Abstract

papilar cancro de tiróide (PTC) é uma doença heterogênea e complexa; susceptibilidade a PTC é influenciado pelos efeitos conjuntos de múltiplos genes comuns, de baixa penetrância, embora relativamente poucos foram identificados até à data. Aqui nós aplicamos uma abordagem rigorosa combinados para avaliar tanto o indivíduo e contribuições epistáticas dos fatores genéticos para PTC susceptibilidade, com base em uma das maiores séries de casos de cancro da tiróide descritos até à data. Além de identificar o envolvimento de

TSHR

variação PTC clássico, nosso estudo pioneiro da epistasis revelaram uma interação significativa entre variantes em

STK17B

e

PAX8

. A interacção foi detectada por MD-MBR (p = 0,00010) e confirmado por outros métodos, e depois replicado numa segunda séries independentes de pacientes (MD-MBR p = 0,017). Além disso, nós demonstramos uma correlação inversa entre a expressão de

PAX8

e

STK17B

em um conjunto de linhas celulares derivadas de carcinomas humanos. No geral, nosso trabalho lança luz adicional sobre a base genética de suscetibilidade ao câncer de tireóide, e sugere uma nova direção para a exploração da contribuição genética hereditária para a doença utilizando estudos de associação

Citation:. Landa I, Boullosa C, Inglada -Pérez L, Sastre-Perona A, Pastor S, Velázquez A, et al. (2013) Uma interação epistática entre o

PAX8

e

STK17B

Genes em papilar cancro de tiróide Susceptibilidade. PLoS ONE 8 (9): e74765. doi: 10.1371 /journal.pone.0074765

editor: Xiaoping Miao, MOE chave do Laboratório de Ambiente e Saúde, Escola de Saúde Pública, Tongji Medical College, Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia, China

Recebido: 09 de julho de 2013; Aceito: 05 de agosto de 2013; Publicação: 23 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Landa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do projeto Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) PI11 /01359 (para MR), o Red Temática de Investigação Cooperativa en Câncer, o Instituto de Salud Carlos III, RD12 /0030/0060 (a PS), RD12 /0036/0050 (NM) e S2011 /BMD-2328 TIRONET da Comunidad de Madrid (a MR e PS) e Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional. IL é apoiado por subsídio FIS FI07 /00326; CB é suportado pelos FPI subvenção BES-2008-006332; LI-P é suportada pelo Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras e AS-P é uma companheiros predoctoral do programa FPU (MICINN), respectivamente. SR-LL é um pós-doutorado do FIS (contract # CD05-0055). RDU é suportado por BIO2009-12458 projeto do Ministério da Economia e Inovação espanhol. RM, SP e AV são suportados pela Generalitat de Catalunya, CIRIT (2009SGR-725). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinomas derivados de células foliculares são as neoplasias endócrinas mais comuns e sua incidência tem notavelmente aumentado nos últimos anos [1], [2]. Entre eles, carcinoma de tireóide papilar (PTC, 80-85% dos casos) e carcinoma folicular (FTC, 5-10%) são os subtipos mais frequentes [3]. É amplamente aceito que o câncer de tireóide-derivados de células foliculares se comporta como uma doença complexa, onde vários variantes genéticas, localizado na genes de baixa penetrância (GLP), interagem uns com os outros e com o meio ambiente, modulando assim a susceptibilidade individual [4] – . [6]

Nós relatado anteriormente a associação do

FOXE1

gene com susceptibilidade PTC [7], um resultado que tem sido amplamente replicado [8] – [10]. Até agora, a maioria dos estudos de associação têm-se centrado sobre os efeitos principais e identificado apenas única, ou um número muito limitado de, genes envolvidos na patogênese PTC. Variantes nestes genes explicam uma proporção relativamente pequena dos casos. Enquanto os genes de baixa penetrância adicionais podem ser identificados por estudos futuros de efeitos principais, é também provável que as variantes comuns a diferentes

loci

interagem para modificar a suscetibilidade. Quando variantes genéticas afectar o fenótipo em conjunto de uma maneira não aditiva, esta interacção gene-gene é conhecida como epistasia. A detecção de interações epistáticas representa não só estatística, mas também desafios computacionais [11], [12]. Estes podem ser ultrapassados, concentrando-se estudos de associação em genes que

a priori

poderia desempenhar um papel em conjunto, seja porque eles estão localizados nas mesmas vias, ou porque são diferencialmente expressos em tumores da tiróide. O risco relativo de cancro da tiróide em parentes de primeiro grau de probandos é maior do que para qualquer outra neoplasia não-mendeliana [13] – [15], sugerindo uma componente genética mais forte para a sua etiologia e, por conseguinte, um possivelmente maior probabilidade de identificação de genes para o gene interações.

