Abstract
Introdução
Os níveis de expressão de
miR-146b-5p
e
-3p
microRNAs em câncer de pulmão de células não pequenas humano ( NSCLC) estão associados com a recorrência da doença após cirurgia. Para entender isso, o efeito de
miR-146b
superexpressão foi estudado em células de câncer de pulmão humano A549.
Métodos
células A549, projetado com lentivírus para superexpressão o humano
pré-miR-146b
precursor microARN, foram examinados para a proliferação, a formação de colónias na superfície de plástico e em agar mole, migração e invasão em cultura celular e in vivo em ratinhos, a quimiossensibilidade a cisplatina e doxorrubicina, e a expressão do gene mundial .
miR-146 B originários
expressões foram avaliadas em estroma microdissecção e epitélios de tumores NSCLC humanas. Associação de
miR-146b-5p
e
-3p
expressão em NSCLC fase inicial com recorrência foi analisada.
PRINCIPAIS CONCLUSÕES
A549
pré-miR-146 B originários
-overexpressors tinha 3-8 vezes os níveis mais elevados de ambos
miR-146 B originários
microRNAs do que as células de controlo. A sobre-expressão, não alterou a proliferação celular, a quimiossensibilidade, migração, capacidade de invasão ou; afetou apenas 0,3% do transcriptoma mRNA; e, reduziu a capacidade para formar colónias in vitro em 25%. Nos tumores NSCLC humanas, a expressão de ambos
miR-146 B originários
microRNAs foi 7-10 vezes maior no estroma do que no epitélio canceroso, e superior
miR-146b-5p
mas inferior
-3 níveis
p foram preditores de recorrência.
Conclusões
Apenas um efeito mínimo de
pré-miR-146b
superexpressão no fenótipo maligno foi visto em A549 células. Isto poderia ser por causa dos efeitos de
miR-146b-5p
adversária e
-3p
superexpressão como sugerem os valores de recorrência-preditivo conflitantes dos dois microRNAs, ou porque
miR- 146 B originários
mudanças de expressão no estroma não cancerosos e não cancerosos epitélios de tumores são responsáveis por o valor prognóstico da
miR-146b
Citation:. Patnaik SK, Kannisto e, Mallick R , Yendamuri S (2011) superexpressão do Lung Cancer-prognóstico
miR-146 B originários
MicroRNAs tem um efeito mínimo e negativos no fenótipo maligno de A549 as células do cancro do pulmão. PLoS ONE 6 (7): e22379. doi: 10.1371 /journal.pone.0022379
editor: Boris Zhivotovsky, Karolinska Institutet, na Suécia
Recebido: 05 de maio de 2011; Aceito: 20 de junho de 2011; Publicação: 18 de julho de 2011
Direitos de autor: © 2011 Patnaik et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Estágio de Verão da Associação americana de Cirurgia Torácica para RM e prêmios da Fundação Buswell, Câncer e leucemia Grupo B, ea Cirurgia Torácica Fundação para Pesquisa e Educação para SY. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
os microRNAs são RNAs não-codificantes ultracurtos que regulam processos celulares por sua influência específica de sequência na estabilidade e na tradução de vários RNA mensageiro (mRNA). Estudos ao longo dos últimos anos têm mostrado a importância destas moléculas reguladoras epigenéticas na biologia do câncer [1], bem como a sua utilidade como biomarcadores de estados de doença [2]. Nós previamente quantificada a expressão de microRNAs em 77 estágio humano I não pequenos tumores de câncer de pulmão de células (NSCLC) para identificar microRNAs cujos níveis estão associados com a recorrência da doença após ressecção cirúrgica [3]. Expressão de
miR-146 B originários
microRNAs,
miR-146b-5p
e
miR-146b-3p
, nos tumores diferiu significativamente entre os casos que tiveram uma recorrência e aqueles que não o fez, com a média
miR-146b-5p
nível mais elevado, mas a média
miR-146b-3p
nível mais baixo no primeiro grupo. Além disso, em cross-validações internas,
miR-146b-3p
foi identificada como um componente frequente de seis microRNA máquinas de vetor de suporte classificadores capazes de predizer recorrência com uma precisão média de 69%. maior expressão de
miR-146b-5p
em tumores humanos também foi encontrado para ser associado com a sobrevida global pobre em estágio I-III NSCLC em um estudo que incidiu sobre a variedade de células escamosas da doença, mas não examinou
miR-146b-3p
[4]. Além de câncer de pulmão, um maior nível de
miR-146b-5p
em tumores também está associada a uma doença mais maligna em carcinoma papilífero da tireóide humana [5].
