Abstract

Fundo e Propósito

microRNAs (miRNAs) de tecido pode detectar cânceres e predizer o prognóstico. Vários estudos recentes relataram que o tecido, plasma, saliva e miARNs compartilhar perfis de expressão similares. Neste estudo, nós investigamos o poder discriminatório dos miRNAs salivares (incluindo saliva total e sobrenadante saliva) para a detecção de câncer de esôfago.

Materiais e Métodos

Por Agilent microarray, seis miRNAs desregulamentados de toda foram selecionadas amostras de saliva de sete pacientes com câncer de esôfago e três controles saudáveis. Os seis miRNAs selecionados foram submetidos a validação de seus níveis de expressão por RT-qPCR utilizando ambas as amostras de saliva e sobrenadante saliva inteiros a partir de um conjunto independente de 39 pacientes com câncer de esôfago e 19 controles saudáveis.

Resultados

Seis miRNAs (miR-10b *, miR-144, miR-21, miR-451, miR-486-5p e miR-634) foram identificados como alvos por Agilent microarray. Após a validação por RT-qPCR, miR-10b *, miR-144 e miR-451 em saliva completa e miR-10b *, miR-144, miR-21, e miR-451 em sobrenadante de saliva foram significativamente regulada positivamente em pacientes, com sensibilidades de 89,7, 92,3, 84,6, 79,5, 43,6, 89,7 e 51,3% e especificidades de 57,9, 47,4, 57,9%, 57,9, 89,5, 47,4 e 84,2%, respectivamente.

Conclusões

Encontramos miRNAs distintos para câncer de esôfago no todo, tanto saliva e saliva sobrenadante. Estes miRNAs possuem poder discriminatório para a detecção de câncer de esôfago. Porque a coleta da saliva não é invasivo e conveniente, miRNAs salivares mostram a grande promessa como biomarcadores para a detecção de câncer de esôfago em áreas de alto risco

Citation:. Xie Z, Chen G, Zhang X, Li D, Huang J, Yang C, et ai. (2013) MicroRNAs salivares como biomarcadores promissores para a detecção de câncer de esôfago. PLoS ONE 8 (4): e57502. doi: 10.1371 /journal.pone.0057502

editor: Anthony W. I. Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 29 de outubro de 2012; Aceito: 22 de janeiro de 2013; Publicação: 01 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Xie et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de esôfago (CE) é o oitavo mais comum. câncer e sexta principal causa de mortalidade por cancro em todo o mundo [1]. Estima-se que 482,300 novos casos de CE e 406,800 mortes ocorreram em 2008 em todo o mundo. As taxas de incidência variam internacionalmente em cerca de 16 vezes, com as taxas mais elevadas na África Austral e Oriental e na Ásia Oriental e o menor na Europa Ocidental e Oriente África e da América Central, em ambos os machos e fêmeas. CE é de 3 a 4 vezes mais comum entre homens do que mulheres [2]. Sua incidência tem aumentado rapidamente nos países ocidentais durante a metade do século passado [3]. A área Chaoshan da província de Guangdong na China tem uma alta incidência de CE ( 100 /100.000) [4]. O número de mortes causadas por CE na China é responsável por mais de 70% de todas as mortes em todo o mundo CE [5]

A taxa de sobrevida global permanece baixa.; apenas 3-5% dos pacientes diagnosticados sobreviver por 5 anos [6]. Em contraste, a taxa de sobrevivência aumenta para 90% em pacientes com diagnóstico de doença Estágio I (T1N0M0) que se submetem à ressecção cirúrgica [7]. Portanto, o diagnóstico e tratamento precoces são vitais. Actualmente, o diagnóstico clínico depende principalmente de radiologia e biópsia endoscópica. No entanto, estes testes são caros, invasivo, ou causar desconforto aos pacientes, ea maioria dos pacientes estão em uma fase tardia da doença, quando o diagnóstico preciso é atingido. Portanto, é necessário identificar um biomarcador de início de carreira CE.

