Abstract
Fundo
Nós avaliamos a utilidade da dupla PI3K /inibidor de mTOR NVP-BEZ235 (BEZ235) como terapia de agente único e em combinação com a quimioterapia convencional para o câncer de tireóide.
Metodologia /Principais achados
Oito linhas de células de quatro tipos de cancro da tiróide (papilar, folicular, anaplásico, medular ) foram estudadas. A citotoxicidade de BEZ235 e cinco agentes quimioterapêuticos convencionais sozinhos e em combinação foi medida utilizando ensaio de LDH. expressão mancha ocidental avaliada quantitativa de proteínas relacionadas com o ciclo celular, apoptose e vias de sinalização. a distribuição do ciclo celular e apoptose foram medidas por citometria de fluxo. flanco murino cancros da tiróide anaplásico (ATC) foram tratados com BEZ235 oral diária. Descobrimos que BEZ235 efetivamente inibiu a proliferação de células de todas as linhas de câncer, com ATC exibindo a maior sensibilidade. BEZ235 consistentemente inactivado de sinalização a jusante de mTORC1. BEZ235 geralmente induzida paragem do ciclo celular na fase G0 /G1 e apoptose causada também nas linhas de células mais sensíveis. Os níveis basais de proteína p-S6 ribossomal (Ser235 /236) e p27 correlacionada com a sensibilidade BEZ235. O crescimento de tumores de xenoenxerto de 8505c ATC foi inibida com BEZ235, sem qualquer toxicidade observados. terapia de combinação de BEZ235 e paclitaxel demonstraram consistentemente efeitos sinérgicos contra ATC
in vitro
.
Conclusões
BEZ235 como um único agente terapêutico inibe a proliferação de cancro da tiróide e tem efeitos sinérgicos em combinação com o paclitaxel no tratamento de ATC. Estas descobertas incentivar futuros ensaios clínicos usando BEZ235 para os pacientes com esta doença fatal
Citation:. Lin SF, Huang YY, Lin JD, Chou TC, Hsueh C, Wong RJ (2012) Utilidade de um PI3K /mTOR Inhibitor (NVP-BEZ235) para a terapia do cancro de tiróide. PLoS ONE 7 (10): e46726. doi: 10.1371 /journal.pone.0046726
editor: Guillermo Velasco, da Universidade Complutense, Espanha |
Recebido: 21 Abril, 2012; Aceito: 06 de setembro de 2012; Publicado: October 15, 2012 |
Direitos de autor: © Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pelo Conselho Nacional de Ciência de Taiwan, República da China (NSC 98-2314-B-182A-012 -MY3) (https://web1.nsc.gov.tw/) e em parte por doações do Chang Gung Memorial Hospital e Chang Gung University (CMRPG370581, CMRPG370582, CMRPG370583, CMRPG3A0161) (https://www.cgmh.org.tw/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de tireóide é o tumor maligno mais comum do sistema endócrino, originários a partir de células da tiróide folicular (papilar, folicular, cancro pouco diferenciado e anaplásico) ou células C parafoliculares (câncer medular). A incidência de cancro da tiróide aumentou nos últimos 3 décadas, principalmente de um aumento na detecção de câncer papilar. Em contraste, a incidência do cancro da tiróide folicular e pouco diferenciado permanece inalterada [1], [2]. A maioria dos pacientes com câncer bem diferenciado, incluindo papilar (PTC) e folicular (FTC) câncer de tireóide têm um prognóstico favorável. No entanto, cerca de 5% dos pacientes desenvolvem tumores refratários de iodo radioativo e, geralmente, causar a morte dentro de 5 [3] anos. câncer anaplásico da tireóide (ATC) é uma doença rara, altamente agressivo, e muitas vezes fatal, com uma sobrevida média de apenas 6 meses. cancro medular da tiróide (MTC) é responsável por 3-5% de malignidade tireóide. A frequência da doença metastática regional e distante no MTC diminui as taxas de sobrevivência [4], [5]. são necessários novos tratamentos para o câncer de tireóide refratário e agressivo para melhorar os resultados actualmente pobres para esses pacientes.