o objetivo deste estudo foi obter uma visão mais abrangente da base genética da PTC por, por um lado, avaliar ainda mais a implicação de variantes comuns em genes candidatos, e, por outro teste para epistatic interações bidirecionais entre estas variantes. Para este fim, foi adoptada uma abordagem associação de duas etapas, com base em uma das maiores séries de paciente com câncer diferenciado de tireóide descrito até agora. Ele incluía uma descoberta conjunto de 609 casos e 525 controles (I Série), e duas séries replicação independente, compreendendo 969 casos e 1040 controles (Série II e III). Foram identificados e replicados uma interação entre variantes em

PAX8

e

STK17B

, sugerindo que eles podem ser novos jogadores na suscetibilidade ao câncer de tireóide. ensaios funcionais confirmou que a expressão destes genes é inversamente correlacionada, embora o mecanismo subjacente que conduz ao desenvolvimento de câncer tem ainda a ser elucidado.

Resultados

Série Replication expandiu confirmam o envolvimento de

FOXE1

em PTC Susceptibilidade

Nós ainda mais de forma independente replicado a associação previamente relatada com variação comum no

FOXE1

gene [7]. Em nosso segundo, mais recentemente recolhidos Espanhol série de caso-controle (Série III), compreendendo 451 casos PTC e 540 controles, que confirmou a associação altamente significativa para rs1867277 variante funcional na região promotora

FOXE1

, sob o mesmo modelo multiplicativo, com um OR (por alelo) de 1,44 (IC 95% = 1,19-1,74;

P

= 2,0 × 10

-4). Em geral, com base em um total de 1358 casos PTC e 1551 controles de origem europeia branco a partir de Espanha e Itália, a per-alelo OR de 1,45 foi estimado (IC 95% = 1,30-1,61; P = 4,7 × 10

– 12).

a estratificação das Associações específicos do subtipo pacientes revela putativo entre individual SNPs e Thyroid Cancer Risk

Depois de genotipagem de casos e controles em fase de instrução, foram selecionados 9 variantes localizadas em 9 genes diferentes para inclusão na fase de replicação. Cada SNP era ou a mais significativa tagSNP a uma dada

lócus

, ou foi consistentemente previsto para ser funcional, como mostrado na Tabela 1.

A associação mais significativa na fase de descoberta foi obtida para rs2284734 SNP no

TSHR

gene (recessivo OR = 2,64; IC95% = 1,69-4,13;

P

= 1,8 × 10

-5), sugerindo o seu envolvimento como um factor de risco específico para o desenvolvimento da PTC clássico. Observou-se também evidência de um efeito específico do subtipo para rs2687834 no

TG

gene (recessivo OR = 2,28; IC95% = 1,50-3,46;

P

= 1,1 × 10

-4), o que sugere ainda que a estratificação de tumor parece ser um aspecto relevante a considerar em estudos de associação. Isto é mostrado graficamente na Figura S1. A associação de

TSHR

-rs2284734 com CPTC foi marginalmente estatisticamente significativa na fase de replicação (recessivo OR = 1,42;

P

= 0,058, Tabela 1). As associações para os restantes 8 SNPs não foram replicados.

epistasia entre

STK17B

e

PAX8

na tiróide Susceptibilidade

Entre todos os casos PTC, um interação foi observado de forma consistente em análises por três métodos; epistasia entre as rs721992 SNP-par e rs6554198, localizado na

CCDC6

e

KIT

genes, respectivamente, foi detectada por MDR, SNPHarvester e MB-MDR (Tabela 2). No entanto, esta interacção não foi reproduzido em série II e III (p = 0,13).