Nos seres humanos, tanto
miR-146b-5p
e
-3p
microRNAs são produtos do mesmo
MIR146B
gene que está localizado no cromossomo 10 na posição q24.32. Como a maioria dos pares de 5p e 3p microARNs, os dois
miR-146 B originários
microARNs são gerados a partir das cadeias opostas (a 5 ‘e 3’) braços de uma região de cadeia dupla da haste de um precursor de microARN,
pré-miR-146b, que por sua vez é derivado a partir do primário
MIR146B
transcrito de ARN [6]. A expressão de
miR-146b-5p
parece ser onipresente em tecidos humanos, embora níveis mais elevados são vistos no pulmão, timo e baço [7]. Pequenas clonagem ARN e estudos de sequenciação de profundidade mostram que a quantidade de
miR-146b-3p
em células é muito menor do que a de
miR-146b-5p
[8], [9]. Tal diferença é visto por muitos pares 5p e 3p microRNA, que constituem a maioria dos microRNAs. Esta polarização Strand acredita-se ser um resultado de efeitos termodinâmicos no processamento microARN ditadas pelas sequências microRNA [10], [11], bem como os níveis de ARNm alvo no ambiente celular [12], [13]. Mesmo que um dos 5p e 3p microARNs podem ser muito menos abundante do que o outro (e muitas vezes referida como a espécie ‘microARN *’), que pode ter uma influência significativa sobre o estado celular [14], [15]. Deve notar-se que a natureza da cadeia de polarização pode variar espaço-temporalmente. Por exemplo, o
miR-202 Twitter /
miR-202 *
relação de expressão muda de -0,5 para ~0.9 durante gonadogenesis feminina em embriões de galinha [16], e mouse
miR- 194-5p
está presente a um nível mais elevado do que
miR-194-3p no rim e no estômago, mas a um nível inferior no pulmão e útero [17].
uma série de estudos têm examinado o papel da
miR-146 B originários
microRNAs em câncer Ceil-linhas. Em um estudo com células de glioblastoma humano U373, invasão e migração foi diminuída por sobre-expressão dos microRNAs e aumentou sua knockdown usando oligonucleotídeos antisense, e os ataques de transcritos do
MMP16
gene metaloproteinases da matriz pelo
miR -146b-5p
foi identificado [18]. Na migração in vitro e invasão de outra linha celular de glioblastoma humano, U87-MG, também tem sido demonstrado que ser reduzida por
miR-146b-5p
superexpressão [19]. O microRNA foi mostrado para alvejar transcrições do
do receptor do factor de crescimento epidérmico gene que codifica EGFR
.
EGFR
-targeting pelo
miR-146b-5p
também foi mostrado no MDA-MB-231 células de câncer de mama humano [20]. Como nos estudos de glioblastoma,
pré-miR-146b
superexpressão nas células reduzida thier migração e invasão [20]. Descobertas similares foram relatados em outro estudo que também sugeriram um papel para
miR-146b-5p
na regulação negativa da via fator nuclear-kB (NF-kB) [21]. Tais estudos funcionais não foram realizados em células de câncer de pulmão. Para compreender a associação do
miR-146 B originários
microRNAs com o prognóstico do cancro do pulmão, procurou-se estudar os efeitos da superexpressão do
pré-miR-146b
precursor microRNA no fenótipo maligno do A549 pulmonar adenocarcinoma de células-line.