A via PI3K /mTOR é importante para o metabolismo celular, sobrevivência e proliferação. Classe I
PI3K A são heterodímeros contendo um p85 regulamentar e um catalítica p110 subunidades que fosforilam o fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP
2), produzindo fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP
3). PIP
3 combina-se com a proteína quinase dependente de um fosfoinositida (PDK1) fosforila a AKT em Thr308. Além disso, a fosforilação de AKT em Ser 473 por mTORC2 é necessária para a actividade completa da AKT. A activação de AKT fosforila mTORC1, que subsequentemente fosforila S6 kinase1 e 4E-BP1, conduzindo a progressão do ciclo celular G1 /S e a inibição da apoptose. PTEN é um supressor tumoral que desfosforila PIP
3 e inactiva a esta via de [6], [7]. Alterações desta via de sinalização ocorrem com freqüência em doenças malignas e são alvos potenciais para a terapia do cancro [6] -.
[8]
No câncer da tireóide, alterações genéticas que afectam a via PI3K /mTOR foram identificados.
PIK3CA
(p110α codificação de classe I
A PI3K) ganho de número de cópias se correlaciona com o aumento da
PIK3CA
expressão da proteína.
PIK3CA
copiar ganho número ocorre mais frequentemente do que as mutações genéticas de
PIK3CA
ou
PTEN
em carcinoma da tiróide [9] – [14]. Mais
PIK3CA /AKT1
mutações e
PIK3CA
copiar ganho são identificados em ATC em comparação com cancro bem diferenciado, sugerindo que a actividade de PI3K /mTOR está envolvida no processo de cancro desdiferenciação [ ,,,0],3], [11], [12]. Para MTC,
RET
mutações proto-oncogene ocorrem em quase todos os casos familiares (25% da MTC) e cerca de metade do CMT esporádico. Este rearranjo ganho-de-função aumenta a transdução de PI3K /mTOR sinalização [15], [16]. Em CMT esporádico sem
RET
mutações, mais de 50% das amostras de tumores mostram ativação da AKT ou mTOR por imuno-histoquímica [16].
BEZ235 é um duplo inibidor da PI3K /mTOR, que reduz PI3K e mTOR a actividade de cinase através de ligação competitiva para a fenda de ligação a ATP destas enzimas [17]. BEZ235 pode tratar cancros através da indução de G0 /paragem do ciclo celular G1 e apoptose, e entrou recentemente fase II de ensaios clínicos [17] – [22]. Este estudo foi realizado para avaliar a eficácia de BEZ235 no tratamento de câncer de tireóide a partir de quatro tipos principais patológicas, incluindo PTC, FTC, ATC e MTC. Nós também explorou efeitos da combinação de BEZ235 e quimioterápicos empregados atualmente contra quatro linhas celulares ATC.
Resultados
citotoxicidade do BEZ235
proliferação celular inibida
BEZ235 em todas as linhas de cancro da tiróide em um dose e o modo dependente do tempo (Figura 1A). Uma dose baixa de BEZ235 a 6,25 nmol /L impedido pelo menos 30% do crescimento celular em seis de oito linhas de células no dia 4. BEZ235 a 100 nmol /L preso de crescimento mais do que 80% de células em linhas ATC, 78% em medular ( TT) e mais de 74% em linhas de cancro da tiróide bem diferenciados. A MS de BEZ235 no dia 4 foi calculada para cada linha celular (Figura 1B). As linhas 4 ATC foram os mais sensíveis à BEZ235 (dm, KAT4C = 3,9, KAT18 = 6,6, 8305C = 6,7, 8505c = 9,3 nmol /L), seguido pelo cancro folicular FRO81-2 indiferenciado (dm, 10,6 nmol /L) . O câncer medular da tiróide (TT), o papilífero bem diferenciado (BHP7-13) e câncer folicular (WRO82-1) eram menos sensíveis (DM 17,1, 17,2, e 43,1 nmol /L, respectivamente).
a, curvas de dose-resposta foram obtidas a partir de células tratadas diariamente com uma série de seis diluições 1:01 de BEZ235. B, a MS da BEZ235 no dia 4 foi calculada utilizando o software CompuSyn para cada linha celular. linhas celulares ATC (KAT4C, KAT18, 8305C e 8505c) teve o menor Dm e, portanto, mais sensível, siga pelo câncer folicular indiferenciada da tireóide (FRO81-2), medular (TT) e papilar bem diferenciado (BHP7-13) e folicular ( WRO82-1) câncer.