Quando considerando apenas os pacientes diagnosticados com CPTC, uma interação foi detectada por quatro dos cinco métodos aplicados. Essa interação, envolvendo rs4848323 SNPs e rs1378624, localizado na

PAX8

e

STK17B

genes, respectivamente, tiveram um valor p associado por MB-MDR de 0,00010 na fase de descoberta e de 0,017 na fase de replicação (Tabela 3, Figura 1). O valor p correspondente a partir da análise combinada de dados de ambas as fases foi de 0,00002, estimada em 100.000 permutações. Essa interação foi observado de forma consistente por MB-MDR quando o todo caso série PTC (incluindo todos os subtipos) foi considerado (p = 0,026 e 0,045 para as fases de descoberta e replicação, respectivamente).

frequências relativas de as nove combinações genotípicas da interação replicado (

PAX8 Restaurant –

STK17B

) são mostradas para casos e controles (vermelho e azul colunas, respectivamente). A célula que contém a combinação genótipo de alto risco é destacado em vermelho claro, aqueles com combinações de baixo risco em azul claro, e aqueles com combinações neutras são incolor. Figura 1A – com base na fase de descoberta (série I); Figura 1b – com base na fase de replicação (série II e III); Figura 1c -. Baseado em ambas as fases combinadas (série I, II e III)

A fim de obter insights funcionais sobre a interacção PAX8-STK17B, primeiro avaliou a expressão destes genes usando dados de um estudo com base em array anterior de 63 tumores da tiróide [16] e observou uma correlação inversa (r = -0,77; p = 8,65 × 10

-14; Figura S2). A seguir, foi observado um resultado consistente em uma série de linhas celulares de cancro da tiróide de diferentes tumores humanos; elevada expressão STK17B foi observada nas células indiferenciadas mais humanos anaplásico da tiróide (8505c, Hth7 e Hth83), que são caracterizadas por níveis PAX8 muito baixos ou nulos (Figura 2).

Os níveis de ambos os genes de expressão de ARNm eram determinada por qRT-PCR e são representadas como unidades relativas. O nome da linha celular e sua origem (folicular, papilar ou anaplásico) é indicado.

Para explorar a relação entre PAX8 e STK17B em carcinoma da tiróide, células de rato tireóide foram PAX8-silenciada eo STK17B expressão analisados. Após um dia de silenciamento transiente de PAX8, os níveis de ARNm de PAX8 diminuiu em cerca de 70% em relação ao tipo selvagem ou as células transfectadas siScamble. No entanto, nenhuma alteração foi observada nos níveis de mRNA de STK17B. Os níveis de proteína PAX8 também foram mais baixos nas células silenciados enquanto os níveis de STK17b manteve-se inalterada em relação às células siScamble transfectadas (Fig. 3a). Para determinar se a ausência de correlação era devido à natureza de curta duração do silenciamento, uma linha celular siPax8-estável foi gerada e os níveis de proteína ensaiadas 7, 14 e 21 dias após a transfecção. Mais uma vez, uma diminuição nos níveis PAX8 foi encontrada sem uma variação substancial nos níveis de STK17B. (Fig. 3B).

PCCl3 células foram transitoriamente (A) ou de forma estável (B) silenciados para o factor de transcrição PAX8 (siPax8). Como um controlo, foram usadas tipo selvagem ou células transfectadas siScramble. Os níveis de expressão foram avaliados por meio de qRT-PCR (A, painel superior) ou Western blot (A, painel inferior, e B).

Discussão

Embora o número de LPGs identificados para o carcinoma da tiróide-derivados de células foliculares tem aumentado nos últimos anos, ainda fica atrás de outras doenças complexas. Como recentemente revisto, as associações têm sido consistentemente replicado por apenas um número limitado de

loci

[4], [6], assim, uma grande proporção da hereditariedade da doença multifactorial permanece inexplicado.

o câncer de tireóide tem um forte componente genético, com o risco relativo para parentes de primeiro grau de probandos sendo o maior entre neoplasias não exibindo herança mendeliana regulares [13] – [15]. Um foco na identificação de novos genes através da avaliação de interação gene-gene pode, portanto, revelar, pelo menos, parte deste componente genético inexplicável. Nos últimos anos, o grande número de variantes de susceptibilidade identificados para doenças complexas deu origem à necessidade de realizar análises específicas para avaliar os seus potenciais efeitos epistáticos. A importância dessas análises reside principalmente na revelação como a presença de uma variante genética influencia o efeito de outra variante [17] – [19].