declaração Materiais e Métodos
Ética
Toda a pesquisa aqui apresentada foi aprovado pelo Institutional Review Board do Roswell Park Cancer Institute (RPCI). Todos os experimentos com animais foram realizados após aprovação do Animal Care Instituto de RPCI e do Comitê Use sob o protocolo número 1132M.
cultura celular
adenocarcinoma A549 humano pulmão e BEAS-2B epiteliais brônquicas linhagens de células humanas normais foram obtida a partir de ATCC (Manassas, VA). TLA-HEK293T ™, uma linha celular de rim embrionário humano derivada a partir da linha celular 293T, foi obtida a partir de Abrir Biosystems® (Huntsville, AL). As células A549 e TLA-HEK293T ™ foram cultivadas a 37 ° C em 90% de humidade e 5% de CO
2 em meio de Eagle modificado por Dulbecco (+ DMEM; Mediatech®, Manassas, VA) com soro de bovino fetal a 10% (PAA Laboratories ®, Pasching, Austria) numa incubadora de Steri-Cult ™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). LHC-9 médio (Invitrogen®, Carlsbad, CA) foi utilizado para as células BEAS-2B. Linhas celulares gerados neste estudo foram cultivadas na presença de 2 ug /ml de puromicina (Roche®, Indianapolis, IN). As células foram colhidas utilizando 0,05% de tripsina com 0,25 mM de ácido etileno-diamina-tetra-acético (Invitrogen®). As células não foram cultivadas durante mais de seis semanas, e as células cultivadas e concorrentemente-semelhante de idade foram utilizados quando comparando linhas celulares. culturas de manutenção no semi-confluência foram usadas para criar experimentos. Um contador eletrônico Scepter ™ (Millipore®, Billerica, MA) ou diapositivos hemacit�etro descartáveis (Incyto®, Dusseldorf, Alemanha) foram usados para medir células-densidades de células ressuspensas.
célula de Geração de estavelmente transduzidas -lines
complementares, oligonucleótidos de ADN de cadeia simples com o humano
sequência
pré-miR-146b (miRBase [22] Número de adesão MI0003129) e de restrição saliências enzima local foram obtidos a partir de DNA Integrada Technologies® (Coralville, IA). Oligonucleotídeos também foram obtidos para uma sequência variante em que os segmentos para a
miR-146b-5p Comprar e
-3p
microRNAs foram trocados. Após o recozimento para gerar ADN de cadeia dupla, os oligonucleótidos foram ligados a
Xho
I e
Não
I (Invitrogen®) -digested vector ™ pLemiR (Open Biosystems®). TOP10 ™ competente
E. coli
(Invitrogen®) foram termicamente transformada com os produtos de ligação. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir de culturas de clones individuais seleccionados, utilizando um kit fornecido pela Qiagen® (Valencia, CA). Identidade de plasmídeos foi confirmado por sequenciação de DNA em uma instalação do núcleo no Instituto do Câncer Roswell Park, em Buffalo, NY (RPCI). lentivírus modificadas foram preparadas por transfecção de plasmídeos em células HEK293T TLA-™, utilizando reagentes e protocolos fornecidos com o sistema de embalagem GIPZ ™ Trans-Lentivirus (Open Biosystems®). As células A549 foram transduzidas com vírus durante 48 horas e, em seguida, submetidas a selecção contra 2 ug /puromicina ml durante cerca de duas semanas para gerar linhas de células A549 /vec, A549 /146 B originários, e A549 /v146b, usando vírus gerados com um vazio pLemiR ™ vetor, ou com o vetor que carrega o singular ou a variante
pré-miR-146b
sequência, respectivamente.