a modulação de vias de sinalização por BEZ235
Os efeitos da BEZ235 em vias de sinalização foram examinados em 8505c, TT e BHP7-13 linhas de células (Figura 2, Figura S1). p-4E-BP1 (Thr70), p-4E-BP1 (Thr37 /46) e da proteína ribossómica de p-S6 (Ser235 /236) foram todos consistentemente reprimido por BEZ235 dentro de 2 horas e o efeito de inibição foi significativa e durável, com menos do que 12% de proteína detectada às 24 horas. P-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr204) foi activada por BEZ235 com 2,6-8,6 vezes aumento em 2 a 8 horas, em três linhas de células. No entanto, BEZ235 teve efeitos sobre heterogéneos p-AKT (Thr308) e p-AKT (Ser473), o qual poderia ser inibida por um período de TT e BHP7-13, mas foram persistentemente aumentada em 8505c. Tal como em células 8505c, em células KAT4C BEZ235 similarmente inibida p-S6 proteína ribossomal (Ser235 /236), mas activado p-AKT (Thr308), p-AKT (Ser473) e P-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ( Figura S1 e S2A). O immunoblot foi quantificada e análise estatística foi realizada por p-4E-BP1 (Thr37 /46) em BHP7-13 e proteína ribossômica p-S6 (Ser235 /236) em 8505c e BHP7-13. BEZ235 profundamente inibida estas proteínas por 2 a 4 horas, e este efeito foi durável durante 24 horas (Figura S1). p-4E-BP1 (Thr37 /46) foi reprimida para menos de 12% a partir de 2 a 24 horas e alcançaram significância estatística quando comparado com o nível basal em BHP7-13 (P 0,02, teste t). Analogamente, a proteína ribossomal p-S6 (Ser235 /236) foi significativamente diminuído para menos do que 7% e 13% a partir de 4 a 24 horas em 8505c (p 0,01, teste-t) e BHP7-13 (P 0,02, t- teste), respectivamente. Estes resultados sugerem que BEZ235 tem uma forte capacidade para inibir mTORC1 (conduzindo a uma diminuição de p-4E-BP1 e p-S6 ribossomal proteína) e efeitos mais fracos sobre mTORC2 (que conduzem a efeitos variados em p-AKT em Ser473).
p-AKT (Thr308) e p-AKT (Ser473) foi aumentada em 8505c durante mais de 24 horas. p-AKT (Thr308) e p-AKT (Ser473) foi diminuída de forma transiente em TT e BHP7-13. p-4E-BP1 (Thr70), p-4E-BP1 (Thr37 /46) e da proteína ribossómica de p-S6 (Ser235 /236) foram consistentemente reduzida de 2 horas através de mais de 24 horas em três linhas de células. BEZ235 causou um aumento rápido de p- ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) por 2 a 4 horas em três linhas de células.
Efeitos de BEZ235 no ciclo celular e apoptose
KAT4C , 8505c, TT, BHP7-13 WRO82-1 e foram expostos a BEZ235 durante 24 ou 72 horas (Figura 3a). Em comparação com células de controlo não tratadas, BEZ235 em 6,25, 25 e 100 nmol /L induzida aumentando fracções de células em G0 /G1phase em todas as linhas celulares. Uma linha de células representativa BHP7-13 demonstraram o efeito da BEZ235 sobre a distribuição do ciclo celular (Figura 3B).
a, análise de ciclo celular por meio de medições de conteúdo de ADN revelou o aumento das doses de BEZ235 acumula células em G0 /G1 pela 24 horas (KAT4C, 8505c, BHP7-13 e WRO82-1) e 72 horas (TT). B, uma linha celular representativa, BHP7-13 demonstrado parada do ciclo celular na fase G0 /G1. C, proteínas que regulam o ciclo celular foram avaliadas utilizando imunotransferência em células tratadas com BEZ235 a 100 nmol /L. p53 foi uma diminuição de 2 a 4 horas em 8505c e TT. BEZ235 gradualmente reduzida p21 em TT e BHP7-13. p27 foi aumentada em todas as linhas celulares. Ciclina D1 diminuiu gradualmente em 8505c e BHP7-13. D, a apoptose medida por citometria de fluxo para medir células sub-G1 revelou que BEZ235 aumenta proporções de células sub-G1 em KAT4C e KAT18 às 96 horas. E, immunoblot mostrou BEZ235 induzida degradação do carrasco caspase-3 em KAT4C e KAT18.
Foi examinado o efeito das BEZ235 (100 nmol /L) na expressão de proteínas de ciclo G0 /G1 relacionados celulares ( Figura 3C, Figura S2B e S3). A transição da fase G0 /G1 para a fase S é um processo complexo que envolve ciclinas, quinases dependentes de ciclina (CDK) e as proteínas associadas, incluindo p53, p21, p27 e ciclina D1 [31]. p53 é um supressor de tumores que pode activar a p21, e p21 e p27, tanto são inibidores de cinases dependentes de ciclina G1.
