Abstract

dor do câncer de osso é o mais grave entre a dor do câncer e é frequentemente resistentes aos analgésicos atuais. Assim, o desenvolvimento de novos analgésicos eficazes no tratamento da dor associada ao cancro do osso são desejados. antagonistas do receptor de fator ativador de plaquetas (PAF) foram recentemente demonstrou ter efeitos alívio da dor eficaz sobre a dor neuropática em vários modelos animais. O presente estudo examinou o efeito aliviar a dor de antagonistas do receptor de PAF na dor do câncer de osso usando o câncer de osso do fémur modelo (FBC) em camundongos. Os animais foram injectados com células NCTC2472 osteolíticas na tíbia, e, subsequentemente, foram avaliados os efeitos dos antagonistas do receptor de PAF em comportamentos de dor. Química estruturalmente diferentes tipos de antagonistas, TCV-309, BN 50739 e WEB 2086 melhorou a alodinia e melhores comportamentos de dor, tais como guarda de comportamento ea integridade física de uso anomalias em ratos modelo FBC. A dor efeitos destes antagonistas aliviar foram atingidos com doses baixas e foi de longa duração. O bloqueio dos receptores de PAF espinal por injecção intratecal de TCV-309 e WEB 2086 ou knockdown da expressão da proteína do receptor de PAF espinal por transferência intratecal de PAF receptor de siRNA também produzido um efeito de alívio de dor. A quantidade de uma enzima inducible síntese PAF, aciltransferase lisofosfatidilcolina 2 (LPCAT2) proteína aumentou significativamente na medula espinhal após o transplante de NCTC 2472 células tumorais em tíbia de rato. A combinação de morfina com antagonistas dos receptores de PAF desenvolve aumento acentuado do efeito analgésico contra a dor câncer ósseo sem afetar constipação induzida por morfina. A administração repetida de TCV-309 suprimiu o aparecimento de comportamentos de dor e sobrevivência prolongada de ratos FBC. Os resultados sugerem que os antagonistas do receptor de PAF em combinação com, ou sem, os opióides podem representar uma nova estratégia para o tratamento da dor do câncer ósseo persistente e melhorar a qualidade de vida dos pacientes

Citation:. Morita K, Shiraishi S, Motoyama N, Kitayama T, T Kanematsu, Uezono Y, et al. (2014) Palliation de câncer ósseo A dor por antagonistas de Plaquetas Fator de Ativação de Receptores. PLoS ONE 9 (3): e91746. doi: 10.1371 /journal.pone.0091746

editor: Theodore John Price, da Universidade do Arizona, Estados Unidos da América

Recebido: 16 Outubro, 2013; Aceito: 14 de fevereiro de 2014; Publicação: 17 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Morita et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas-in Aid para a Investigação Científica (B) 22390349, (C) 21592421 e (C) 24.592.798 da Sociedade japonesa para a Promoção da Ciência e do Fundo de Pesquisa e Desenvolvimento Cancer Center Nacional (23-a-30 ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a dor no câncer é produzido por pressão sobre, ou a estimulação química de, terminações nervosas de sinalização da dor especializados chamados nociceptores (dor nociceptiva) ou pode ser causada por danos ou doença próprios (dor neuropática) fibras nervosas afetando que é responsivo a estímulos que são normalmente não doloroso; alodinia. dor do câncer de osso é uma das condições mais comuns e, geralmente graves de dor em pacientes com câncer [1].

Os opiáceos continuam a ser o esteio do tratamento da dor do câncer, mas, para além dos efeitos secundários graves as consequências a longo prazo de tolerância, dependência, hiperalgesia e da supressão do eixo hipotálamo /hipófise deve ser reconhecido. Porque os atuais tratamentos disponíveis são relativamente ineficazes contra a dor do câncer ósseo, quase metade dos pacientes com câncer têm controle inadequado da dor [2], [3]. Assim, o desenvolvimento de novos analgésicos eficazes no tratamento da dor associada ao cancro do osso são necessários.