Essas análises epistáticas, ao contrário dos principais efeitos genéticos, constituem uma computacional e desafio estatística. Muitos métodos têm sido desenvolvidos para detectar epistasia, mas todos eles têm limitações e o seu desempenho é variável. Além disso, alguns destes métodos são computacionalmente inviável para dados GWAS [20]. Dado que o nosso estudo considerou apenas 768 SNPs em genes escolhidos com base na sua

a priori

papel putativo na doença, era possível aplicar vários algoritmos mais complexos derivados de estratégias complementares, aumentando assim a robustez de detecção de interacção .

o uso de MB-MDR na segunda etapa de replicação implícita várias vantagens, incluindo a possibilidade de testar o modelo epistatic exata identificados na fase de descoberta, e a capacidade de ajustar para potenciais fatores de confusão, bem como marginal efeitos SNP, esta última para evitar a influência sobre os resultados de pares de SNP que actuam de maneira puramente aditivo. Além disso, um valor de p-permutação com base pode ser facilmente obtida a um custo razoável computacional. O fato de que fomos capazes de replicar uma das duas interacções detectadas na fase de descoberta é uma prova da confiabilidade do nosso pipeline proposto.

Até o momento, um grande número de estudos realizados com modelos de levedura ter identificado gene-inequívoca interações entre genes [21] – [24]. Pelo contrário, tenta identificar epistatic ou outro tipo de interações em susceptibilidade à doença humana têm apenas recentemente começou a produzir resultados [25] – [29]. No entanto, poucos ou nenhuns foram convincentemente replicado. O presente estudo foi, pela primeira vez, identificados e replicado, independentemente, um epistática associação com CPTC susceptibilidade de variantes comuns em dois genes. Este sucesso é provavelmente devido não só para ter uma lista reduzida de genes candidatos, mas também para a alta herdabilidade de câncer de tireóide, bem como a caracterização clínica cuidadosa da série de casos para identificar subtipos da doença com erro mínimo.

a nossa análise da epistasia, aplicada a um estudo de caso-controle com base em uma abordagem de gene candidato [7], identificou uma interação entre

PAX8

e

STK17B

. Este e os resultados futuros das associações genéticas epistáticas poderia ser o primeiro passo para uma caracterização biológica mais profunda do cancro da tiróide.

STK17B

codifica DRAK2, uma quinase serina-treonina envolvido na regulação da apoptose. Foi inicialmente seleccionado como um gene candidato para o estudo com base na sua expressão diferencial em tumores PTC em relação ao tecido normal da tiróide [7], [16].

PAX8

foi escolhido porque é um fator de transcrição da tireóide bem conhecido, relacionada à diferenciação da tireóide, a regulação de genes específicos, e doenças congênitas [30] – [33]. Curiosamente, um estudo recente que combina uma análise de todo o genoma de sítios de ligação PAX8 com perfis de expressão gênica definiu apoptose como uma importante via sob regulação PAX8 [34]. Embora os ensaios funcionais realizadas por siRNA não explicar o mecanismo biológico subjacente, estudos de expressão gênica com base em ambos os tumores humanos e linhas celulares descobriram uma correlação inversa entre

PAX8

e

STK17B

. Este último achado corrobora os resultados do estudo de associação, sugerindo que estes dois

loci

fato interagem para influenciar a susceptibilidade à CPTC. Assim, é tentador especular que PAX8 pode desempenhar um papel na regulação da expressão

STK17B

, apontando para este último gene, relativamente desconhecido como um jogador novo putativa no metabolismo da tireóide.

Finalmente , nossos resultados para variantes individuais em

TSHR

e, possivelmente,

TG

, eo efeito epistatic do SNPs em

PAX8

e

STK17B

, todos aparentemente mais forte para subtipos de doenças específicas, salientar a importância potencial de caracterização do tumor e estratificação em estudos de associação. A associação de rs2284734 tagSNP em

TSHR

com risco de CPTC foi o segundo mais estatisticamente significativa (OR = 2,64; IC95% = 1,69-4,13;

P

= 1,8 × 10

-5), com resultados consistentes observados na fase de replicação (OR = 1,42; IC95% = 0,99-2,03;

