Abstract

selecção Tamanho via filtração oferece uma abordagem independente do antígeno para o enriquecimento de populações de células raras no sangue de pacientes com câncer. Foi avaliado o desempenho de uma nova abordagem para a detecção de células raras multiplex em amostras de sangue a partir da mama metastático (n = 19) e pacientes com cancro do pulmão (n = 21) e controlos saudáveis ​​(n = 30) utilizando uma filtração de microfluidos automatizado e imunoensaio multiplex estratégia. células capturadas foram enumerados após coloração sequencial para identificar marcadores específicos para células tumorais circulantes (CTCs), que circulam células mesenquimais (CMC), as células estaminais putativas circulantes (CSCs), e células endoteliais circulantes (PEC). experimentos de validação pré-clínica usando células cancerosas cravado em sangue saudável demonstraram alta taxa de recuperação (média = 85%) e reprodutibilidade do ensaio. Em estudos clínicos, CTCs e CMC foram detectados em 35% e 58% dos pacientes com câncer, respectivamente, e foram praticamente inexistente controles saudáveis ​​(3%,

p

= 0,001). Os níveis médios de CTCs foram significativamente maiores no peito do que em pacientes com cancro do pulmão (

p

= 0,03). Cinquenta e três por cento (53%) dos pacientes com câncer abrigava CSCs suposto, embora nenhum foi detectável em controles saudáveis ​​(

p Art 0,0001). Em contraste, PEC foram observados em ambos os grupos de cancro e de controlo. A comparação direta de CellSearch

® vs. nosso método do filtro microfluídico revelou correlação moderada (R

2 = 0,46, kappa = 0,47). A análise do sangue de série em pacientes com câncer de mama demonstraram a viabilidade da sua monitorização em circulação populações de células raras ao longo do tempo. avaliação simultânea de CTCs, CMCs, CSCs e PEC pode fornecer novas ferramentas para estudar mecanismos de progressão da doença e resposta ao tratamento /resistência

Citation:. Magbanua MJM, Pugia M, Lee JS, Jabon M, Wang V, Gubens H, et ai. (2015) uma nova estratégia para detecção e contagem de circulação populações de células raras na metastáticos pacientes com câncer usando Automated Microfluidic filtração e Multiplex imunoensaio. PLoS ONE 10 (10): e0141166. doi: 10.1371 /journal.pone.0141166

editor: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Estados Unidos

Recebido: 15 de julho de 2015; Aceito: 04 de outubro de 2015; Publicação: 23 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Magbanua et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Siemens Healthcare Diagnostics (SHD). O financiamento adicional foi obtida a partir da Cancer Research Foundation (BCRF) da mama. BCRF teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. SHD estava envolvido no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar, e preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. JWP recebeu financiamento de pesquisa da Siemens Healthcare Diagnostics. MP, KM, JP, HS e UA são funcionários da Siemens Healthcare Diagnostics. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

recentes avanços tecnológicos permitiram a detecção confiável e caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) no sangue de pacientes com cancro [1, 2]. Para quantificar os níveis de CTC, os ensaios foram desenvolvidos para facilitar a detecção de células epiteliais no sangue por meio de marcadores celulares, tais como EPCAM e citoqueratinas [3]. Por conseguinte, a importância clínica destas células foi demonstrada em numerosos estudos que mostram que os números CTC elevadas estão associadas com a sobrevivência reduzida e fraca resposta à terapia [4-7]. No entanto, estudos recentes identificaram CTC com baixa expressão de marcadores epiteliais, por exemplo, aqueles submetidos a transição epitelial-mesenquimal (EMT), que não pode ser detectada por ensaios baseados em epiteliais [8, 9]. enriquecimento independente de antigénio, tais como sistemas de filtração, oferece uma abordagem alternativa que pode, potencialmente, eliminar o viés de seleção devido à dependência de expressão do antígeno específico [10-14]. métodos baseados em filtros de facilitar o enriquecimento de células raras não hematológicas (incluindo CTC) através da exploração das diferenças de tamanho entre estas células e as células no sangue periférico [10-14]. Enquanto leucócitos e eritrócitos medem tipicamente cerca de 6 a 8um de diâmetro, CTC podem variar em tamanho, com diâmetros de 10 jiM ou superior [15, 16]. Finalmente, as células que são capturadas no filtro podem ser submetidas a ensaio para a detecção e enumeração de CTC [17-19].