Temos anteriormente sugerido que a-fator ativador de plaquetas (PAF) pode ser um mediador de dor neuropática. PAF injecção na medula espinal do rato causada hiperalgesia térmica e alodinia táctil, que foram, pelo menos, em parte, mediada pela disfunção da espinal α3 receptor de glicina (GlyRα3) e foram bloqueados pelos antagonistas do receptor de PAF [4], [5]. Estudos subseqüentes mostraram PAF receptores bloqueio reduzida comportamentos de dor induzidos em modelos de lesão do nervo. Um antagonista do receptor de PAF, CV-3988, injectado próximo do gânglio da raiz dorsal (DRG) em ratos ou ratinhos sem receptores de PAF mostrou uma redução na alodinia táctil após lesão do nervo espinhal [6]. injecção intratecal do antagonista de receptor de PAF, WEB 2086, um derivado de benzodiazepina de 9 dias pós-cirurgia em ratos suprimiu o desenvolvimento de alodinia mecânica em um modelo de lesão de nervo de rato poupado [7]. antagonistas do receptor de PAF, TCV-309 (PAF relacionada), BN 50739 (composto relacionado produto natural) e WEB 2086, produziu efeitos anti-alodinia profundos e duradouros em vários modelos de dor neuropática diferentes em camundongos, incluindo uma lesão ligação parcial do nervo ciático modelo, um modelo de ligação do nervo infra-orbital parcial, uma constrição crónica do modelo nervo infraorbital lesão (modelo CCI) e um estreptozotocina (STZ) induzida pelo modelo de diabetes [8]. A evidência sugere que o PAF contribui para danos nos tecidos neurais e comportamento de dor após a lesão do nervo.

Os modelos animais acima dor investigados devido ao câncer de osso, no qual as células tumorais são injetados localmente dentro do osso. O presente estudo utilizou o modelo fêmur câncer ósseo (FBC) em ratinhos [9]. Os animais foram injectados com células osteolíticas NCTC2472 e, posteriormente, foram avaliados os efeitos de antagonistas do receptor de PAF sobre comportamentos de dor.

Materiais e Métodos

Animais Experimentais

Os experimentos foram realizados utilizando do sexo masculino camundongos C3H /ave (CLEA Japan, Inc., Tóquio), pesando 20-25 g. Todos os procedimentos experimentais e manejo dos animais foram realizados de acordo com ambos os Princípios Orientadores para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório aprovados pelo japonês Farmacológica A sociedade e as diretrizes da Universidade de Hiroshima, Hiroshima, Japão e as orientações do Instituto de Pesquisa do National Cancer Center, Tokyo, Japão. O protocolo foi aprovado pelo comitê de Ética de Experimentação Animal da Universidade de Hiroshima (número de autorização: A-09-17 e A-11-16), e do Centro Nacional de Câncer (número de autorização: T11-004-M02) . Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Os animais foram utilizados em apenas uma medição em cada experimento

O Femur Câncer (FBC) modelo do rato Osso

Para o modelo FBC, NCTC 2472 células tumorais (American Collection Tipo Cuiture, ATCC.; Manassas, VA, EUA) foram injectados na cavidade medular do fémur distai de ratinhos C3H /HeN [9]. As células NCTC 2472 foram mantidas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco, suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina (todos os produtos a partir de Gibco Laboratories); e cultivou-se a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 então subcultivadas semanalmente acordo com as directrizes da ATCC. Para administração, as células foram separadas por raspagem e, em seguida, centrifugadas a 900 rpm durante 3 min. O sedimento foi suspenso em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) e, em seguida, utilizada para injecção intratibial.

Para a implantação, as células tumorais foram injectadas seguindo o protocolo descrito anteriormente por Honoré et ai. [9] com ligeira modificação. Em resumo, anestesiaram-se ratinhos C3H /HeN com uma injecção i.p. de pentobarbital de sódio (60 mg /kg) injectado. Para a inoculação de células intratibial, o joelho direito de cada rato foi dobrado e colocado de frente para o experimentador e uma incisão mínima de pele foi feita expondo o planalto tibial. Um alargador dentário de calibre 25 foi usada para perfurar o planalto tibial e, uma vez removidas, uma agulha de calibre 30 acoplada a uma seringa Hamilton cheio com a suspensão de células foi cuidadosamente introduzido na cavidade medular da tíbia. Em seguida, 10

5 NCTC 2472 células suspensas em 5 mL de HBSS foram lentamente injetada (células vivas). grupos de controlo foram injectados com 5 mL de HBSS ou HBSS contendo 10 2472 células

5 NCTC mortos por rapidamente congelamento e descongelamento-los duas vezes sem crioproteção e depois lavagem com HBSS fresco (células amortecer). Finalmente, Caviton EX, um vedante temporária hidráulico de grau dentária (Dental Products GC, Co. Ltd., Tóquio, Japão) foi aplicada para o planalto tibial área de incisão e o procedimento cirúrgico foi completada com costura da pele do joelho. Os pesos corporais foram registados para cada rato a cada 3 dias durante todo o estudo. Os animais foram sacrificados após perda de peso superior a 20% do peso corporal ou em cima de demonstrar sintomas relacionados, tais como movimentos atáxicas graves ou outras anormalidades neurológicas devido a preocupações éticas.