a citometria de fluxo
a citometria de fluxo de células recém-colhidas coradas com 1 ug /ml de o
7
amino-actinomicina D viabilidade corante (Sigma®, St. Louis, MO) foi realizada numa máquina FACSCalibur (BD Biosciences®, San Jose, CA). Encaminhar e side-de dispersão e fluorescência nos canais FL2 e FL4 foram registrados para 10.000 eventos e valores FL2 fluorescência foram plotados após gating fora células mortas com o software CellQuest ™ Pro (versão 5; BD Biosciences®).
proliferação celular ensaio
ensaios de proliferação celular foram realizadas utilizando a contagem celular Kit-8 ensaio (CCK-8; Dojindo molecular Technologies®, Rockville, MD), que utiliza a bio-redução de
2
-(
2
-methoxy-
4
-nitrophenyl)-
3
-(
4
-nitrophenyl)-
5
-(
2
,
4
-disulfophenyl)-2H tetrazólio de sódio (WST-8) a formazano de cor laranja para medir a viabilidade das células. Resumidamente, a 100 ul de células em 2-4×10
4 /ml de células foram semeadas em placas de cultura de 96 poços. Em vários pontos de tempo ao longo dos quatro dias seguintes, o meio de cultura, em poços em quadruplicado foi substituído com meio fresco contendo 5% de reagente de CCK-8, e depois de uma hora, a absorvância a 450 nm foi medida num Multiskan Plus (MTX Lab Systems® , Vienna, VA) leitor de placas. Os valores de absorvância foram corrigidos subtraindo as dos poços de controlo que não tem células.
sensibilidade ao fármaco de ensaio
As células foram cultivadas até 50% -60% de confluência em placas de cultura de 96 poços em quintuplicado quando o meio de cultura foi substituído por aquele que contém 0,5-2,0 ug /ml de cloridrato de doxorubicina (Enzo vida Sciences®, Farmingdale, Nova Iorque) ou cisplatina (Calbiochem®, San Diego, CA) ou não. Após dois dias de cultura, a viabilidade das células foi medida como descrito para o ensaio de proliferação celular.
ensaios de formação de colónias
Para os ensaios de formação de colónias de aderentes, as células foram plaqueadas a 200 por 35 mm de prato de cultura em triplicado e cultivados com meio muda a cada 4-5 dias. Após 10-14 dias, os pratos foram coradas com 0,2% azul em 40% de metanol durante 30 minutos de metileno. Para a formação de colónias em agar mole, um prato foi revestido primeiro com 1,5 ml de meio contendo 0,7% de agar (Sigma®) antes que as células, em 2 ml de meio contendo 0,35% de agar, foram adicionados a 150 células /prato. Após a polimerização da agarose em cerca de 15 minutos, foi adicionado 2 ml de meio. As células foram cultivadas durante 6-7 semanas com mudança de meio cada 4-5 dias, e depois coradas com 2 mg /ml de brometo de tiazolilo azul de tetrazólio (Sigma®) durante 4-8 horas na incubadora de cultura de células. pratos manchados foram digitalizados em um V700 perfeição (Epson®, Long Beach, CA), e uma área mínima em imagens correspondentes a 3778 ou 199 mm
2, respectivamente, para os ensaios de colónias de agar aderentes e refrigerantes, foi utilizado para a identificação de colónias para a quantificação usando software ImageJ ™ (versão 10.2; Instituto Nacional de Saúde Mental, Bethesda, MD).
In vitro cicatrização de feridas ensaio
placas de cultura de seis poços foram marcadas com uma cruz padrão na superfície exterior das suas partes inferiores. As células foram então semeadas em triplicado em uma alta densidade para atingir 100% de confluência no dia seguinte, quando um de aproximadamente 2 cm de comprimento e 0,5 mm de largura ferida foi feita arrastando um plástico de 10 mL pipeta de ponta ao longo de uma borda em linha reta com moderada e pressão consistente a arranhar a monocamada de células. O meio de cultura foi então substituído. As células foram fotografadas imediatamente e depois de um dia de cultura na ampliação de 50x nos mesmos locais ao longo dos arranhões.