Vários estudos têm demonstrado que a expressão aberrante de miRNAs está intimamente relacionada com a patogênese e desenvolvimento de câncer, e miRNAs possuem poder discriminatório como biomarcadores de câncer [ ,,,0],8]. Vários estudos têm relatado que miRNAs são expressas de forma aberrante em tecidos e plasma câncer em pacientes com CE [9], [10]. No entanto, a expressão de miARN na saliva de pacientes com CE ainda não foi relatada. Devido ao grande suprimento de sangue nas glândulas salivares, a saliva é considerado para ser um produto de terminal de circulação do sangue, e moléculas que estão presentes no plasma também estão presentes na saliva. Assim, acredita-se que a saliva para espelhar saúde sistêmica e refletem as condições tais como cancros, doenças infecciosas, doenças cardiovasculares,

etc

. [11]. Tecidos, plasma e saliva miRNAs compartilhar perfis de expressão similar [12] – [16]. Este estudo compreendeu duas fases: a fase de descoberta e validação. Na fase de descoberta, seis miRNAs que foram desregulados mais significativamente em toda saliva de pacientes com CE por análise de microarray da Agilent foram selecionados como alvos. Na etapa de validação, os níveis dos seis miRNAs alvo de expressão foram validados por RT-qPCR utilizando ambas as amostras de saliva e sobrenadante saliva inteiras.

Materiais e Métodos

Amostra estimativa do tamanho

na fase de descoberta, de acordo com os resultados de microarray da Agilent, a sensibilidade de miR-144 para CE foi de 85,7%. A fórmula para a estimativa do tamanho da amostra foi a seguinte: n =

u

α

/2P (1-P) /

δ

2

Nesta fórmula,

n

é o número necessário,

u

α

/2 é o nível de teste,

α é

o valor de corte de duas caudas de distribuição normal,

P

é o valor esperado da sensibilidade, e

δ

é o erro permissível.

de acordo com a capacidade de atingir o tamanho da amostra para nosso estudo, nós escolhemos os valores

α

= 0,05 (

u

alfa

/2 = 1,96),

δ

= 0,11, e os valores foram substituídos na fórmula. O resultado foi

n

= 1.96

2 × 0,857 × (1-0,857) /0.15

2 ≈38.9 = 39. Ou seja, na fase de validação deste estudo, o número mínimo de casos necessários para o grupo CE foi de 39, e 39 casos foram escolhidos. De acordo com a capacidade de atingir o tamanho da amostra para o nosso estudo, nós assumimos a proporção de casos no grupo CE para que no grupo saudável para ser 2:01. 19 casos no grupo saudável foram escolhidos.

seleção Assunto

46 amostras de sobrenadante de saliva e 46 de saliva inteiro de 46 pacientes com CE e toda 22 saliva e 22 amostras de sobrenadante de saliva de conta a idade, género e indivíduos saudáveis ​​etnicamente combinados foram obtidos a partir de Guangdong Hospital Geral entre julho de 2011 e janeiro de 2012. os resultados histopatológicos dos pacientes foram confirmados por biópsia endoscópica, e os pacientes da CE não tinha doenças orgânicas, sistémicos, ou orais concomitantes, como a hepatite, diabetes mellitus,

etc

, que poderiam influenciar os níveis de expressão do marcador da CE. estadiamento do câncer foi baseada no sistema de estadiamento /TMN UICC [17]. Fases I, II, e III foram baseadas nos resultados histopatológicos após ressecção cirúrgica. Fase IV foi baseada em resultados de histopatologia de punção biópsia de nódulos metastáticos ou resultados PET-CT. “N /A (não disponível)” foi atribuído quando os pacientes se recusou mais testes ou tratamentos. indivíduos saudáveis ​​foram coletadas, como controles com base nos resultados dos exames de saúde negativos, incluindo exames de sangue, radiografias de tórax, exames orais, exames de ultra-som abdominal, teste oculto-sangue fecal, e exames retais digitais. Nenhum desses controles tinha sido diagnosticado com qualquer tipo de malignidade seja anterior ao estudo ou no momento da coleta. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Conselho de Ética e o Institutional Review em Guangdong General Hospital. Todos os participantes foram fornecidos consentimento por escrito para a sua informação a ser armazenada no banco de dados do hospital e usado para a pesquisa.