Drug Administration

A gabapentina (1 – (aminometil) ácido -cyclohexaneacetic) foi obtido a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). A morfina foi obtida a partir de Takeda Pharmaceutical Co., (Osaka, Japão). WEB 2086 (3- [4- (2-clorofenil) -9-metil-6

H

tieno [3,2-

f

] [1], [2], [ ,,,0],4] triazolo [4,3-

um

] [1], [4] diazepin-2-il] -1- (4-morfolinil) -1-propanona) foi obtido a partir de Tocris Bioscience ( ellisville, MO). TCV-309 (3-bromo-5 – [

N

-fenil-

N

– [2 – [[2- (1,2,3,4-tetra-hidro-2-isoquinolilo – carboniloxi) etil] carbamoil] etil] carbamoil] -1-propilpiridínio nitrato), e BN 50739 (tetra-hidro-4,7,8,10methyl- (cloro-2phenyl) 6 [feniltio-3,4-dimetoxi] methylthiocarbonyl-9 pirido [4 ‘, 3’-4,5] tieno [3,2

f

] triazolo-1,2,4 [4,3-

um

] diazepina-1, 4) foram doados a partir de Takeda Pharmaceutical Co., e do Instituto Henri Beaufour, respectivamente.

TCV-309 e WEB 2086 foram cada um dissolvidos em fluido estéril artificial cerebrospinal (ACSF) ou solução salina. BN 50739 foi dissolvido num solvente contendo 25% de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (Sigma /RBI, Natick, MA) e água destilada, pH ajustado para ~ 6 usando NaOH 1 N, e dilui-se apropriadamente com ACSF ou solução salina. Outros reagentes foram dissolvidos em solução salina ou ACSF. As soluções de fármaco foram preparadas de fresco em cada dia da experiência. composição ACSF (em mM) foi NaCl 142, KCl 5, CaCl

2 2H

2O 2, MgCl

2 · 6H

2O 2, NaH

2 PO?

4 1,25, D -glucose 10, HEPES 10, pH 7,4. TCV-309, BN70329, ou WEB 2086 foi administrado por via intravenosa 30 min-3 hr antes da avaliação da dor.

Knockdown de PAF Receptor na medula espinhal

Knockdown do receptor PAF foi realizada de acordo com um relatório anterior [5]. siRNAs foram incorporados o vírus hemaglutinante do Japão (HVJ) -Envelope Vector de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, após a mistura de 40 ul (1 unidade de ensaio, UA) de Vector HVJ-Envelope com 4 ul de o factor envolvente, a mistura foi centrifugada (10000 x

g

, 10 min, 4 ° C), e o sedimento ressuspenso em 10 ul de solução tampão. Em seguida, adicionaram-se 10 ul de uma solução de mistura de 3 siRNAs (# 1, # 2 e # 3, 1 mg /mL cada), e a mistura foi mantida em gelo durante 5 min. ACSF estéril (10 ul) contendo ARNic em cadeia dupla sintéticos (0,45 pmol /animal) foi injectado no espaço subaracnóide entre os vertebrados L5 e L6 de murganhos conscientes. As sequências de oligonucleótido siRNA (sentido) foram os seguintes: receptor de PAF (# 1, 5′-CACCUCAGUGAGAAGUUUUACAGCA-AG-3 ‘; # 2, 5′-ACCCUUCCAAGAAACUAAAUGAGAU-AG-3′; # 3, 5’-CAACUUCCAUCAGGCUAUUAAUGAU- AG-3 ‘; sequências de direccionamento ao redor posição 1005-1029, 232-256, 893-917, respectivamente, em

PAFR

, GenBank não D5087).. Além disso, siARN incompatíveis com três ou quatro coincidências nucleotídicas foi preparado para examinar os efeitos não-específicos de ARNic em cadeia dupla (siARN # 4, 5′-ACUCUGCCAAGAGACUACAUGAGAU-AG-3). Estas sequências selecionadas também foram submetidos a uma pesquisa BLAST (Bioinformatics Institute Center for Chemical Research, Universidade de Kyoto, Japão) contra a sequência do mouse genoma para garantir que apenas um gene no genoma do rato foi alvejado. siRNAs foram adquiridos de iGENE Therapeutics Inc. (Tsukuba, Japão).