ensaios de migração e invasão Transwell ™
Vinte e quatro bem-placas Transwell ™ com um policarbonato e uma membrana 8 de poro de tamanho foram obtidos a partir de Corning (Corning, NY). As células semi-confluentes que tinham sido em jejum durante 16-20 horas de cultura em meio DMEM + isento de soro foram colhidas a partir de 10 cm pratos de cultura, lavadas duas vezes com tampão fosfato isotónico salino (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, na 10 mM
2HPO
4 e KH 1,76 mM
2 PO?
4 a pH 7,4), e re-suspenso em soro-livre + forma DMEM a 2-3 x 10 5>
formação de tumor pulmonar ensaio
Este trabalho foi aprovado por diversas comissões institucionais a RPCI. As células cultivadas a cerca de 70% de confluência foram colhidas por tripsinização durante três minutos, lavados com PBS, e re-suspenso em gelada + DMEM a 5 × 10
6 células /ml. Um técnico especializado utilizado 1 ml de uma seringa com uma agulha de 27 G para injectar 0,2 ml de células na veia da cauda de imunodeficientes, fêmea, ratos 6-10 semanas de idade de CB
Igh
–
1
b
/lcrTac-
Prkdc
scid
/estirpe Ros. Os ratinhos foram monitorizados duas vezes por semana para respiração difícil, bem como para qualquer mal-estar geral e aparência visível de uma lesão cancerosa ou crescimento, e sacrificados após 12 semanas, embora nenhum dos ratinhos tinham qualquer destes sintomas ou sinais. Os pulmões foram removidos, lavados com PBS, fixadas por um dia com 10% tamponada neutra em formol, e pesava depois enxugando o excesso de líquido com toalhas de papel.
microdissecção de captura Laser (LCM)
Este trabalho foi aprovado por um conselho de revisão institucional a RPCI, e realizada sob a supervisão de um patologista do Departamento de Patologia da RPCI sobre os tecidos a partir de 12 casos da fase I NSCLC que tinham sido tratados no instituto. fixo com formalina, embebidos em parafina, foram utilizados 6-8 um de espessura de tecido com secções de tecido de tumor, pelo menos, 70% como verificado através do exame histológico por um patologista. Tissue-secções foram colocadas em lâminas de vidro revestidas com uma membrana de polietileno naftalato (Leica®, Wetzlar, Alemanha) e secos durante a noite à temperatura ambiente. Depois de-parafinização com xileno seguida de reidratação gradual durante a noite usando álcoois graduados, as lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina, e durante a noite de ar seco. LCM foi realizada em um sistema LMD6000 (Leica®) em 200x ampliação com a potência do laser, velocidade e espécime de balanço configurações de 80, 2 e 11, respectivamente. Tumor contendo regiões sobre as secções foram identificados pela morfologia celular alterado de células epiteliais cancerígenas. Estroma e componentes epiteliais cancerosas de tais regiões foram microdissectados e coletado em distintas de 0,5 ml tubos. Para cada componente, áreas de 1-12 × 10
6 mm
2 (aproximadamente 0,5-7 × 10
4 células-seções) foram coletados. A razão de área do estroma-a-epitelial variou de cerca de 0,6 a 1.