coleção Saliva

Os indivíduos foram convidados a abster-se de comer, beber, fumar e higiene oral procedimentos para, pelo menos, 2 horas antes da recolha. Para estimular o fluxo salivar glandular, os indivíduos receberam uma solução de ácido cítrico a 2% para aplicação sobre as superfícies laterais bilateral posterior da língua, com uma mecha de algodão para 5 s cada 30 s. A estimulação de ácido cítrico continua em intervalos de 30 segundos durante todo o procedimento de coleta. Até 5 mL de saliva a partir de cada sujeito foi recolhido num tubo de centrífuga de 50 mL. Um total de 2 ml de saliva foi removido do tubo como uma amostra de saliva completa. Os restantes 3 ml de amostras de saliva foi centrifugada a 3000 ×

g

durante 15 min a 4 ° C para girar para baixo células esfoliadas, e o sobrenadante foi transferido para tubos de microcentrífuga seguidos por uma segunda centrifugação a 12000 ×

g

durante 10 min a 4 ° C para remover completamente os componentes celulares como amostras de saliva sobrenadante. saliva completa é a saliva que não foi centrifugada. Pode conter esfoliada células de câncer de esôfago regurgitados do esôfago devido à obstrução por tumor de esôfago. A saliva é sobrenadante da saliva que foi centrifugado e que não contém quaisquer células esfoliadas e outros sedimentos. Daí saliva sobrenadante é considerada como sendo o produto de terminal da circulação do sangue e que podem reflectir ambiente interno dos nossos BODIS. As amostras foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. O procedimento acima mencionado deve ser concluído dentro de 2 h [18].

Agilent microarray na descoberta de fase

Porque esta é a primeira pesquisa sobre microRNAs salivares para a detecção de CE no mundo, nós apenas escolheu 10 casos para executar microarray. Sete amostras de saliva inteiras do grupo CE e 3 do grupo saudáveis ​​foram selecionados aleatoriamente. A patologia de todos os sete pacientes com CE foi o carcinoma escamoso; um era de estádio I, uma fase II, de 3 fase III, e dois estágio IV. Um total de 923 sequências de miRNA maduras foram reunidos e integrados em nosso projeto miRNA microarray. Os dados brutos foram normalizados pelo algoritmo Quantile, Gene Primavera Software 11.0 (tecnologias de Agilent, Santa Clara, CA, EUA). 6 miARNs foram seleccionados como alvos, e os seus níveis de expressão foram validados por RT-qPCR em fase de validação. O método de selecção foi como se segue: o valor gTotalGeneSignal no microarray da Agilent ascendeu ao nível de cada miARN expressão. Portanto, para miRNAs idênticos, gráficos de barras foram desenhados de acordo com o valor gTotalGeneSignal de cada miRNA. Foram selecionados cinco miRNAs: miR-144, miR-10b *, miR-451, miR-486-5p e miR-634, cujos valores tendem a ser muito maior ou menor no grupo de CE que no grupo saudável e que também estão intimamente associados com o desenvolvimento de moléstias. Enquanto isso, vários estudos têm relatado que miR-21 é aberrante expresso em tecido canceroso e plasma de pacientes com CE [9], [10]; o valor gTotalGeneSignal de miR-21 não mostraram essa tendência, mas também foi selecionado como um alvo. Os gráficos de barras dos 6 miARN alvo foram apresentados na Figura 1. As sete (barras em frente representam o valor gTotalGeneSignal a partir do grupo CE, e a 3 representam atrás do valor gTotalGeneSignal a partir do grupo saudável. Eixo dos Y representa o valor de gTotalGeneSignal )

.

a), com a excepção da amostra de 4, os valores das amostras do grupo CE, seis foram maiores do que as das três amostras de indivíduos saudáveis. B) Com a excepção da amostra 2, os valores das amostras do grupo CE, seis foram maiores do que as das três amostras de indivíduos saudáveis. C) Com a excepção da amostra 10, os valores das amostras do grupo CE, sete foram maiores do que aqueles das duas amostras de indivíduos saudáveis. D) com a excepção da amostra 10, os valores das amostras do grupo CE, sete foram maiores do que aqueles das duas amostras de indivíduos saudáveis. E) Todos os valores do grupo da CE foram menores do que os três do grupo saudável. F) Vários estudos têm relatado que miRNAs são expressas de forma aberrante em tecidos e plasma de pacientes CE câncer; no entanto, o valor gTotalGeneSignal de miR-21 não diferiram entre a CE e os grupos saudáveis. No entanto, também foi selecionado como um alvo miRNA.