Neste estudo, avaliou-se o desempenho de uma nova abordagem para a detecção e enumeração de várias populações de células raras no sangue de pacientes com câncer de mama e de pulmão metastático utilizando uma filtração microfluídico automatizada e estratégia de imunoensaio multiplex. Diferentes populações de células circulantes foram detectados raras e enumerado, incluindo células tumorais circulantes (CTCs), células mesenquimatosas circulantes (CMC), que circulam células endoteliais (PEC), e células estaminais putativas circulantes (CSCs). contagem CTC foram comparados com os resultados do CellSearch

® sistema, um EUA Food and Drug Administration (FDA) ensaio -cleared a enumeração de CTCs. Nós também testamos a viabilidade da análise do sangue de série em um subgrupo de pacientes com câncer de mama.

Métodos

Declaração de Ética

Este estudo foi aprovado pelos Conselhos de Revisão Institucional da Universidade da Califórnia em San Francisco (UCSF; Comissão da Investigação Humana) e Siemens Healthcare Diagnostics (Elkhart, IN; Schulman Associates IRB). consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente com câncer e voluntários saudáveis ​​que participaram neste estudo. Os pacientes com câncer foram inscritos entre Janeiro e Agosto de 2014, UCSF. dadores saudáveis ​​foram recrutados na Siemens.

Paciente e Amostra de Sangue Saudável Colecção

Aproximadamente 6-9mL de sangue foi recolhido em tubos contendo ácido etilenodiaminotetracético de potássio (K

3EDTA) e 0,45 mL Transfix

® (Vacutest Kima). Amostras de UCSF foram enviados para a Siemens Healthcare Diagnostics em caixas isoladas equipados com pacotes de temperatura controlada quarto (SAF-T-Pak ™ Inc.) e um gravador digital de temperatura (Track-It ™, Monarch Instrument). As amostras de sangue foram armazenadas à temperatura de laboratório ambiente até posterior processamento.

foram preparados preparação de controlo

Os controlos positivos e negativos usando amostras de sangue de doadores saudáveis. Aproximadamente 8 ml de sangue foi tirada em tubos contendo K

3EDTA e 0,045% Transfix

®. Para os controlos positivos, 10 � de células cultivadas fixos (aos 10

5 células /mL) -quer SKBR3 (a linha do cancro da mama, American Type Culture colecção ATCC

® HTB-30

TM) ou NCI H226 ( uma linha de cancro do pulmão, ATCC

® CRL-5826

TM) -foram cravado em sangue saudável. Um controlo positivo contendo aproximadamente 1000 células e um controlo negativo (sangue não-cravada a partir de dadores saudáveis) foram incluídos em cada série.

Circulação de isolamento celular e Imunocitoqu�ica Coloração

Todas as amostras de sangue foram processadas pelo Siemens Healthcare Diagnostics. etapas de processamento que incluíam filtração, o isolamento de células, e imunocitoquímica coloração (ICC) foram realizadas utilizando um robô Hamilton Starlet ™ (Hamilton Company, Reno Nevada). O instrumento foi equipado especialmente com um dispositivo de filtração e software para controlar a automação robótica de processos a jusante. Uma membrana de filtro com área de superfície de 3,8 centímetros

2 com tamanho de poro de 8um (Whatman ™ ™ Nuclepore, GE Healthcare) foi montado sobre o dispositivo. O tamanho de poro 8um foi seleccionado com base na recuperação celular óptimo como relatado na literatura [15, 20, 21]. Os detalhes dos procedimentos de filtração e isolamento de células encontram-se descritos no ficheiro S1 e S1 fig. Resumidamente, as amostras de sangue total foram diluídos com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,083% de fibrinogénio. As amostras diluídas foram então filtradas através do dispositivo de filtro de microfluidos. Este processo enriquece para a circulação de células raras, mas também mantém cerca de 50.000-100.000 células brancas do sangue (leucócitos). As células capturadas na membrana de filtro foram fixadas, coloração e ICC automatizada foi realizada para identificar populações de células específicas. Optimização dos parâmetros de ensaio é discutida no ficheiro S2.