Isolamento de ARN
colunas de sílica, reagentes e protocolos fornecidos com o PureLink ™ ARN (Invitrogen®), ou High Pure kits ™ microARN (Roche®) e FFPE ARN (Norgen Biotek®, Thorold, Canadá), respectivamente, foram usados para isolar total de 2-5 x 10 6>
Semi-quantificação de microRNAs por transcrição reversa-PCR (RT-PCR)
Semi-quantificação de microRNAs humanos
deixe-7a
,
miR-30a-5p
,
miR-146b-5p
e
miR-146b-3p
, eo pequeno RNA nucleolar
RNU6B
foi com feito à base de RT-PCR TaqMan ™ MicroRNA Ensaios (Biosystems® Aplicada, Foster City, CA; IDs de ensaio 377, 417, 1097, 2361 e 1093, respectivamente). Resumidamente, um oligonucleótido específico para o ARN, e os reagentes fornecidos com o TaqMan ™ MicroRNA Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems®) foram usadas para a transcrição reversa a 10 ng de ARN total a partir de células, ou 5 uL de 0.5-2000 FM microARNs maduros sintéticos
miR-146b-5p
e
-3p
com fosfato 5 ‘e 3’ terminii hidroxilo obtido a partir Invitrogen®. O cDNA foi utilizado como modelo em reacções de 40 ciclo-PCR em uma 7900HT-PCR em tempo real da máquina (Biosystems® Aplicada). Para cada reacção, o ciclo de quantificação (C
q), valores de, aproximadamente, inversamente proporcional ao log
2 valor da concentração do analito ARN, foi obtido com o software SDS ™ (Applied Biosystems® ; a versão 2.3). A média de C
Q
valores de reacções de PCR em triplicado foi utilizado para a análise. Quando necessário, C
q
valores para microRNAs foram normalizados, subtraindo o valor para o pequeno nucleolar
RNU6B
RNA.
Análise de expressão gênica utilizando a tecnologia BeadChip ™
o ARN total, isolado de A549 /células VEC e A549 /146 B originários em dois experimentos para a duplicação biológico, foi fornecido para a instalação de expressão genética compartilhada de RPCI para análises. espectrofotometria de absorvância e electroforese em NanoDrop ™ 1000 e Bioanalyzer ™ 2100 (Agilent Technologies®, Santa Clara, CA), respectivamente, mostraram que as preparações de ARN tinham proporções 260 nm /280 nm de absorvância na gama de 1,9-2,0, de 260 nm /230 nm razões compreendidas 1,8 e números de 7. Illumina® TotalPrep ARN amplificação kit (Ambion®, Autin, TX) foi usada para converter 500 ng de ARN em ADNc, o qual foi então transcrito in vitro para gerar ARN marcado com biotina. reagentes de hibridação foram misturados com 750 ng de ARN marcado, e a mistura foi hibridada durante a noite a 58 ° C a BeadChips HumanRef-8 v3.0 Expressão ™ matriz (Illumina®, San Diego, CA) que tem sondas para detectar transcritos humanos 24,526 anotados . Após a lavagem e coloração com Cy3 estreptavidina marcada com corante, BeadChips ™ foram fotografadas usando o leitor BeadArray (Illumina®). Os dados foram adquiridos com software GenomeStudio ™ (versão 2010.1; Illumina®), e depois processada para o fundo de correção, a transformação de estabilização de variância e, em seguida robustos estrias-normalização entre arrays usando o pacote lumi Bioconductor (versão 1.14) para a linguagem R (versão 2.11.1) com as configurações padrão. Os dados brutos e processados podem ser encontradas no gene NCBI Expressão repositório Omnibus com o número de acesso GSE29496. A boa qualidade dos dados foi confirmada por examinar diferentes aspectos de dados, tal como recomendado pelo Illumina®. Multi-teste com um teste t pareado com as estatísticas t moderados e correção Benjamini-Hochberg para a taxa de descoberta falsa foi feita sobre os dados processados usando o pacote limma Bioconductor (versão 3.4.5).
Outro Outro
uma câmera digital EOS 450D (Canon®, Lake Success, NY) e um microscópio Axio ™ Observer (Zeiss, maple Grove, MN) foram utilizados para microfotografia. Salvo disposição em contrário, os produtos químicos foram adquiridos a partir de Sigma® ou Thermo Fisher Scientific. RNA previsão de estrutura secundária utilizando MFOLD [23] com as configurações padrão foi realizada on-line em https://mfold.rna.albany.edu. As análises estatísticas e plotagem do gráfico foi feito com software Prism ™ (versão 5.0 c; GraphPad Software®, La Jolla, CA). Todos os testes t foram bicaudais, assumiu variâncias iguais, e usou 0,05 como ponto de corte para decidir importância.