BEZ235 aumento p27 por 4 a 24 horas em todas as linhas celulares, com aumentos máximos de 3,5 a 723,2 – dobre no KAT4C, TT e BHP7-13. Tal relação de aumento não foi mensurável no 8505c devido a um sinal detectável em células não tratadas. A análise estatística foi realizada para a expressão p27 em TT, e atingiu significância a 8 horas, em comparação com a expressão basal (P = 0,019, t-teste) (Figura S3C). Estes dados são consistentes com nosso achado de interrupção do ciclo celular G0 /G1. BEZ235 teve efeitos variados na expressão de p53, p21 e ciclina D1 em 4 linhas de células, que mostra que pode haver diversas contribuições destas proteínas no afectar a progressão do ciclo celular. Um aumento consistente de p27 em células BEZ235 tratada provavelmente exerceu efeitos inibitórios na progressão do ciclo celular em G0 /G1. É possível que a paragem do ciclo celular G0 /G1 é o resultado de um efeito combinado de mais do que uma proteína de G0 /G1 relacionada afectado por BEZ235. Alternativamente, a indução de p27 sozinha pode ser suficiente para parar a progressão do ciclo celular. Numa linha de células negativa PC3M p53, BEZ235 induzida expressão p27 e paragem do ciclo celular na fase G1 completa, sem induzir a p21 [17]. Este estudo demonstrou a inibição do ciclo celular G1 induzido pela BEZ235 não necessário requerer associação com p53 e p21.
A inibição da via PI3K /mTOR pode também conduzir a apoptose [6], [8]. A capacidade de BEZ235 para causar a morte celular por apoptose em células de cancro da tiróide foi explorada (Figura 3D). Em comparação com o controlo, BEZ235 a 25 e 100 nmol /L a apoptose induzida significativamente como medida pela proporção de células sub-G1 em 96 horas em KAT4C. Descobertas similares foram observadas em KAT18, com BEZ235 em 6,25, 25 e 100 nmol /L dirigir uma proporção crescente de células em apoptose. No entanto, BEZ235 não mostraram qualquer aumento de células sub-G1 na 8505c, TT, BHP7-13, e WRO82-1.
Para validar a indução de apoptose em KAT4C e KAT18 por BEZ235, caspase-3 foi avaliado por imunotransferência após 72 horas de tratamento (Figura 3E, Figura S4). Em geral, doses mais elevadas de BEZ235 induzida mais degradação do verdugo apoptose caspase-3, com menos do que 12% da caspase-3 detectado a 100 nmol /L em ambas as linhas celulares. Estes dados sugerem que os mecanismos apoptóticos representam a citotoxicidade de BEZ235 em KAT4C e KAT18. Estes achados são consistentes com relatórios anteriores de BEZ235 que causam a apoptose em algumas, mas não todas, as linhas celulares [17] – [22] .Os mecanismos subjacentes das capacidades variadas de BEZ235 para induzir a apoptose em doses diferentes e em diferentes linhas de células permanecem obscuros [6] – [8].
sensibilidade BEZ235 se correlaciona com a expressão de linha de base de proteína p-S6 ribossomal (Ser235 /236) e p27
A Dm da BEZ235 abrange um amplo espectro em toda a 8 diferentes linhas de células, com uma diferença de 11 vezes entre KAT4C e WRO82-1.To explorar biomarcadores potenciais que se correlacionam com sensibilidade de BEZ235, a expressão da linha de base de proteínas envolvidas na via PI3K /mTOR e RAS /RAF /ERK vias, e cycle- célula proteínas associadas foram avaliadas em 6 linhas de células (Figura 4A). A sensibilidade das seis linhas celulares para BEZ235 foi ordenada de acordo com o valor Dm.
A, os níveis basais de proteínas associadas com a sinalização de transdução e ciclo celular foram avaliados por immunoblot. A sequência de proteínas carregadas estava de acordo com Dm. A expressão da proteína ribossômica p-S6 (Ser235 /236) diminuiu gradualmente a partir KAT4C para BHP7-13, enquanto p-27 mostrou a ordem inversa. A expressão de outras proteínas mostrou uma distribuição aleatória. B, as densidades da banda foram analisados e quantificados. As relações entre a expressão Dm e proteína foram analisados utilizando coeficientes de correlação de Pearson e gráficos foram desenhados usando KAT4C. A expressão da proteína ribossômica p-S6 (Ser235 /236) teve uma correlação positiva, e p27 uma correlação inversa, com sensibilidade para BEZ235.