Análise Comportamental na FBC Modelo

A análise comportamental foi executada seguindo o protocolo descrito anteriormente [5], [10]. Os comportamentos relacionados com a dor no modelo FBC foram avaliados antes e depois da administração da droga em 11 dias após a implantação do tumor. Os animais experimentais e operação simulada foram avaliados quanto em curso dor baseado em guardando comportamento, para a dor ambulatorial com base no membro de usar anormalidade, e para o comportamento alodinia-like com base no teste teste do filamento e pincel von Frey. Guardando comportamento, anormalidade limb-uso e dor alodinia-like foram avaliados nos mesmos animais. Os ratinhos foram colocados numa caixa de observação de plástico claro e deixou-se que se habituem durante 15 min. Em seguida, o comportamento de guarda espontânea foi avaliado durante um período de observação de 2 min. O tempo de elevação da pata traseira no lado ipsilateral durante a deambulação foi medida como guarda comportamento. Membro-uso anormalidade foi pontuada numa escala de 0 a 4: 0, o uso normal do membro; 1, ligeiro coxear; 2, limp clara; 3, a não utilização parcial do membro; e 4, completa falta de uso do membro. alodinia comportamento semelhante foi avaliada pelo roçar leve a perna lesada com um pincel (contagem alodinia) ou avaliada através da medição do limiar de retirada da pata em resposta a sondagem com uma série de finos filamentos calibrados (limiar de alodinia), tal como relatado anteriormente [5]. A pontuação alodinia foi classificada como descrito por Minami et al. [11]: 0, sem resposta; 1, chiado leve com as tentativas de afastar-se da sonda carícias; 2, chiado vigorosa, mordendo a sonda acariciando e grandes esforços para escapar da sonda acariciando. Os valores são a média da pontuação total avaliada 3 vezes em cada ponto de tempo (possível pontuação máxima em cada ponto de tempo: 2 /mouse). Os tempos de guarda foram significativamente prolongada em 5 e 6 dias após implantação do tumor, em comparação com os valores no pré-implantação. Da mesma forma, os animais também passaram a exibir limb-uso anormal em 5 dias após a implantação do tumor, e tal comportamento anormal foi mais proeminente nos dias posteriores. O limiar de alodinia foi avaliada através da medição do limiar de retirada da pata em resposta a sondagem com monofilamentos de von Frey, e quedas de limiar significativas foram observadas após o 3

dias após implante do tumor Rd em comparação com os valores no pré-implante, e a redução atingiu um pico após 5 e 7 dias. A pontuação alodinia foi avaliada medindo a resposta classificados para levemente acariciando com um pincel, e aumentos de pontuação significativos foram observados após a implantação pós tumor 4-dia, em comparação com os valores no pré-implante, e o aumento atingiu um máximo após 6 e 8 dias. Durante toda a experiência, o teste comportamental foi realizada sob condições cegas por um único experimentador. As injecções foram realizadas cego por outra pessoa. injecção intratecal foi realizada como descrito anteriormente [4].

Determinação de liso-PAF-acetiltransferase (liso-PAF NA) /Lysophospha- tidylcholine Aciltransferase 2 (LPCAT2), um PAF síntese da enzima

as regiões lombar da medula espinal (L2-L6) foram obtidos a partir de ratos sham-operated (amortecer células implantadas) ou portadores de tumor. Os tecidos da medula espinal (4,8-5,0 mg) foram homogeneizados em Tris-HCl 20 (pH 7,5) contendo EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 10 mM, 10 mM de p-glicerof osf ato e 1 ug /ml de vários inibidores de protease ( benzamdine, leupeptina e de antipaina). O homogenato foi feita reagir com 0,6% de NP-40 durante 5 min a 4 ° C, seguido por centrifugação a 15.000 rpm durante 5 min a 4 ° C e foi obtido o sobrenadante. O sobrenadante foi misturado numa razão de volume de 4:01 em Tris-HCl a 10 (pH 6,8) contendo 10% (v /v) de glicerol, 2% dodecilsulfato de sódio (SDS), azul de bromofenol a 0,01% e 0,5% β-mercaptoetanol , com subsequente de ebulição a 70 ° C durante 30 min.