fase de validação

Os níveis de expressão dos miRNAs 6 selecionados foram validados por RT-qPCR utilizando ambas as 58 amostras de saliva inteiros e as amostras de sobrenadante 58 de saliva de 39 pacientes com CE e 19 controles saudáveis. O Kit miRvana PARIS (Ambion, EUA) foi utilizado para isolar o ARN total a partir de 1 ml de saliva completa ou sobrenadante da saliva, de acordo com o protocolo do fabricante. Finalmente, o ARN foi eluído em 30 mL de água isenta de nuclease pré-aquecido (95 ° C) e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. A qualidade e concentração de RNA total isolado foi determinada utilizando um NanodropND-1000 (Thermo Scientific, Worcester, MA), com o valor de OD260 /280 em torno de 2,0 indicando elevada qualidade ou a pureza. A reacção de transcrição reversa foi realizada primeiro com 11 uL de mistura contendo 2 ul de extracto de RNA, 2 ul de iniciador de RT (Ribo, China), e 7 mL de água isenta de nuclease. A mistura de 11 ul foi incubada a 70 ° C durante 10 min e em gelo durante 2 min. Em seguida, 5 mL de tampão RT, 2? L de dNTP (2,5 mM), 0,5 ul de inibidor de RNase (40 U /ul), 0,5 ul de transcriptase reversa (200 U /uL), e 6 mL de água isenta de nuclease eram adicionou-se à mistura 11-mL. A reacção de transcrição reversa continuou a 42 ° C durante 60 min, 70 ° C durante 10 min, e 4 ° C durante ∞. solução ADNc (3 mL) foi amplificado utilizando 9 mL de SYBR Premix Ex Taq (Takara, China), 2 uL de miARN iniciador para a frente, 2 uL de miARN iniciador para trás, e 4 mL de água isenta de nuclease, num volume final de 20 mL. PCR quantitativa foi realizada num Biorad CFX96 2.1 (BioRad Biosystems), e as misturas reaccionais foram incubadas a 95 ° C durante 2 min, seguido de 50 ciclos de 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 10 s. No final dos ciclos de PCR, o qual funde análise da curva foi realizada para validar a geração do produto esperado de PCR. O ajuste de curva de fusão era de 65,0-95,0 ° C em incrementos de 0,5 ° C durante 0,05 min + leitura placa. Cada amostra foi analisada em triplicado. Todos os valores Ct foram 36. Os níveis de cada um miARN alvo de expressão foram normalizadas para que de miR-16. miR-16 é o mais amplamente utilizados microARN internos de controlo em amostras do corpo de líquido, incluindo o plasma [10], [19]. E o mais importante, na fase de descoberta e fase de validação, o nosso estudo demonstrou que miR-16 poderia expressar de forma estável na saliva e no trabalho como um controlo interno para miRNAs salivares. Os dados brutos na fase de descoberta pode ser baixado a partir do site da GEO: www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/linking.html, e o número de acesso é GSE41268. O methodoloy, os dados e imagens da validação do miR-16 como um controlo interno em nossa pesquisa matérias foram apresentados nos dados S1. Todos os níveis de expressão foram calculados utilizando o

-ΔΔCt método 2 [20]. Resumidamente: sample

iΔCt

alvo miR = sample

TIC

alvo miR-sample

TIC

miR-16; sample

iΔΔCt

alvo miR = sample

iΔCt

alvo miR -. o valor médio do ΔCt

alvo miR do grupo saudável

Análise estatística

os níveis de expressão de miRNAs e idades foram comparadas pelo teste de Mann – Whitney ou o teste de Kruskall – Wallis H. Sexos foram comparados usando o χ

2 de teste. Um modelo de regressão logística multivariada foi estabelecido para os fatores de risco 4: tabagismo, consumo de álcool, beber ou comer em temperaturas quentes e nacionalidade Chaoshanese. As odds ratio (OR) dos fatores de risco 4 foram calculados por LR para a frente. Cada OU foram comparadas através do χ