A expressão da proteína ribossômica p-S6 (Ser235 /236 ) diminui gradualmente através aumentando Dm, enquanto o nível de p-27 aumenta gradualmente através aumentando Dm. relações estatísticas foram analisados pelo coeficiente de correlação de Pearson (Figura 4B). A expressão da proteína ribossômica p-S6 (Ser235 /236) teve uma correlação significativa (R
2 = 0,8475, P = 0,009), com sensibilidade BEZ235, enquanto p27 tinha uma correlação significativa inversa (R
2 = 0,8117, P = 0,014). Uma imunotransferência repetida de p27 mostrou resultados consistentes apêndice (S1). A expressão da linha de base de p-AKT (Thr308), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr70), p-4E-BP1 (Thr37 /46), da proteína ribossómica de p-S6 (Ser240 /244), p -ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p53, p21 e ciclina D1 não revelaram quaisquer correlações com sensibilidade BEZ235 (dados não mostrados).
terapia BEZ235 de tumores do flanco murino
atímicos nu camundongos com xenoenxertos de flanco de 8505c foram utilizados para estudar os efeitos e segurança dos BEZ235
in vivo
terapêuticas. Os animais com tumores estabelecidos de flanco de volumes de partida semelhantes foram tratados com BEZ235 por via oral (50 mg /kg) ou veículo diariamente durante 25 dias e seguidos até ao dia 31 (Figura 5A). crescimento tumoral retardado BEZ235 e a diferença dos volumes dos tumores entre BEZ235 e ratinhos de controlo foi estatisticamente significativa no Dia 21 (94,1 ± 26,4 milímetros
3 e 335,1 ± 78,5 milímetros
3, P = 0,009, t-teste) e no dia 24 (109,9 ± 29,6 mm
3 e 403,1 ± 112,8 mm
3, P = 0,019, teste t). A diferença dos volumes tumorais perderam a significância no dia 28, 4 dias após o tratamento foi interrompido (402,7 ± 123,6 milímetros
3 e 750,3 ± 198,3 milímetros
3, P = 0,15, teste t). ratinhos representativos foram fotografados no último dia do tratamento (Figura 5B).
A, gavagem oral diária de BEZ235 (50 mg /kg) reprime o crescimento do tumor 8505c. As diferenças de volume tumoral entre o grupo BEZ235 e controle alcançado significância estatística nos dias 21 e 24. A significância foi perdida no dia 28, 4 dias após o tratamento foi interrompido. B, os ratos com tumores representativos 8505c de xenotransplante (setas) foram fotografados no último dia de tratamento (dia 24). C, BEZ235 não resultou em qualquer perda de peso, no tratados e ratinhos de controlo (P 0,05 para ambos comparação). D, BEZ235 reprime p-AKT (Thr308) e p-S6 proteína ribossómica (Ser235 /236) por 2 horas e caspase-3 por 4 horas in vivo. PCNA foi ligeiramente reduzida no período inicial. E, a expressão da proteína ribossómica S6-p em células do tumor é detectado por imunocoloração após os períodos indicados (ampliação, 200x). Estes resultados são consistentes com os resultados de Western blot.
BEZ235 não reduziu significativamente o peso corporal entre os dois grupos durante o período de estudo (Figura 5C). BEZ235 oral reduziu a fosforilação de AKT e S6 proteína ribossómica por 2 horas e atingiu os seus maiores efeitos inibitórios às 4 horas com apenas 2% e 10% de pAKT e PS6 restante, respectivamente. Este efeito inibidor persistiu durante 24 horas em tumores de xenoenxerto (figura 5D, Figura S5). PCNA foi ligeiramente e transientemente reprimido de 2 a 4 horas. No entanto, a degradação significativa da caspase-3 ocorreu por 4 horas, com apenas 4% da caspase-3 remanescente por 24 horas. A imuno-histoquímica da proteína ribossómica S6-P (Ser235 /236) em que os tumores tratados com BEZ235 demonstraram uma redução semelhante na coloração, mais acentuadamente de 2 a 6 horas (Figura 5E).
Interacção de BEZ235 e quimioterapia em células ATC
Nós estudamos a combinação de agentes quimioterápicos e BEZ235 contra ATC. Cinco agentes quimioterapêuticos (paclitaxel, irinotecano, etoposido, 5-FU e doxorrubicina) demonstrou efeitos citotóxicos em uma dose e modo dependente do tempo, em quatro linhas celulares de CTA (Figura S6). Os dados foram utilizados para calcular a dose de efeito médio (DM) no dia 4 usando software CompuSyn (Figura 6A).