S1 tabela lista os anticorpos e sondas fluorescentes utilizadas neste estudo. Os pormenores do processo são descritos em ICC Ficheiro S1. Resumidamente, as células foram permeabilizadas, e uma solução de bloqueio foi adicionado para evitar ligação não específica de anticorpos. As células foram incubadas numa solução de anticorpo apropriada para a coloração de antigenes-alvo. Um fluxograma ilustrando o processo de coloração é mostrado na Fig S1 Optimização dos parâmetros de ensaio é discutida no ficheiro S2

As seguintes linhas de células foram utilizadas como controlos para determinação de limiares para sinais de positividade:. (1) SKBR3, uma linha de células de cancro da mama que é CK +, VIM, CD144-, TPBG /5T4-, PIWIL2-, CD144-; (2) NCI-H2228, uma linha de células de câncer de pulmão que é CK +, VIM +, CD144-, TPBG /5T4 +, PIWIL2-, CD144-; (3) NCI-H266, uma linha de câncer de pulmão que é CK +, VIM +, TPBG /5T4-, PIWIL2-, CD144-; (4) MDA-MB-231, uma linha celular de cancro da mama que se CK +, VIM, TPBG /5T4-, PIWIL2-, CD144-; e (5) um transfectadas MDA-MB-231 expressando PIWIL2 e, portanto, é CK +, VIM, TPBG /5T4-, PIWIL2 +, CD144 (oferta do Dr. Jian-Xin Gao, Xangai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, China ). leucócitos normais e células endoteliais foram usados ​​como controles positivos para CD45 e coloração CD144, respectivamente, e como controles negativos para todos os outros marcadores.

microscópica Análise e contagem de células circulantes raros

Detecção e tratamento de imagens das células foram realizadas utilizando um microscópio de fluorescência (Leica DM5000, Leica Microsystems GmbH) (Arquivo S1). Diferentes tipos de células foram enumeradas com base em padrões de coloração observada.

O limiar de detecção inicial foi definida como o ponto em que o sinal de fluorescência foi detectável para ser maior do que a fluorescência não específica a partir da membrana de filtração. Analytical pontos de corte foram ainda definida com base nos níveis de fluorescência de células cancerosas conhecidas (SKBR-3 ou H226) e de glóbulos brancos a partir de controlos saudáveis ​​utilizados como controlos para sinais positivos e negativos, respectivamente. Para consistência, apenas um investigador (KM) contadas as células, enquanto outro investigador (MP) confirmou as contagens de células.

Análise Estatística

Foram analisados ​​os resultados de enumeração (células /mL) utilizando t- testes. O teste exato de Fisher foi utilizado para comparar a taxa de detecção entre os grupos. A

p

-valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Assay Design by

Nós avaliamos uma nova estratégia para a enumeração de células raras multiplex usando. um instrumento automatizado baseado em filtração (Siemens Healthcare Diagnostics) e coloração com vários cocktails de imunofluorescência. O dispositivo consiste de uma membrana de filtro montada num suporte micromáquina que permite o isolamento de células raras, seguido por autostaining e detecção microscópica. Este dispositivo captura de células e caracterização integrada descartável gravado com estruturas microfluídicos permite a filtração controlada através de uma faixa de pressão de 10-30 mbar (Fig 1A). projeto detalhado do dispositivo microfluídico é mostrado na S3 Fig.

A. Desenho do dispositivo de filtro microfluídico ea visão esquemática das etapas de processamento para captura e detecção de células circulantes raras, B. Biomarkers e imuno-fenótipos de células circulantes raras identificadas através do processo de coloração seqüencial, por cento de recuperação C. média após spiking números conhecidos de H226 células de câncer de pulmão para o sangue saudável, lote D. Scatter mostrando o número de H226 células e o número de células recuperadas cravado.

o cocktail coloração CTC incluído 4 ‘, 6-diamidino-2- fenilindole (DAPI), um anticorpo pan-citoqueratina (pan-CK), e anticorpos para CK8 /18, CK19, e CD45 (Tabela S1). DAPI fluorescência foi detectada no canal de azul e foi usada para identificar células nucleadas. Fluorescente Pan-CK, CK8 /18, e anticorpos CK19 foram usadas para células de etiquetas de origem epitelial e foram detectadas no canal de vermelho, enquanto que os anticorpos fluorescentes para CD45 foram usadas para células de etiquetas de origem hematopoiética e foram detectadas no canal de medida-vermelho . CTCs foram definidos como nucleada, CK-positivo, e CD45-negativo, enquanto glóbulos brancos foram definidos como nucleada mas foram CK-negativo e CD45-positivo (Fig 1B).