Immunoblotting Ensaios

As amostras obtidas foram submetidas a electroforese durante 2 horas à temperatura ambiente em géis de poliacrilamida (gel de empilhamento 3% e separação em gel de 10% ) e, em seguida, transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno previamente tratados com 100% de metanol. As proteínas transferidas para as membranas foram bloqueadas por incubação com solução de bloqueio, um tampão 5% desnatado contendo leite de lavagem (Tris-HCl 20 (pH 7,5), NaCl 137 mM e 0,1% de Tween 20), a 25 ° C durante 1 h. As membranas foram expostas ao anticorpo primário como se segue: contra LPCAT2 (1:1,000; Sigm); contra β-actina (1:1,000; Innovations Imgenex de genómica funcional, SanDiego, CA), diluída com o tampão de lavagem contendo 1% de leite desnatado durante a noite a 4 ° C, seguido por lavagem três vezes com o tampão de lavagem, e, em seguida, a incubação com um anticorpo secundário como se segue: para o anticorpo e anticorpo LPCAT2 β-actina, um anticorpo anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase de rábano (1:2,000; DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) à temperatura ambiente durante 1 h. As membranas foram novamente lavadas três vezes com o tampão de lavagem e desenvolvida com um quimioluminescência aumentada (ECL) sistema de detecção de western (reagentes ECL, adquiridas a partir de Thermo Fisher Scientific, Inc. e Nacalai Tesque, Quioto, Japão; ImageQuant ™ LAS 4000 mini-sistema de detecção, GE healthcare Japão, Tokyo, Japão). A densidade de cada banda foi analisada utilizando o software NIH Imagem, e as unidades densitométricos foram corrigidas utilizando o valor de β-actina. Os dados são expressos como a média ± SEM.

induzida por morfina constipação

Ratos foram fornecidos alimentos e água ad libitum antes do período de teste, e ambos (com ou sem TCV-309) grupos consumidas quantidades comparáveis ​​de alimentos antes do teste, conforme medido ao longo de um período de 24 horas no ambiente de teste. Nenhum alimento ou a água estava disponível durante o ensaio. Os ratos foram enjaulados em caixas de acrílico com pavimentos de grades suspensas sobre papel de filtro. boli fecais foram recolhidas a partir de cada grupo de murganhos a cada hora durante 1 h após a injecção de soro fisiológico ou de várias doses de morfina e o peso de boli fecais foi registado como um indicador dos efeitos da constipação de morfina.

Geração de Curvas de Kaplan-Meier de sobrevida

a saúde dos ratos foi examinado diariamente. Os ratos que apresentavam sinais de doença foram mortos por deslocamento cervical de acordo com as recomendações da nossa Comissão de Ética. Em nossa experiência, estes sinais precedem o momento da morte por um par de dias. A hora da morte foi registrada para cada rato que foi encontrado morto ou foi morto. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram gerados usando software Graphpad Prism (versão 4; Graphpad, Inc, San Diego, CA):

Análises Estatísticas

Todos os dados são reportados como valores da média ± SEM. (erro padrão da média). o software GraphPad Prism versão 4 foi usado para realizar a análise estatística. Com relação à análise estatística dos comportamentos relacionados com a dor, as comparações dos allodynis marcar, limiar de retirada, guardando comportamento e membro-use anormalidade das diferenças entre os grupos tratados com o fármaco e o grupo tratado com veículo foram avaliados utilizando ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Tukey-Kramer, ou um estudante de não pareado

t

-teste. Comparações de sobrevida mediana foram realizadas utilizando log-rank e testes Gehan-Breslow-Wilcoxon. Um valor de probabilidade (P) de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Efeitos do Systemic Administração da Específica PAF Antagonistas do Receptor sobre Tactile alodinia e dor Comportamentos em FBC Mice Modelo

.