A, Dm foi calculado usando dados sobre a citotoxicidade utilizando software CompuSyn para cada medicamento em cada linha de células no dia 4. B, os efeitos citotóxicos da BEZ235 e agentes quimioterapêuticos (paclitaxel, irinotecano e etoposido) sozinha ou em combinação após um tratamento de 4 dias em ATC foram avaliadas utilizando ensaios de HDL. A combinação de BEZ235 e paclitaxel demonstrou efeitos sinérgicos em todas as linhas celulares. A combinação de BEZ235 e irinotecano tinha melhorado de efeitos citotóxicos em doses mais elevadas, mas revelaram efeitos terapêuticos benéficos limitados ou não em doses mais baixas. A combinação de BEZ235 mais etoposídeo demonstrou pouca citotoxicidade adicional. C, o IC de BEZ235 e cada agente quimioterápico foi calculada utilizando software CompuSyn. BEZ235 com paclitaxel apresentaram efeitos sinérgicos em todas as linhas celulares, com CI 0,8 para a maioria das condições. BEZ235 irinotecano teve sinérgica para efeitos antagônicos em 8305C, 8505c e KAT18, e efeitos antagónicos em KAT4C. BEZ235 mais etoposídeo demonstrou efeitos principalmente antagônicas em todas as linhas celulares. As linhas tracejadas horizontais na CI = 1 foram atraídos para a discriminação de sinergismo (CI 1) e antagonismo (CI 1). D, as gamas típicas de valores de DRI de agentes quimioterapêuticos em combinação com BEZ235. Com a presença de BEZ235, paclitaxel em sua maioria tiveram as maiores DRIs em 8505c, KAT4C e KAT18, e também demonstrou DRIs favoráveis em 8305C.
Estes Dm de paclitaxel, irinotecano e etoposídeo são realizáveis no soro dos pacientes e são clinicamente relevantes [32] – [34]. Embora a doxorrubicina é usado clinicamente para o cancro da tiróide anaplásico, a relativamente alta Dm nestas linhas celulares implícito que a dosagem clinicamente relevante não é realizável no soro pacientes e, portanto, foi excluídos destes estudos. As interacções entre BEZ235 e paclitaxel, irinotecano, e etopósido foram avaliadas (Figura 6B). A combinação de BEZ235 e paclitaxel melhorou significativamente a citotoxicidade sobre a terapia de agente único em quatro linhas celulares. BEZ235 combinado com irinotecano também aumentou a eficácia terapêutica, particularmente quando as células foram mais afectados. BEZ235 mais etoposido apenas um ligeiro aumento da citotoxicidade.
As interacções entre BEZ235 e cada agente quimioterapêutico foram determinados através do cálculo da IC pela equação Chou-Talalay (Figura 6C). Foram identificados efeitos sinérgicos para a combinação de BEZ235 e paclitaxel em todas as linhas de ATC (CI, 8305C = 0,77-0,86, 8505c = 0,43-0,59, KAT4C = 0,66-0,81 e KAT18 = 0,64-0,71).
A combinação de BEZ235 com irinotecano variou de sinérgica de antagonista em 8305C, 8505c e KAT18 (Cl, 0,86-1,34, 0,97-1,23 e 0,74-1,14) e foi antagonista em KAT4C (CI, 1,09-1,36). A combinação de BEZ235 com etoposido foi ligeiramente sinérgica de antagonista em 8305C (CI, 0,95-1,15) e antagonista em 8505c, KAT4C e KAT18 (Cl, 1,16-1,17, 1,13-2,05 e 1,05-1,19, respectivamente).
Estes resultados demonstram que BEZ235 e paclitaxel teve os efeitos combinados melhor no tratamento de ATC. O DRI calculado do agente de quimioterapia significa a dobra da dose de droga que pode ser reduzida na presença de BEZ235 (Figura 6D). Entre três agentes quimioterápicos, paclitaxel tiveram as maiores DRIs em 8505c (2.55-4.2), KAT4C (2,25-3,19) e KAT18 (2,59-2,63), e também demonstrou DRIs favoráveis em 8305C (1,55-2,16).