P

= 0,058). Vários estudos têm sugerido uma associação entre

TSHR

e susceptibilidade de desenvolver patologias auto-imunes da glândula tireóide [35] – [38], um deles envolvendo o mesmo tagSNP (rs2284734). Uma associação com a doença de Graves »também tem sido relatada [39]. Poucos estudos avaliaram a associação entre o

TSHR

eo risco de câncer de tireóide e aqueles que têm, relataram resultados negativos até agora [40], [41]. No entanto, estudos anteriores avaliaram apenas um número limitado de

TSHR

variantes ex�icas. Parece prematuro descartar esta

lócus

na suscetibilidade ao câncer de tireóide. Fine-mapeamento da região devem ser realizados, a fim de identificar uma variante funcional, possivelmente intrônica e /ou regulamentar, para explicar a nossa associação observada com CPTC.

Em resumo, propomos fatores genéticos adicionais que podem explicar parte da hereditariedade não resolvida de câncer de tireóide. Além de identificar um potencial papel da

TSHR

variantes em risco CPTC, detectamos e independentemente replicado pela primeira vez uma relação epistatic entre o

PAX8

e

STK17B

genes na susceptibilidade câncer de tireóide. Essa interação gene-gene demonstra que os efeitos epistáticos podem desempenhar um papel importante no cancro da tiróide, e poderia explicar a falta de uma associação observada para cada gene individualmente. Mais estudos são necessários para determinar se as interações gene-gene podem ser úteis como marcadores de risco para cancro da tiróide derivados de células foliculares, bem como para outros tumores.

Declaração de Ética Materiais e Métodos

o consentimento informado foi obtido de todos os participantes em protocolos de acordo aprovados pelo “Comité de Bioética y bienestar animais del Instituto de Salud Carlos III” e a Comissão de Ética do Comité das Regiões (Regional Cancer Center), Padova, Itália, que aprovou este estudo

assuntos

Três séries de casos de cancro da tiróide e controles foram recrutados, como descrito a seguir:..

Discovery (série I)

Foram recrutados 609 pacientes com câncer de tireóide a partir da rede hospitalar espanhol. Estes incluíram os principais carcinomas derivados de células foliculares da tiróide: 520 PTC, representada pelos principais subtipos ‘PTC clássico “(CPTC; n = 304) e« variante folicular PTC’ (fvPTC; n = 146); e 69 carcinomas foliculares (FTC). carcinomas medular da tiróide (CMT) não foram incluídos no estudo.

Uma série de 525 controles sem câncer foram recrutados a partir das mesmas regiões geográficas abrangidas pelos hospitais envolvidos no estudo. Para ambos os casos e controla a média de idade foi de 46 anos e a relação feminino: sexo masculino foi 4.6:1

Replication (séries II e III combinado)

Uma segunda série de caso-controle.. (II série), composto 412 PTC e 44 pacientes FTC recrutados em três hospitais localizados na Itália e 500 controles dos mesmos três regiões geográficas.

foi obtido um terceiro grupo, independente de pacientes com câncer de tireóide Espanhol, incluindo 451 PTC e 62 FTC, bem como um conjunto complementar de 540 controles espanhóis (série III).

no geral, o estudo de replicação composta de 969 casos de câncer de tireóide de ascendência europeia branco, incluindo 863 PTC (582 CPTC e 118 fvPTC) 106 e FTC. A idade média foi de 47 anos ea fêmea: masculino razão sexual foi 4.4:1. A idade média do total de 1040 controles foi de 53 anos e a relação feminino: sexo masculino foi 2.4:1

Os médicos de todos os centros participantes completaram um questionário clínico detalhado para cada paciente, que incluiu informações pessoais e clínicos, tais. como subtipo de tumor e estágio, bem como detalhes da cirurgia, tratamento e desenvolvimento de metástases durante o follow-up.

o isolamento de ADN e quantificação

as amostras de sangue ou saliva foram obtidas a partir de todos os casos e controlos. O ADN genómico foi extraído a partir de linfócitos de sangue periférico por meio de métodos automáticos de acordo com as instruções do fabricante (Magnapure, Roche, Madrid, Espanha), ou manualmente, utilizando métodos convencionais [42]. O DNA foi extraído a partir da saliva usando o kit de auto-Colecção Oragene ADN (ADN Genotek, Ottawa, Canadá). concentração de ADN foi quantificado em todas as amostras antes da genotipagem utilizando o Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent (Invitrogen, Eugene, OR, EUA).