A /cocktail coloração CEC CMC incluídos anticorpos para vimentina (VIM) e CD144. O marcador VIM foi usada para identificar células que sofrem EMT. As células marcadas com anticorpos fluorescentes para VIM foram detectadas no canal vermelho. Os anticorpos contra CD144 foram usadas para identificar as células de origem endotelial. As células marcadas foram detectadas no canal verde. Além disso, o padrão de coloração característico para CD144 demonstrando localização na membrana da célula facilitou a identificação do PEC. Os resultados deste processo de coloração foram combinadas com as da mancha inicial, como o DAPI e os sinais de CD45 eram ainda visíveis. CMC foram definidos como nucleada, VIM-positiva, CK-negativa, CD144-negativas e CD45-negativo. PEC foram definidos como nucleada, CD144-positive, VIM-positivo, CK-negativo e CD45-negativas.

O processo de coloração CSC utilizou um método de imunoensaio de alta sensibilidade usando Tyramide Signal Amplification (TSA ™, Life Technologies) para detectar a expressão de marcadores de células estaminais candidato, e PIWIL2 TPBG /5T4, que são expressas em níveis baixos. sinais amplificados foram detectadas no canal verde e foram usadas para identificar os CSCs putativos definidos como nucleada, célula estaminal marcador positivo, CK-positivo /negativo, VIM-positivo /negativo, CD144-negativas e CD45-negativo. expressão TPBG /5T4 foi utilizado para identificar supostos CSCs cancro do pulmão, enquanto expressão PIWIL2 foi usado para detectar câncer de mama CSCs putativos.

O processo de filtração altamente controlado e multi-passo os parâmetros de coloração foram otimizados para minimizar a detecção de falsos positivos no sangue de doadores saudáveis. O uso de um tubo de coleta de sangue proprietária contendo uma formulação fixador otimizado (Transfix

®), juntamente com as condições de transporte e armazenamento controladas contribuíram para a alta taxa de resultados reportáveis ​​(98%).

Desempenho Analítico

primeiro, avaliamos o desempenho do dispositivo de filtro microfluídico usando um modelo de pico-in envolvendo células cancerosas H226 pulmonares. Uma gama de 5-160 células foi misturado em sangue de dadores saudáveis ​​e isolado utilizando o dispositivo. coloração ICC e análises microscópicas foram realizados para detectar e enumerar as células CD45-negativas nucleada, CK-positivo, e. Uniformidade de contagens de células observadas entre as amostras em triplicado indicam alta reprodutibilidade (Fig 1C). Além disso, observou-se uma alta correlação entre o rendimento observado e esperado (R

2 = 0,99). Isolamento de células fortificado foi muito eficiente, com uma taxa de recuperação de 85% (Figura 1D). Com 5 células cravado, observou-se menor recuperação de 40%, e foi atribuído à adesão tubo e perda de células. Estes resultados são inteiramente comparáveis ​​com os de CellSearch [22, 23]. Por exemplo, a enumeração CellSearch de amostras enriquecidas foi de 80% e 82% [22]. Allard e colaboradores [23] relataram a recuperação com um aumento de 4 células mostrou desvio padrão de 2 e 95% de intervalo de confiança de 1-11, que são estatisticamente indistinguível de nossos resultados com pico 5 celular.

Teste Clínico

validação clínica do dispositivo de filtro de microfluidos foi realizada em amostras de sangue total de doentes da mama e cancro do pulmão metastático. Para determinar os níveis de fundo em indivíduos saudáveis, amostras de sangue de 30 controles também foram avaliados. As amostras foram processadas através do dispositivo de filtro de microfluidos, e células capturadas na membrana foram coradas para marcadores para identificar células circulantes de interesse. Imagens representativas de diferentes tipos celulares são ilustradas na Figura 2.