Efeitos da TCV-309 na alodinia e dor comportamentos (guardando o comportamento ea integridade física de usar anormalidade) foram examinados em ratinhos modelo FBC. TCV-309 com uma gama de 10-300 ug /kg i.v. pela dependentemente da dose reduziram a pontuação alodinia (Figura 1A) e aumentou o limiar de retirada (Figura 1B) em 11 a 15 dias após a implantação do tumor nos ratinhos. Os efeitos de TCV-309 foram bastante duradouro. Por exemplo, TCV-309 melhorou significativamente a alodinia mecânica por uma única injecção de 100 ug /kg, i.v. com um efeito de pico em 1 a 2 dias após a injecção até 6 dias. comportamento de guarda foi continuamente agravada durante o período de observação, enquanto membro de usar anormalidade atingiu uma resposta máxima e continuou durante o período (Figura 1C, 1D). comportamento de guarda e membros de usar anormalidade também foram melhorados pela TCV-309. TCV-309 até 1 mg /kg não afectou o comportamento geral ou função motora estimado pelo teste de rotarod (dados não mostrados). Outros antagonistas dos receptores de PAF, BN 50739 e WEB 2086, também melhorou os comportamentos alodinia e dor nos ratos modelo FBC (Figure1E-1H).

TCV-309 0,01-0,3 mg /kg, WEB 2086 0,1 mg /kg, BN 50739 0,1 mg /kg ou um veículo foram injectados intravenosamente com 11 dias após o transplante do tumor. Os ratinhos de controlo receberam injecções com um veículo: solução salina ou 25% de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina. Os comportamentos relacionados à dor que se desenvolveram após a implantação do tumor em ratos não foram afetados pelos tratamentos de veículos. Os valores representam a média ± SEM. n = 11 ratos por grupo. † P 0,05, * P 0,01 comparado com os valores de controlo correspondente (tratado com veículo), tal como determinado por análise de variância, seguida pelo teste de Tukey-Kramer

efeitos do bloqueio da espinal PAF receptores na. alodinia e dor Comportamentos em FBC modelo Mice

Para confirmar o local de tratamento paliativo da dor do câncer por antagonistas PAF, os efeitos da injeção intratecal de TCV-309 e WEB 2086, além de interferência na expressão de receptores de PAF espinhal usando ARNsi de ARNm do receptor de PAF foram examinados. administração espinal de 10 pg destas drogas 13 dias de implantação do tumor produzidos e marcados rápida supressão da alodinia táctil, com o efeito máximo a 1 dia pós-implantação e suprimiu significativamente a alodinia dentro de 4 dias (Figura 2A). efeitos de libertação dor avaliada pela limiar de retirada, guardando comportamento e membro-use anormalidade da injeção intratecal de TCV-309 e WEB 2086 também foram alcançados (Figura 2B-2D)

(A-D).; As células tumorais foram implantadas no intramedulla de osso do fémur esquerdo de 13 dias antes da injecção intratecal (i.t.) de antagonistas do receptor de PAF. TCV-309 (10 pg /ratinho), WEB 2086 (10 pg /ratinho) ou o veículo foram injectados por via intratecal no momento “0”. Os dados são expressos como a média ± SEM., N = 8-12 ratinhos por grupo. * P 0,01 comparado com o controlo correspondente (tratado com veículo) valores, conforme determinado por análise de variância, seguida pelo teste de Tukey-Kramer. Os ratinhos de controlo receberam injecções com um veículo: ACSF. Os comportamentos relacionados à dor que se desenvolveram após a implantação do tumor em ratos não foram afetados pelos tratamentos de veículos. (EH); siRNA ou ARNsi sem correspondência de ARNm do receptor de PAF foram transfectados para a medula espinal de 13 dias após a implantação do tumor. Os dados são expressos como a média ± SEM. n = 8-10 ratinhos por grupo. † P 0,05, * P 0,01 comparado com os valores de controlo correspondente (mismatched transfecção siRNA), como determinado por análise de valiance seguido por uma de Student não pareado

t

-test. Os ratinhos de controlo receberam injeções com mismatched siRNA ou um veículo: somente HVJ-envelope. Os comportamentos relacionados com a dor que se desenvolveram após a implantação do tumor em ratinhos não foram afectados por incompatíveis siRNA ou veículo tratamentos.