Discussão
BEZ235 proliferação celular efetivamente inibida em oito linhas de cancro da tiróide provenientes de quatro grandes tipos histológicos. ATC foram os mais sensíveis, seguido por folicular indiferenciado, medular e linhas celulares de cancro da tiróide bem diferenciados. As células cancerosas que albergam a mutação de ganho de função PI3K ou um
PTEN
eliminação demonstrar uma maior actividade via PI3K /mTOR e uma maior sensibilidade para BEZ235 [22]. Nossos dados sugerem que ATC baseia-se em atividade PI3K /mTOR, e interrupção desta via com BEZ235 prejudica o crescimento ATC de forma mais significativa do que outros histológicos de câncer de tireóide. As doses relativamente baixas de efeito mediano BEZ235 em todas as linhas de cancro da tiróide ( 44 nmol /L) sugerem que BEZ235 podem ter utilidade para o tratamento de um espectro de doenças malignas da tiróide. cancros refractários que se desenvolvem a activação de PI3K /mTOR no processo de tumor desdiferenciação podem ser alvos particularmente atraentes para a terapia.
O fracasso de BEZ235 para reprimir p-AKT (Ser473) em 8505c e pode ser KAT4C relacionado a uma inibição do feedback negativo. Foi previamente mostrado que a inibição de mTORC1 conduz à inactivação de quinase S6 1, que pode, subsequentemente, esmaga o efeito inibitório de BEZ235 em mTORC2, activa mTORC2, e aumenta a p-AKT (Ser473) em 8505c [35]. relatórios anteriores também demonstraram que doses mais baixas de BEZ235 falha para inibir a p-AKT (Ser473) em algumas linhas de células, e as doses mais elevadas de BEZ235 podem superar o feedback negativo de mTORC1 /S6 quinase 1 ciclo de feedback [18], [20]. Apesar de p-AKT (Ser473) foi activado em 8505c e KAT4C, BEZ235 tinha melhores efeitos inibitórios nestas linhas de células, em comparação com TT e BHP7-13, sugerindo que outras moléculas afectadas pela BEZ235 desempenhar um papel mais importante na determinação do resultado terapêutico.
Descobrimos que a expressão da proteína p-S6 ribossomal (Ser235 /236) e correlacionar p27 com a sensibilidade do BEZ235 no cancro da tiróide. proteína ribossomal S6 é um jusante de quinase S6 1, o qual é activado por mTORC1 [6] – [8]. A fosforilação da proteína ribossómica S6 aumenta de controlo da tradução da síntese de proteínas, e aumenta o crescimento celular. As células com níveis mais elevados de proteína ribossomal S6-P (Ser235 /236) são mais susceptíveis a BEZ235, sugerindo que a inibição da mTORC1 e S6 proteína ribossómica é o principal efeito terapêutico de BEZ235.
Proteína ribossomal
p-S6 (Ser235 /236) também foi recentemente reconhecido como um marcador para prever o efeito terapêutico de um inibidor de mTOR no sarcoma [36]. Neste estudo, as linhas de cancro de tiróide com expressões mais elevados de proteína ribossômica p-S6 (Ser235 /236) também apresentaram níveis mais baixos de p27. Esta constatação sugere a proteína ribossômica S6 é um supressor de p27 em carcinoma da tiróide, e pode explicar por que tanto a proteína p-S6 ribossomal (Ser235 /236) e p27 foram preditores de sensibilidade à BEZ235. Curiosamente, p27 foi previamente anotado para ter uma associação inversa com a atividade da via PI3K /mTOR em células de câncer de tireóide, e a repressão desta via aumenta p27 [37].
4E-BP1 é outra proteína a jusante da mTORC1. A inibição da mTORC1 leva à desfosforilação (activação) de 4E-BP1, reforçando a ligação de 4E-BP1to eIF4E, e bloquear a tradução de proteínas e a proliferação celular [7], [8]. Embora BEZ235 afeta tanto a proteína ribossómica S6 e 4E-BP1 eficientemente, proteína ribossomal única p-S6 (Ser235 /236) prevê expressão de sensibilidade à BEZ235 neste estudo. No cancro do ovário, os biomarcadores prever a susceptibilidade de BEZ235 foi relatada [22], e a expressão de p-4E-BP1 (Thr37 /46) se correlacionaram com a sensibilidade de BEZ235.
Em adição à inibição da progressão do ciclo celular , BEZ235 causou apoptose em duas de seis linhagens celulares. A inibição da progressão do ciclo celular é um efeito conhecido do BEZ235, mesmo em doses mais baixas (≤100 nmol /L). No entanto, a apoptose aparece apenas em algumas linhas celulares de cancro e é mais aparente a doses mais elevadas (100-1000 nmol /L) de BEZ235 [17] – [22]. BEZ235 eficientemente inibida mTORC1, uma molécula de controlo tanto da ciclo celular e apoptose, que pode levar à paragem do ciclo celular e apoptose em KAT4C e KAT18 [7]. Compreender os mecanismos através dos quais BEZ235 contribui para a morte celular por apoptose vai exigir um estudo mais aprofundado.
