como um marcador de câncer pancreático exigirá grande escala contra-rastreio, particularmente usando amostras de soro de pacientes com pancreatite.

superfície celular ULBPs ea classe principal complexo de histocompatibilidade I-relacionados cadeia (MIC) são ligandos para imunorreceptor expressa por células NK e T (NKG2D) que raramente são expressos pelas células normais, mas aparecem em uma ampla variedade de doenças malignas [36], [37]. Estes ligandos podem activar células assassinas naturais (NK) e células T citotóxicas através da ligação ao NKG2D, e posteriormente contribuem a citólise mediada por células e de apuramento de cancro [38], sugerindo que as células tumorais sobre-expressam estes ligandos são mais susceptíveis à imune mediada por células vigilância. De facto, a expressão MIC tem sido descrito como um indicador de uma melhor prognóstico em pacientes de CRC [39], e a libertação de ligandos NKG2D de células tumorais foi previamente demonstrado como um novo mecanismo immunoevasion cancro [40], [41]. Recentemente, tem sido proposto que derramamento proteolítica de ULBP2 a partir de células de tumores é mediada por metaloproteases de matriz (MMP), e pode prejudicar a imunogenicidade das células tumorais [41]. Através da análise secretoma neste estudo, vários MMPs, incluindo MMP-1, -7, -9, -11, -13, -14, -28 e pode ser detectada em CM partir de linhas celulares PC (Apoiando Tabelas S1 e S2) . Além disso, a expressão elevada de MMP-7, -8, -9, -11 e têm sido descritos em tecidos de PC; dois destes, MMP-7 e MMP-11, estão fortemente associados com o prognóstico do cancro pobre [42]. Estas observações sugerem coletivamente que elevados níveis séricos ULBP2 em pacientes PC poderia refletir o envolvimento de clivagem proteolítica por MMPs liberados do câncer em si. Através da activação NK e imunidade mediada por células T citotóxicas, a eliminação da forma solúvel ULBP2 pode ser uma estratégia terapêutica eficaz no PC. Esta possibilidade intrigante merece uma investigação mais aprofundada.

Em conclusão, nós aqui relatam que os níveis séricos ULBP2 em pacientes de PC são significativamente maiores do que os controles saudáveis. A combinação de ULBP2 e CA 19-9 superou cada marcador isoladamente em pacientes PC distinção de pessoas saudáveis. Mais importante ainda, uma análise da área sob a curva ROC mostrou que ULBP2 foi superior ao CA 19-9 em discriminar pacientes com câncer pancreático em estágio inicial de controles saudáveis. Assim, ULBP2 pode representar um biomarcador romance e soro útil para rastreio primário para câncer de pâncreas.

Informações de Apoio

Figura S1.

Detecção de expressão BIGH3 em 31 tecidos de câncer de pâncreas por imuno-histoquímica.

doi: 10.1371 /journal.pone.0020029.s001

(PDF)

Figura S2.

Detecção de expressão ULBP2 em 67 tecidos de câncer de pâncreas por imuno-histoquímica.

doi: 10.1371 /journal.pone.0020029.s002

(PDF)

Figura S3.

curva padrão de ULBP2 determinada pelo imunoensaio baseado em grânulo desenvolvido internamente.

doi: 10.1371 /journal.pone.0020029.s003

(PDF)

Figura S4.

Correlação de soro ULBP2 e os níveis séricos de CA 19-9.

doi: 10.1371 /journal.pone.0020029.s004

(PDF)

Tabela S1. : Lista de proteínas identificadas no meio BxPC-3-condicionado.

doi: 10.1371 /journal.pone.0020029.s005

(PDF)

Tabela S2. : Lista de proteínas identificadas no meio MIA PaCa-2 condicionado.

doi: 10.1371 /journal.pone.0020029.s006

(PDF)

Tabela S3.

Correlação entre características clínicas e expressão BIGH3 em secções de tecido de 31 pacientes com câncer pancreático.