Gene de selecção e SNP

Noventa e sete genes candidatos eram seleccionados de uma forma orientada biologicamente e 768 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) (Tabela S1) foram nele identificadas, como descrito anteriormente [7].

SNP Genotyping

SNPs foram genotipados em fase de instrução utilizando o sistema Ilumina GoldenGate® Genotyping Assay (San Diego, CA, EUA), numa matriz de Sentrix Universal-96 de matriz de formato de matriz de multi-amostra. Genotipagem para a fase de replicação foi realizada usando o SNP genotipagem Sistema de Kaspar (Kbiosciences, Herts, UK), como descrito anteriormente [7].

Análise Estatística

Partida de Hardy-Weinberg (HWE ) para todos os SNPs foi testado em controles usando o teste exato de Fisher. principais efeitos SNP foram avaliados por estimativa odds ratio específicas de genótipo (OR) através de regressão logística não condicional, usando homozigotos do alelo mais frequente nos controles como o grupo de referência. Para cada SNP, foi determinado o melhor modelo genético adequado, e o p-valor correspondente foi calculada com base na estatística de Wald. Todos os modelos foram ajustados para o putativo fatores de confusão idade, sexo, e quando relevante, país. Foram avaliados heterogeneidade no subtipo do cancro da tiróide por alelo ou usando um teste de probabilidade-razão, como previamente descrito [43]. As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS para Windows 17.0 e Stata versão 10®, salvo indicação contrária.

métodos para avaliar SNP-SNP Interações

Nós testamos para epistasis usando casos de homogênea e robustamente representada doença grupos, incluindo PTC geral e CPTC. Foram avaliadas as interações bidirecionais entre SNPs utilizando cinco métodos diferentes, Multifactor dimensionalidade redução (MDR) [44], [45], Máxima Entropia Modelagem Condicional Probabilidade (MECPM) [46], SNPHarvester [47], MegaSNPHunter [48], e modelo baseado – Multifactor dimensionalidade redução (MB-MDR) [49]; consulte Métodos de S1). Nós ajustado para sexo e idade em fase de instrução, quando permitido pelo método em questão. Somente as interacções de pares (SNP) identificadas por pelo menos três métodos foram seleccionados para a replicação na série II e III. Usamos MB-MDR para testar na fase de replicação do modelo epistatic identificados na fase de descoberta (consulte Métodos de S1). Idade, sexo e país foram incluídos como co-variáveis. MB-MDR atribui a cada um dos nove possíveis genótipos de dois SNP combinados para três categorias de risco (alto, baixo, e neutros) através de regressão logística. Foram incluídos idade, sexo e país como co-variáveis ​​e calculados os valores de p com base em um teste de permutação [44], [45]. Replicação de interacções foi avaliada por forçando as combinações genótipo nas categorias de risco determinados na fase de descoberta. Interações com um valor de p 0,05 foram considerados replicado. Uma estratégia semelhante foi aplicada a dados combinados de ambas as fases para as interações replicados.

Ensaios Funcionais

cultura celular.

As linhas celulares foram gentilmente doados pelo Dr. Heldin (SW1736, Hth7 e Hth83 [50]), Dr. Fagin (WRO [51]) e Dr. Fusco e Dr. Santoro (BCPAP [52] e TPC-1 [53]), ou obtido a partir da Colecção alemã de Microrganismos e células de Cultura (Cal62, 8505c) ea coleção europeia da cultura celular (NthyORI, FTC133). Todas as linhas celulares foram geneticamente impressões digitais e verificado para ser único e de origem da tiróide [54].

PCCl3 células são uma linha contínua de ratos células foliculares da tiróide que expressam a transcrição específicos da tireóide fatores Nkx2.1, Foxe1, e PAX8. Elas foram cultivadas em modificação de Coon de meio F-12 de Ham, suplementado com soro de doadores de vitelo a 5% e uma mistura de seis-hormona [55].

As linhas de células humanas utilizadas foram derivadas de tecido normal da tiróide ou do folicular , papilar ou carcinomas da tiróide anaplásico. células 8505c, WRO e SW1736, bem como células de controlo NthyORI3.1 foram cultivadas em meio RPMI, enquanto que as células Cal62 FTC133, TPC1, BCPAP e eram de crescimento em meio DMEM, e as células Hth7 e Hth83 em meio MEM. Todos os meios foram suplementados com 5% de soro fetal bovino.