ATC é de longe o mais agressivo dos quatro principais tipos histológicos de câncer de tireóide. A quimioterapia tem sido aplicado para o tratamento de pacientes com ATC, com taxas de resposta de cerca de 20 a 50%. Novas estratégias para melhorar os resultados são necessários. Entre três esquemas de terapia de combinação, BEZ235 combinado com paclitaxel teve o efeito sinérgico melhor em quatro linhas celulares ATC. As células cancerosas com a activação de PI3K /mTOR são mais resistentes ao paclitaxel, e a co-administração de inibidores de PI3K /mTOR com paclitaxel melhora os efeitos terapêuticos [38] – [40]. Esta descoberta é de relevância clínica, uma vez que o paclitaxel, um estabilizador de microtúbulo, foi mostrado para atingir uma taxa de resposta de 53% em pacientes com ATC em um ensaio clínico de fase II [41]. A combinação de um BEZ235 com vincristina droga despolimerização de microtúbulos também revelou efeito promissor no tratamento de sarcoma de [20]. Nossos dados mostraram que os efeitos de combinações BEZ235 com inibidores de DNA tipo topoisomerase I (irinotecano) ou tipo II (etoposídeo) no tratamento ATC foram em grande parte antagônica. efeitos antagonistas semelhantes de actividade de inibição de ambas as topoisomerase e PI3K /AKT tem sido observada em células de cancro do ovário [42]. As células na fase S são mais susceptíveis a topoisomearse inibidores. acumulação induzida por BEZ235 de células na fase G0 /G1 pode, portanto, reduzir a vantagem terapêutica da terapia concomitante com inibidores da topoisomerase, explicando os efeitos da combinação desfavorável de BEZ235 com irinotecano e etoposídeo.
O tratamento diário de BEZ235 significativa xenotransplante 8505c retardado o crescimento do tumor durante o período terapêutico. O efeito inibidor foi menos proeminente após a interrupção da terapia, sugerindo que o tratamento prolongado pode ser necessário para manter a eficácia terapêutica. BEZ235 degradou significativamente caspase-3 em tumores 8505c de xenotransplante, indicando que este composto pode induzir a apoptose
in vivo
. Após a interrupção do BEZ235, o volume de tumores de xenoenxerto de 8505c posteriormente aumentado. Este alargamento do tumor após a cessação da terapia pode ser devido à normalização de tamanho de célula e a retomada da proliferação de células, como mTOR e suas proteínas a jusante quinase S6 1 e 4E-BP1 desempenham papéis cruciais neste contexto [43]. Não foi observada perda de peso significativa ou doença durante o período de estudo, sugerindo que esta terapia pode ter um perfil de segurança promissora
.
Um relatório prévio demonstrou que a presença de alterações genéticas do
PTEN
,
PIK3CA
e
AKT1
bem correlacionados com sensibilidade a um inibidor de AKT, mas teve correlações mais fracas com um inibidor de mTOR [44]. Esta discrepância sugere que a atividade da mTOR não depende apenas sobre a atividade PI3K /AKT. Os dados reportados de alterações genéticas em linhas celulares de cancro da tiróide 8 foi resumida (Anexo S2). Foram identificadas alterações genéticas limitados sobre RAS /RAF /ERK e PI3K /mTOR. Os dados disponíveis não mostram nenhuma correlação entre aberrações genéticas de PI3K /mTOR e sensibilidade do BEZ235, como nenhuma mutação desta via nestas linhas celulares relatados. Mutações de p53 e BRAF também não parecem estar correlacionados com a sensibilidade do BEZ235, porque tanto sensível (8305C) e linhas de células (WRO82-1) menos sensíveis abrigar as mutações. Exploração de mudanças genéticas do mTOR, o principal alvo de BEZ235, algum dia poderia fornecer informações que podem prever a eficácia terapêutica.
A inibição da mTORC1 pode activar a via MAPK através de um ciclo de realimentação dependente de PI3K [45], o que explica porque BEZ235 foi visto aqui para ativar o ERK1 /2 em células de cancro da tiróide. Combinando BEZ235 com um inibidor da via de MAPK direccionamento pode ser uma potencial abordagem para melhorar a eficácia terapêutica. Recentemente, foi demonstrado que a combinação de um inibidor da pan-RAF e BEZ235 para induzir a paragem do ciclo celular na fase G0 /G1, e tinha efeitos de combinação benéficas no tratamento do cancro da tiróide [46].