Resultados
Geração de linhagens de células A549 superexpressão
miR-146b
microRNAs
para estudar o efeito de
miR-146b
superexpressão em células de câncer de pulmão, A549 humano células de adenocarcinoma de pulmão foram projetados para superexpressão o humano
pré-miR-146b
precursor microRNA. O vector lentiviral pLemiR ™, que contém um gene de resistência à puromicina, foi modificada através da inserção de ADN para a sequência de pré-microARN na região não traduzida 3 ‘do gene que codifica para a proteína fluorescente vermelha TurboRFP e impulsionada pelos citomegalovírus constitutivamente activa (CMV ) promotor. A seguir a transdução com os lentivírus, e selecção puromicina, uma população estável de células chamado A549 /146b foi gerado. O A549 /VEC célula-line foi gerado usando vector pLemiR ™ sem uma inserção. As células A549 /v146b foram gerados utilizando o vector com um ser humano variante
sequência
pré-miR-146b. Na variante, os segmentos de ácidos nucleicos correspondentes ao
miR-146b-5p Comprar e –
3p
sequências de microRNA foram trocados (figura 1A), com a ideia de que a variação pode resultar em um período relativamente maior expressão de
miR-146b-3p
, uma vez que, entre os microRNAs humanos, aqueles gerados a partir dos 5p braços de pré-microRNAs tendem a ser expressa mais do que aqueles dos 3p braços [11]. O MFOLD [23] RNA-dobrar algoritmo prevê que, como natural,
pré-miR-146b, a variante pré-microRNA também tem uma forma tronco-loop (Figura 1A), com um ΔG de -31,9 kcal /mol, que é de 5,2 kcal /mol mais que isso do natural pré-microRNA.
a
. estruturas secundárias previstas-MFOLD mais estável de
pré-miR-146b humano e uma variante de pré-microARN examinados neste estudo. As extremidades 5 ‘e 3’, posições de nucleotídeos, e segmentos correspondentes a amadurecer
miR-146b-5p Comprar e
-3p
sequências (
5p
e
3p
) são indicados.
B
. Os histogramas de fluorescência vermelha quantificada por citometria de fluxo de A549 e linhas celulares derivadas de A549 estavelmente transduzidas com lentivírus rolamento construções modificadas para a expressão de humano
pré-miR-146b (
A549 /146b
) , ou a sua variante mostrada na
a
(
A549 /v146b
), ou nenhum (
A549 /VEC
).
C
. Comparação de
miR-146b-5p Comprar e
-3p
níveis (
5p
e
3p
), normalizado à do
RNU6B
pequeno ARN nucleolar, nas linhas celulares derivadas de A549 como avaliada utilizando transcrição inversa seguida por PCR (RT-PCR). Meios e seus erros padrão para medições de três experiências diferentes são mostrados.
D
. curvas padrão que mostram a relação entre o ciclo de quantificação (
q
C) valor e concentração de RNA em
miR-146b-5p
e
-3p
(
5p
e
3p
) ensaios de RT-PCR de sintética
miR-146b-5p
e
-3p
RNA, respectivamente. Um
2 escala logarítmica é utilizada para o eixo X.