Geração de células da tireóide PCCl3-PAX8-silenciados.

O silenciamento de PAX8 foi realizada em células PCCl3 quer transitoriamente ou estavelmente. transfecção transitória foi levada a cabo usando o reagente de transfecção siRNA DharmaFECT um tanto para mexidos e para

PAX8

condições de siRNA (Dharmacon, Denver, CO). Estável ARN curto hairpin (shRNA) foi obtido por infecção com o plasmídeo de lentivírus pGIPZ contendo a sequência de interferir PAX8 puromicina-resistente ou o seu controlo (mistura) (Abrir Biosystem, Denver, CO).

O ARN total foi obtido a partir de controlo (de tipo selvagem) e a partir de células transitoriamente silenciados-PAX8 (Si

PAX8

ou mexidos siARN) utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante; RT-PCR semiquantitativo foi então realizada como descrito anteriormente [56] utilizando primers específicos para PAX8 (

frente

CAAGGTGGTGGAGAAGATTG e

reverter GAGGTTGAATGGTTGCTG), STK17B (

frente

CCTGAGTTGGCTGAAATG e

reverter

TCTGTTGCTGTGGTAATGGG) ou βactin (

frente

CACTCTTCCAGCCTTCCTT e

reverter CTCGTCATACTCCTGCTTGCT).

Validação de silenciamento PAX8 e expressão STK17B foi testado quer por RT-PCR ou por transferência de Western utilizando um anticorpo policlonal de rato PAX8 (Biopat, Milão, Itália) ou um anticorpo humano STK17B (RD Sistema, Minneapolis, MN), respectivamente. níveis βactin foram utilizados como controle de carga depois de immunoblotting com um anticorpo específico (Santa Cruz Biotechnology, CA).

Informações de Apoio

Figura S1.

representações Manhattan enredo específico do subtipo do diferenças nas freqüências alélicas entre casos e controles da série Discovery. Painel superior:. clássica PTC

vs

controles; painel inferior: variante folicular do PTC

vs

controles.. As áreas destacadas correspondem às variantes de

TSHR

e

TG em, especificamente associado a cada um dos subtipos PTC mencionados, respectivamente. A tabela inserido mostra os resultados para as duas primeiras variantes nos seus subtipos específicos, bem como o correspondente

P

-Valores derivados do teste probabilidade-razão, demonstrando assim a especificidade de subtipo de

TSHR

e

TG em associações

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074765.s001

(TIF)

Figura S2.

agrupamento não supervisionado para sondas PAX8 e STK17B em nossa matriz de mRNA publicado anteriormente, incluindo 63 tumores da tiróide (Montero-Conde et al, 2008- ref. 26). A correlação significativa inversa é observada (r = -0,77; p = 8,65 × 10

-14). Abreviaturas: PTC = papilar da tiróide Carcinoma; FVPTC = variante folicular da PTC; FTC = foliculares da tiróide Carcinoma; FA = folicular Adenoma; PDTC = pouco diferenciado da tiróide Carcinoma; ATC = anaplásico da tiróide Carcinoma; N = Normal Thyroid

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074765.s002

(TIF)

Tabela S1.

lista completa de SNPs estudados na série descoberta

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074765.s003

(DOC)

Métodos S1.

Breve descrição dos métodos utilizados para detectar interações epistáticas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074765.s004

(DOC)

Reconhecimentos

Os autores agradecem Leticia de la Vega pela excelente assistência técnica, bem como Javier Maravall, Ignacio Ramos, Víctor Andía, Paloma Rodríguez-Poyo, Amparo Meoro, Luis Arribas, Pedro Iglesias, Javier Caballero, Joaquín Serrano, Antonio Picó, Francisco Pomares, Gabriel Giménez, Pedro López-Mondéjar e Cristina Álvarez-Escola, que contribuíram para o recrutamento de pacientes e recolha de informação clínica. Agradecemos também o Dr. Erik Heldin (Rudbeck Laboratory, Uppsala, Suécia), Dr. James A. Fagin (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, EUA) e Dr. Alfredo Fusco e Dr. Maximo Santoro (Universita Federico II di Napoli, Nápoles, Itália) para fornecer as linhas de células.