2 de teste. características operacional do receptor (ROC) foram utilizados para avaliar o poder discriminatório de cada miARN para a diferenciação de pacientes e controlos. A correlação de cada nível de expressão miRNA entre toda saliva e saliva sobrenadante foi analisada pelo teste de correlação de Spearman. As diferenças nos poder discriminatório de miARN alvo foram comparados com o método de Delong usando o software MedCalc12.2.1. Outras análises estatísticas foram realizadas com o software SPSS, versão 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).

p valor de . 0,05 foi considerado para indicar significância estatística

Resultados

Whole saliva perfil

Dez amostras de saliva inteiros (7 de doentes com CE e 3 a partir de controles saudáveis) foram avaliados por Agilent microarray. Um total de 923 sequências de miRNA maduras foram reunidos e integrados em nosso projeto miRNA microarray. Um total de 461 miARNs foram detectados em saliva completa (o valor do sinal da sonda destes miARNs estava presente em pelo menos uma amostra). Destes 461 miARNs, 452 foram detectados em amostras de CE e 391 nas amostras de controlo saudáveis. Um total de 232 miARNs foram detectados em todas as 10 amostras. Um total de 261 miRNAs foram detectados em todas as 7 amostras CE, e 243 miRNAs em todas as amostras de controlo 3. Vinte e cinco miRNAs mostraram diferenças significativas na expressão entre o grupo de CE e o grupo saudável. 6 miRNAs (miR-144, miR-10b *, miR-21, miR-451, miR-486-5p, e miR-634) foram submetidos a validação de seus níveis de expressão por RT-qPCR. O número de miRNAs detectadas em cada amostra foi apresentada na Tabela 1.

Características dos pacientes da CE e controles saudáveis ​​em fase de validação

Na fase de validação, 39 pacientes com CE foram selecionados, 32 (82,1%) dos quais tinham carcinoma de células escamosas, 4 (10,3%), adenocarcinoma e 3 (7,7%) tinham carcinoma de pequenas células. estadiamento do câncer dos pacientes com CE foi a seguinte: 0 (0%) estavam em estágio I, 12 (30,8%) no estágio II, 11 (28,2%) no estádio III, 10 (23,6%) no estágio IV, e 6 não estavam disponíveis. Os dados referentes a pacientes da CE e controles saudáveis ​​é apresentada na Tabela 2. Todos os pacientes com EC foram 40 anos de idade, principalmente a partir de Chaoshan, província de Guangdong, informou beber ou comer em altas temperaturas, e bebedores de álcool, ea maioria eram fumantes do sexo masculino. De acordo com o modelo de regressão logística, as RUP de indivíduos Chaoshanese e beber ou comer em uma alta temperatura foram estatisticamente significativas (41,984 e 31,594, respectivamente).

poder discriminatório do saliva total e miRNAs saliva sobrenadante para CE

os níveis das 6 miRNAs alvo seleccionados (miR-10b *, miR-144, miR-21, miR-451, miR-486-5p e miR-634) de expressão foram validados por RT- qPCR utilizando ambas as amostras de saliva e sobrenadante saliva inteiras. 3 miRNAs (miR-10b *, miR-144 e miR-451) em saliva total do grupo CE foram significativamente upregulated (

p

= 0,001, 0,012 e 0,002, respectivamente; dobrável alterações, 58,7 , 45,6, e 42,4, respectivamente). Os outros 3 miRNAs (miR-21, miR-486-5p, e miR-634) não apresentaram diferenças significativas entre o grupo CE e o grupo saudável (

= 0,110, 0,078 e 0,157, respectivamente p). Curvas ROC foram estabelecidos para avaliar o poder discriminatório de toda saliva miR-10b *, miR-144 e miR-451; as AUC foram 0,762, 0,706 e 0,756, respectivamente. Um valor óptimo de corte é necessária para a curva ROC para definir o poder discriminatório. Quando o índice Younden (Younden index = sensibilidade + especificidade -1) atinge o valor máximo, o valor de corte correspondente será o valor ideal de corte [21].