Imagens representativas de células tumorais (CTC), as células brancas do sangue (WBC) circulantes, células mesenquimais em circulação (CMC), as células endoteliais (CEC), e circula putativos células circulantes-tronco (CSC) em mama metastático (B) e pacientes com câncer de pulmão (L). A barra de escala representa 8um.

As características dos pacientes são apresentados na Tabela 1. Dos 43 pacientes inscritos, 40 foram avaliáveis ​​(S2 Fig). A coorte final foi composta por 19 pacientes com câncer de mama e 21 pacientes com câncer de pulmão. Dos pacientes de cancro 19 da mama, 95% eram ER-positivo e 26% eram de HER2-positivos, enquanto 81% e 19% dos pacientes com cancro do pulmão foram diagnosticados com carcinoma de células não-pequenas do pulmão (NSCLC) e carcinoma do pulmão de pequenas células ( SCLC), respectivamente. Clinicamente mutações motorista relevantes, por exemplo, em

EGFR

,

KRAS

, e

ELM4-ALK

fusão, estavam presentes em 40% dos pacientes com câncer de pulmão.

Abreviaturas: receptor ER-estrogénio, NSCLC- não-pequenas células de pulmão, câncer de pulmão de pequenas células SCLC-

detecção e contagem de tipos raros de circulação celular

Nós. padrões de coloração analisados ​​em células capturadas usando microscopia de fluorescência para enumerar CTCs, CMCs, PEC e CSCs putativos no sangue de pacientes com câncer e controles saudáveis. Enumeração resultados estão resumidos na Tabela 2.

abreviaturas: células tumorais circulantes (CTC), que circulam células mesenquimais (CMC), células endoteliais circulantes (CEC) e células estaminais putativas circulantes (CSC)

CTCs foram detectados em 35% dos pacientes com câncer, incluindo 47% dos pacientes com câncer de mama e 24% dos pacientes com câncer de pulmão (Fig 3A). CTC foram largamente ausente dos controlos, com excepção de uma única célula detectado em um dador saudável (3%). detecção de CTC em pacientes com câncer foi significativamente maior do que nos controles saudáveis ​​(

p Art 0,001). O nível CTC média em pacientes com câncer de mama (0,41 CTC /mL) foi significativamente maior do que em pacientes com câncer de pulmão (0,04 CTC /mL,

p

= 0,03) (Tabela 2, Figura 4A).

Percentagem de amostras de células com raras detectáveis: células tumorais A. circulantes (CTC), B. células circulantes mesenquimais (CMC), e C. CTC CMC, B. células circulantes mesenquimais (CMC), D. putativo de células estaminais em circulação ( CSC), e E. células endoteliais circulantes (CEC) na mama metastático e os doentes com cancro do pulmão e controles saudáveis. F. Percentagem de pacientes com grupos de células detectáveis. detecção por cento entre os grupos foi comparada por meio de testes exato de Fisher e foi considerada significativa (*) quando

p

-valor era 0,05., de outra forma, não significativas (ns)

A média células por ml de células tumorais circulantes (CTC A.), B. células circulantes mesenquimais (CMC), C. CTC e CMC, D. putativo células-tronco circulantes (CSC), e E. circulam células endoteliais (CEC) em mama metastático e pacientes com câncer de pulmão e os controles saudáveis. Um teste t única amostra foi utilizado para comparar média células por ml a média da população de 0. Um asterisco (*) indica um

p

-valor 0,05, F. Comparação dos resultados de enumeração entre CellSearch

® e o ensaio do filtro de microfluidos, Acordo G. nas chamadas positivas e negativas entre CellSearch

® e no ensaio de filtro microfluídico em 16 amostras de sangue. As amostras com ≥5 células tumorais circulantes (CTC) por 7,5 mL de sangue foram consideradas positivas usando o CellSearch

® ensaio enquanto que as amostras com o CTC detectável ( 0). Foram considerados positivos usando o ensaio baseado em filtro de microfluidos

CMC foram detectados em 58% dos pacientes com câncer, incluindo 58% no câncer de mama e 57% no câncer de pulmão (Fig 3B). detecção CMC foi significativamente maior em pacientes com câncer do que nos controles saudáveis, nos quais não foram detectadas CMC (

p Art 0,001). Os níveis médios de CMC foram 0,34 CMC /mL em pacientes com câncer de mama e de 2,37 CMC /mL em pacientes com câncer de pulmão, que não houve diferença significativa (

p

= 0,23) (Tabela 2, Figura 4B).