E
. Semi-quantificação das quantidades relativas de
miR-146b-5p Comprar e
-3p Online em RNA de 293T, BEAS-2B, MCF-7, e ML-2 (médias, experiências individuais ), e as três linhas de células derivadas de A549, (médias e erros padrão para as suas medidas de três experiências diferentes) são mostrados.
expressão forte e estável do gene TurboRFP pré-carrega-microARN em 90% das células de cada linha celular foi confirmada por citometria de fluxo por fluorescência (Figura 1B e dados não apresentados). Várias preparações de RNA celular foram ensaiados para
miR-146b-5p
e
-3p
microRNAs maduros por RT-PCR. Superexpressão do
miR-146 B originários
microRNAs foi observada em ambos os A549 /A549 146b e /linhagens de células v146b (Figura 1C). Em comparação com A549 /VEC,
miR-146b-5p
e
-3p
expressão, normalizado ao do 45 de base de comprimento, gene snorna limpeza
RNU6B
, foram, respectivamente, uma média de 4.9- e 6,6 vezes superior em células A549 /146 B originários. Em A549 /v146b, eram, respectivamente, uma média de 2.6- e 6,5 vezes superior, o que sugere a variante pré-microARN expresso por ele foi transformado em madura
miR-146b-5p
e
-3p
microRNAs. Para quantificar com maior precisão o efeito da variação na proporção de quantidades de
miR-146b-5p
e
-3p
nas células, sintética
miR-146b-5p
e
-3p
RNAs foram usados para gerar curvas padrão para analisar a relação entre as medições de RT-PCR (C
Q
valores) e eleva-se o ARN. Embora ensaios para ambos os microRNAs teve cinética de RT-PCR semelhantes, com cada log
2 mudança de unidade na entrada de RNA produzindo aproximadamente uma mudança unidade no C
q
valor ao longo de uma série de diluições de 12 log
2 unidades, a sensibilidade do
miR-146b-5p ensaio
foi superior em cerca de 3,6 C
q
unidades (Figura 1D). Portanto,
miR-146b-3p
C
q
valores foram ajustados pela subtração 3.6, a fim de comparar as quantidades de
miR-146b-5p
e
-3p
RNAs. Em todas as três linhas de células derivadas de A549,
miR-146b-5p
microARN estava presente em uma quantidade que foi de cerca de 4-6 vezes maior do que a do
-3p
microARN (Figura 1E). A variação na sequência pré-microRNA foi encontrado para ter qualquer efeito significativo sobre a relação entre a quantidade de
miR-146b-5p
e
-3p
nas células A549 /v146b em comparação com o As células A549 /146 B originários. Exame de ARN a partir do 293T de rim embrionário humano, BEAS-2B brônquica normal, as células MCF-7 do cancro da mama, e 2 ml de células de leucemia mielóide aguda, indicaram que nestas linhas celulares também,
miR-146b-5p
está presente em um 4-22 vezes maior excesso molar de
-3
p (Figura 1E). Assim, o microRNA maduro gerado a partir da fita 5p de
pré-miR-146b
parece ser muito mais prevalente do que a do 3p vertente, como sugerido por outros estudos [8], [9]. Expressão de miR-146b-5p em 293T, BEAS-2B, MCF-7 e células ML-2 foi 23.8-, 0,7-, 0,6 ta e 2,8 vezes de que, em A549 /VEC.
A superexpressão de
miR-146b
microRNAs tem apenas um pequeno efeito sobre o fenótipo celular A549
as linhas celulares derivadas de A549 foram examinados para identificar um efeito de
miR-146b
superexpressão sobre as células A549. as medições de viabilidade celular ao longo do tempo sugerido que, em comparação com A549-VEC, ambos A549 /A549 e 146b /v146b semelhante proliferaram em cultura celular (Figura 2A). Aumento
miR-146 B originários
níveis não parecem afectar a sensibilidade das células à cisplatina ou doxorrubicina em concentrações de fármaco variando de 0,5 a 2 ug /ml, embora as drogas eram claramente citotóxico para as células do concentração mais elevada (figura 2B). Ambos são fármacos anti-cancro que são utilizados para o tratamento de NSCLC. No entanto, com a sobre-expressão do microRNA, ambos A549 /146b e A549 /células v146b formou apenas 80% e 65%, respectivamente, de como muitas colónias como A549 /vec fez a partir de células individuais na cultura celular aderente na superfície de plástico de tecido As placas de cultura (valores p do teste T de 0,04 e 0,01, respectivamente).