knockdown da expressão da proteína do receptor de PAF espinhal foi conseguida por transferência intratecal de receptor de PAF em siRNA ratos. Como relatado anteriormente, uma redução significativa na expressão de receptor de PAF em ratos normais e ratos 15 dias após a cirurgia sobre o nervo ciático, atingindo 37,5 ± 5,4% e 29,9 ± 4,9% do controlo, aos 3 dias de siRNA transfecção, respectivamente, enquanto que a expressão não foi alterada pelo vector HVJ-e sozinho ou incompatíveis siRNA [5]. Por siRNA transfecção de 13 dias de implantação do tumor, a pontuação alodinia, limiar de retirada, que guardam o comportamento de um membro usar anormalidade foram melhorados com o efeito de pico em 2 a 3 dias após siRNA transfecção, enquanto a ação de alívio da dor desapareceu gradualmente ao longo de 9 dias (Figura 3E-3H). A injecção de siRNA incompatíveis não teve efeito sobre o desenvolvimento da alodinia e dor comportamentos. A quantidade de proteína LPCAT2 aumentou significativamente na medula espinhal às 8, 15 e 30 dias após o transplante de NCTC 2472 células tumorais em ratinhos tíbia (Figura 3). Os resultados apoiam o conceito de que o PAF aumento na espinal medula de ratinhos portadores de tumores podem estar relacionados com a produção de dor e que o local de acção de alívio da dor dos antagonistas do receptor de PAF envolver a espinal medula em ratos FBC.

alteração da expressão espinal LPCAT2 3, 8, 15, e 30 dias após os níveis de imunorreactividade foram normalizados para que de β-actina e representadas como indução% em comparação com os valores de murganhos (células implantadas amortecer) operação simulada (média ± SEM ., n = 5-7). * P 0,05, *** P 0,001 versus os valores correspondentes em ratos operados por simulação (de Student não pareado

t

-teste)

potencialização do efeito analgésico por combinação. da PAF Antagonistas do Receptor com Morphine

dor do câncer de osso é um dos tipos mais graves de dor do câncer e é frequentemente resistentes ao tratamento, mesmo com analgésicos opiáceos. Combinações de opióides e analgésicos não opióides são uma prática usual para obter um melhor efeito analgésico na prática clínica. A administração combinada de morfina com TCV-309 foi examinada (Figura 4A). Morfina 0,1 e 0,3 mg /kg de injecção de 1 dia após a TCV-309 3 e 10 ug /administração kg produziu uma redução acentuada na pontuação alodinia 30 min após a injecção de morfina e o efeito devolvido para cada nível de TCV-309 sozinho em 3 a 4 horas após a administração. A combinação de morfina 1 mg /kg de gabapentina com 10 mg /kg i.v. não teve qualquer efeito significativo anti-alodinia (Figura 4B). Uma grande dose de gabapentina, 30 mg /kg, foi necessária para produzir um efeito anti-alodinia transiente. A morfina sozinho teve pouco efeito analgésico em 0,3 a 3 mg /kg, s.c. e um pequeno efeito a 10 mg /kg no modelo de FBC. Uma dose mais elevada de 30 mg /kg de morfina foi menos eficaz (Figura 4C).

foram injectados TCV-309, 3 e 10 ug /kg i.v. aos 10 dias pós implantação do tumor e morfina 0,1 mg /kg e 0,3 mg /kg foram injectados s.c. 1 dia após a injecção de TCV-309 (A). A gabapentina 10 e 30 mg /kg i.v. Foram injectados 11 dias após o transplante do tumor e morfina, 1 mg /kg foi injectada aos 30 min após injecção de gabapentina (B). A morfina 0,3-30 mg /kg foi injectado a 11 dias após o transplante do tumor (C). comportamentos de dor-like foram avaliados em 20 minutos após a injeção de morfina. Várias doses de TCV-309 foram injectados i.v. aos 11 dias pós implantação do tumor e morfina 0,3 mg /kg foram injectados s.c. 1 dia após a injecção de TCV-309 (D). Um dia após a injecção de TCV-309, várias doses de morfina foram injectados (E). Os ratinhos de controlo receberam injecções com um veículo: solução salina. Os comportamentos relacionados à dor que se desenvolveram após a implantação do tumor em ratos não foram afetados pelos tratamentos de veículos. Cada grupo continha 11 ratinhos.