Quando a detecção de ambos epitelial (CTCs) e mesenquimais tipos de células (CMC) foi combinado, frequência CTC + CMC em pacientes com câncer foi de 70%, incluindo 79% dos de mama e 62% dos pacientes com câncer de pulmão, respectivamente (Fig 3C ). Isto foi significativamente maior do que a taxa de detecção de 3% em controlos saudáveis ​​(

P

= 0,001). Os níveis médios de CTC + CMC em doentes com cancro da mama (0.75 células /ml) não foram significativamente diferentes do que dos doentes com cancro do pulmão (2.41 células /mL,

P

= 0,32) (Tabela 2, Figura 4C).

putativo CSCs foram detectados em 54% dos pacientes com câncer, incluindo 58% dos pacientes com câncer de mama e 50% dos pacientes com câncer de pulmão (Fig 3D). detecção CSC em pacientes com câncer foi significativamente maior (

p Art 0,001) do que nos controles saudáveis, que não apresentem quaisquer CSCs detectáveis ​​(Fig 4D)

Em contraste marcante com CTCs, CMCs. e CSCs, PEC estavam presentes em 43% dos controles saudáveis. PEC foram detectados em 55% dos doentes com cancro em geral, incluindo 53% do cancro da mama e 57% dos pacientes com cancro do pulmão (Figura 3E). frequência de detecção CEC não foi significativamente diferente entre pacientes e controles de câncer. No geral, o PEC foram os mais abundantes da população de células estudado em doentes com cancro (média de 3,61 CEC /ml). Além disso, esse nível médio de CEC em pacientes com câncer foi significativamente maior do que nos controles saudáveis ​​(/ml,

p

= 0,007 0,47 CEC), Tabela 2, Fig 4E).

Os tamanhos de células médios para CMC, CEC, e CSCs foram todos cerca de 10 uM de diâmetro (gama de 5 a 15 uM). Fizemos observar células recuperadas que foram menores do que o tamanho de poro. Atribuímos a capacidade de armadilha células menores para o efeito de reticulação da fixação paraformaldeído. Além disso, observou-se que a recuperação de filtração foi a mesma para todos os tipos de células de tamanhos semelhantes. Outros sistemas de filtração relataram a mesma recuperação de células de cultura do mesmo tamanho, e recuperação reduzido para células com tamanhos menores [11, 13, 24, 25].

Outros estudos têm relatado a presença de CK-positiva e as células CD45 positivas no sangue de pacientes com câncer [26, 27]; No entanto, estas células não foram detectadas nas nossas amostras. Fizemos detectar agrupamentos ocasionais de células em diferentes populações de células, particularmente para PEC (Fig 3F). Putativo CSCs, no entanto, foram detectadas apenas como células individuais. Não foi observada diferença significativa na prevalência de grupos de células entre os pacientes do pulmão e cancro da mama.

Comparação com o CellSearch

® Assay

Em 16 amostras de sangue duplicadas, CTCs foram testados usando tanto o ensaio baseado em filtro de microfluidos e

® sistema CellSearch. A comparação direta de detecção de CTC revelou concordância moderada entre os dois ensaios (Fig 4F, R

2 = 0,46; Fig 4G, kappa = 0,47).