† P 0,05, * P 0,01 comparado com o controlo correspondente (tratado com veículo) valores, conforme determinado por análise de variância, seguida pelo teste de Tukey-Kramer.

§P 0,01 em comparação com o controlo correspondente (tratado com veículo sem morfina) valores, conforme determinado por análise de variância seguido pelo de um Student não pareado

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. a relação dose-resposta de TCV-309 e morfina em combinação é mostrado na Figura 4D e 4E Figura. A morfina 0,3 mg /kg e 0,1-1,0 TCV-309 ug /kg em cada dose sozinhos não teve nenhum efeito anti-alodinia, mas em combinação, a alodinia pontuação diminuiu mais de 90%, dependendo da dose de TCV-309 (Figura 4D ). A morfina, em combinação com TCV-309 10 ug /kg tão baixo quanto 0,03 mg /kg produziu um efeito significativo anti-alodinia e aboliu a resposta a alodinia a 0,3 mg /kg (Figura 4E). Oito dias após a injecção de TCV-309, BN WEB 2086 e 50739, para aliviar a dor efeito destes compostos se tornou não significativa (Figura 5). No entanto, a administração adicional de morfina 0,3 mg /kg ainda marcadamente melhorada alodinia e comportamentos de dor (Figura 5). Estes resultados mostraram que os antagonistas dos receptores de FAP, consegue potenciação de longa duração do efeito analgésico quando a morfina foi administrada.

TCV-309, BN WEB 2086 e 50739 foram administradas com 11 dias após a implantação do tumor. A morfina 0,3 mg /kg s.c. foi injectada em 8 dias após a injecção dos antagonistas do receptor de PAF. Alodinia (A, B), que guarda o comportamento (C) e do membro de usar anormalidade (D) foram avaliadas aos 20 min após a injecção de morfina. Os valores representam a média ± SEM. n = 11 ratos por grupo. * P 0,01 comparado com os valores de controlo correspondentes, tal como determinado por análise de variância, seguida por

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induzida por morfina Efeito de Antagonistas do Receptor de PAF em de um Student não pareado. constipação

a constipação é um dos efeitos colaterais mais comuns da morfina e aparece em quase todos os pacientes tratados com morfina. Se o efeito da morfina obstáculo sobre a actividade intestinal não é potenciada, este efeito colateral de morfina pode ser reduzida pela redução da dose de morfina sem perturbar o efeito analgésico. A morfina reduziu a quantidade de fezes de 1 mg /kg s.c. e suprimiu ainda mais do que 10 mg /kg. O efeito constipação dependente da dose de morfina não foi afectada por TCV-309 10 mg /kg (Figura 6).

os ratos normais receberam com várias doses de morfina e as fezes acumulados no piso ao longo 60-309 estava injetado 1 dia antes da administração de morfina. Os dados são expressos como a média. n = 10 ratos por grupo.

A administração repetida de TCV-309 Protegido contra o aparecimento da dor-like Comportamento

Como o efeito anti-alodinia da TCV-309 foi longo duradoura, foi examinado o efeito da administração repetida. Em ratos de controlo, a alodinia táctil apareceu aos 3 dias após a implantação do tumor e alcançado para o pico de resposta em 8 dias. comportamento de guarda apareceu aos 10 dias pós-implantação do tumor e aumentou gradualmente ao longo de 30 dias, enquanto membro de usar anomalia apareceu em 8 dias e atingiu um máximo em cerca de 16 dias após a implantação (Figura 7A-7D). A injecção de TCV-309 a 0,3 mg /kg, i.v. foi iniciado no dia os ratinhos foram implantados com tumor e foi continuada a cada 4 dias durante 28 dias. comportamentos de dor avaliados pela pontuação alodinia, limiar de retirada, comportamento de guarda e membros de usar anormalidade não apareceu durante a dosagem (Figura 2). Assim, o tratamento com TCV-309 antes de dor surgiu protegido contra a crise de dor e tolerância à TCV-309 analgesia não se desenvolveu.

A administração da TCV-309 de 0,3 mg /kg i.v. foi iniciada seis horas antes da implantação do tumor, administrado uma vez por dia e continuou a cada 4 dias até 28 dias. Alodinia (A, B), que guarda o comportamento (C) e do membro de usar anormalidade (D) foram avaliados nos dias 3 horas e 1, 2, 3 dias após a injecção TCV-309.