Sangue Serial Analysis

Em 3 de mama pacientes com câncer, amostras seriadas de sangue foram analisadas para avaliar a possibilidade de controlar as populações de células que circulam ao longo do tempo.

paciente um era uma mulher de 49 anos diagnosticado com, câncer de mama metastático HER2-negativo ER-positivo. Amostras de sangue foram coletadas nos dias 0, 28, e 84 de um ensaio clínico (Fig 5A). análise baseada em filtro de microfluidos revelou um aumento acentuado em todas as populações de células raras (CTCs, CMC, CSCs e PEC) entre pontos de tempo 2 e 3. Em contraste, o teste paralelo, através do CellSearch

® sistema não detectou quaisquer CTCs. Os testes clínicos para o marcador de tumor no soro CA 15-3 em correspondentes pontos de tempo revelou um aumento semelhante entre pontos de tempo 2 e 3 (CA 15-3 níveis: 84, 88, 124 U /mL). avaliação clínica subsequente confirmaram que a paciente apresentou progressão da doença.

circulantes células tumorais (CTC), que circulam células mesenquimais (CMC), que circulam células endoteliais (CEC), e as células-tronco que circulam putativos (CSC) foram enumeradas no sangue As amostras recolhidas em diferentes pontos de tempo (TP) durante o tratamento. O eixo dos Y à esquerda representa a escala para CTC, CMC, e CSC por mL de sangue, enquanto o eixo dos y da direita representa a escala para CEC por mL de sangue. A resposta clínica foi avaliado utilizando os critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos critérios de medição (RECIST).

Paciente B era uma mulher de 54 anos diagnosticado com, câncer de mama metastático HER2-negativo ER-positivo. Amostras de sangue foram coletadas nos dias 0 e 14. A análise baseado em filtro Microfluidic não mostraram CTCs detectáveis ​​em um ou outro ponto de tempo. CellSearch

® foi realizada sobre uma amostra independente cerca de três semanas antes do ensaio baseado em filtro de microfluidos inicial (dia -21), bem como sobre uma amostra paralela no ponto de tempo 2; estes mostraram semelhante há CTC detectáveis. No entanto, os níveis de CSCs foram baixos e manteve-se inalterada. CMCs e PEC também foram detectados e os níveis apareceu a declinar ao longo do tempo (Fig 5B). Soro CA 15-3 níveis avaliadas 26 dias antes e 2 dias após o teste inicial baseado em filtro microfluídico mostrou uma ligeira diminuição (50 e 47 U /mL). A avaliação clínica indicou que o paciente teve uma resposta parcial ao tratamento do câncer.

Paciente C era uma mulher de 68 anos de idade diagnosticado com, câncer de mama metastático HER2-negativo ER-positivo. Amostras de sangue foram coletadas nos dias 0 e 30. A análise baseado em filtro Microfluidic apresentaram níveis aumentados de todos os que circulam populações de células raras no dia 30 (Fig 5C). CellSearch

® ensaio de amostras de sangue coletadas em momentos idênticos também exibiu um aumento nos níveis do CTC (7 e 17 CTCs por 7.5mLs de sangue). A avaliação clínica revelou a progressão da doença.

Discussão

Foi desenvolvido um ensaio de romance para o enriquecimento, a detecção e enumeração de circulação de populações de células raras em pacientes com câncer. O protocolo consiste em duas etapas principais: enriquecimento por filtração, utilizando um dispositivo de microfluidos e imunocoloração multiplex sequencial para identificar tipos de células raras. Após extensos testes pré-clínicos, foi avaliado o desempenho clínico de nosso ensaio na detecção e enumeração de CTCs, CMCs, CSCs e PEC no sangue de mama metastático e pacientes com câncer de pulmão.

Um número de abordagens microfluídicos para isolamento de CTC foram relatados [28-32]. Por exemplo, o CTC-iChip, um sistema de separação de microfluidos automatizado foi usado para isolar e analisar CTC [28, 32] com sucesso. Para o nosso conhecimento, nenhuma das plataformas existentes têm sido utilizados para a detecção multiplex de circulação de células raras.

CTCs foram detectados com frequência em pacientes da mama e cancro do pulmão, mas foram em grande parte ausente em controles saudáveis. O nível médio de CTCs foi significativamente maior em mama, em comparação aos pacientes com câncer de pulmão, consistente com observações anteriores usando o CellSearch

® ensaio [10]. comparação head-to-head do nosso método do filtro microfluídico contra o CellSearch aprovado pela FDA

® sistema revelou concordância moderada.

Temos relatado anteriormente a viabilidade de enumeração e isolamento de CTCs de células activadas por fluorescência (FACS), após enriquecimento imunomagn�ica [33-35]. No entanto, tanto o enriquecimento imunomagnética coloração de FACS e foram com base na expressão EPCAM. O método baseado na filtração utilizado no presente estudo elimina a dependência de marcadores de superfície para a identificação dos CTC. Assim, para além CTC com a expressão do marcador epitelial, o nosso ensaio também detectadas células com expressão raros mesenquimais marcador circulante. Na verdade, CMCs foram detectados em 58% dos pacientes com câncer, e nenhum foram detectados em controles saudáveis. detecção combinada de epitelial (CTCs) e mesenquimais tipos de células raras (CMC) (ou seja, o CTC + CMC) foi de 79% e 62% em pacientes de mama e câncer de pulmão, respectivamente, o que representa um potencial aumento da sensibilidade ao longo do CTC ou CMC sozinho.

A hipótese de células-tronco do câncer postula que uma rara subpopulação de células tumorais capazes de auto-renovação e multipotency são responsáveis ​​pela iniciação do tumor e crescimento [36, 37]. Diversos marcadores, incluindo CD44, CD24, e ALDH1, têm sido usados ​​para detectar e enriquecer para CSCs putativos de tumores sólidos [38-40]. Neste estudo, foram utilizados dois marcadores de células-tronco candidato novela, Piwil2 [41, 42] e TPGB /5T4 [43, 44], para detectar CSCs putativos em pacientes com câncer. PIWIL2 é um membro do testículo Fracote induzida pelo elemento P /Argonaute família (piwi /AGO) e desempenha um papel importante no desenvolvimento de células germinativas [45]. Estudos têm demonstrado recentemente que PIWIL2 é expresso em células estaminais pré-cancerosas e cancerosas [41, 42, 46, 47]. Além disso, este gene é expresso em diferentes fases do cancro da mama, mas não em tecido mamário normal [48]. O outro marcador de células estaminais putativas, glicoproteína trofoblasto (TPBG /5T4), é uma proteína que é expressa oncofetal em trofoblastos fetais, a camada mais externa de células num embrião de mamífero [49]. Estudos recentes têm mostrado que TPBG /5T4 é expresso em células de iniciação do tumor no cancro do pulmão [43, 44], e elevada expressão em diversos tipos de cancro tem sido associada com o resultado clínico inferior [43, 50-52]. Neste estudo, os CSCs putativos foram detectados na maioria dos pacientes de cancro da mama e do pulmão, mas foram completamente ausente nos controlos saudáveis.

células endoteliais em circulação pode surgir a partir de processos relacionados com a angiogénese de tumores em pacientes com cancro, assim a partir de lesão da vasculatura normal, [53-55]. Alterações nos níveis de CEC foram observadas num certo número de configurações de doença, incluindo o cancro, infecções, e doenças cardiovasculares [56-60]. PEC, no entanto, são frequentemente observadas em indivíduos sem a doença, bem [54, 55]. No nosso estudo, PEC foi a mais abundante das populações de células estudadas em ambos os pacientes com cancro e em indivíduos saudáveis; No entanto, pacientes com câncer que parecem mostrar níveis um pouco mais altos. Este resultado é consistente com os resultados de um estudo anterior que mostram que a maioria das células raras circulam capturadas pela selecção do tamanho eram células endoteliais [19].

Para demonstrar a viabilidade de análise de série, células circulantes raros na mama selecionadas pacientes com cancro foram ensaiadas a pontos de tempo diferentes durante o curso do tratamento. Comparação do número de células circulantes raros com os níveis de marcadores clínicos estabelecidos, tais como CA 15-3 e ensaio CTC por CellSearch

®, mostraram tendências similares. Além disso, observações preliminares neste pequeno número de pacientes mostrou que os níveis circulantes de células raras podem ser correlacionados com o resultado de resposta.

Embora nossa abordagem imunocoloração sequencial acaba por produzir populações de células de alta pureza, a recuperação das células pode ainda ser melhorada através da avaliação diferentes parâmetros de filtro e de filtração [13, 15]. Além disso, testes em paralelo com diferentes técnicas de isolamento, incluindo citometria de fluxo, pode ser realizada para comparar a eficiência de captura.

A nossa abordagem tem limitações semelhantes como com outros métodos baseados em tamanho.