Os valores de corte das 3 miRNAs saliva inteiros (miR -10b *, miR-144 e miR-451) foram determinadas como sendo 0,74530111, 0,78131771 e 0,79964271, respectivamente. Portanto, suas sensibilidades para detecção CE foram 89,7, 92,3 e 84,6% e as especificidades foram 57,9, 47,4 e 57,9%, respectivamente.

4 miRNAs (miR-10b *, miR-144, miR-21, e miR-451) foram significativamente upregulated em sobrenadantes grupo de saliva CE (

p

= 0,013, 0,036, 0,015 e 0,006, respectivamente; dobrável mudanças, 4.5, 6.7, 9.7 e 5.4, respectivamente; AUC, 0,702, 0,671, 0,698, e 0,725, respectivamente). Os outros dois miRNAs (miR-486-5p e miR-634) não apresentaram diferenças significativas entre o grupo CE e o grupo saudável (

p

= 0,211 e 0,524, respectivamente). Pelo cálculo do índice Younden, os valores de corte dos miRNAs sobrenadante 4 saliva (miR-10b *, miR-144, miR-21 e miR-451) foram determinados como sendo 1,05078691, 8,08243248, 0,88851054 e 8,48817219, respectivamente. Portanto, as suas sensibilidades para detecção de CE foram 79,5, 43,6, 89,7, e 51,3% e especificidades foram 57,9, 89,5, 47,4 e 84,2%, respectivamente.

Os dados brutos dos níveis de cada miRNAs alvo de expressão e as informações dos sujeitos da pesquisa em nosso estudo foram apresentados em dados S2. Os gráficos de barras de níveis de miARN salivares expressas de forma aberrante de expressão acima mencionados foram apresentados na Figura 2. As curvas ROC das miARNs expressas de forma aberrante foram apresentados na Figura 3.

A) toda a saliva miR-10b *. B) toda saliva miR-144. C) toda saliva miR-451. D) saliva sobrenadante miR-10b *. E) saliva sobrenadante miR-144. F) saliva sobrenadante miR-21. G) saliva sobrenadante de miR-451. Os níveis de expressão de miARN foram calculados pelo 2

-ΔΔCt método. Estes miRNAs foram significativamente upregulated na CE (n = 39) em comparação com o grupo saudável (n = 19).

A) Whole saliva miR-10b *. B) saliva total de miR-144, e C) toda a saliva de miR-451. D) saliva sobrenadante miR-10b *. E) saliva sobrenadante miR-144. F) saliva sobrenadante miR-21. G) saliva sobrenadante miR-451.

Comparação das AUC

Quanto maior a AUC, o aparentemente mais significativo o poder discriminatório. No entanto, para diagnosticar uma doença usando a mesma recolha de amostras, ele não é adequado para avaliar o poder discriminatório simplesmente comparando os valores da AUC [22], [23]. Para comparar com precisão diferentes AUC, foi utilizado o método de Delong com o software MedCalc, versão 12.2.1. 3 de saliva e 4 saliva sobrenadante inteiros miRNAs foram capazes de detectar CE. miR-10b *, miR-144 e miR-451 pode detectar tanto CE utilizando saliva completa e sobrenadante salivar. As AUC não revelou diferenças significativas entre toda saliva miR-10b * e saliva sobrenadante miR-10b *, toda saliva miR-144 e saliva sobrenadante miR-144, e saliva total miR-451 e saliva sobrenadante miR-451 (

p

= 0,3413, 0,7050, e 0,6867, respectivamente). Os poderes discriminatórios dos mesmos miRNAs na saliva todo e sobrenadante saliva não foram significativamente diferentes. Além disso, as AUC dos 3 miRNAs saliva inteiros (miR-10b *, miR-144 e miR-451) que pode detectar CE foram comparados entre os dois miRNAs. Os resultados também não apresentaram diferenças significativas [

p

= 0,2356 (miR-10b *

vs

. MiR-144), 0,8959 (miR-10b *

vs

. MiR -451) e 0,3248 (miR-144

vs

. miR-451)]. Finalmente, as AUC dos miRNAs sobrenadante 4 saliva (miR-10b *, miR-144, miR-21 e miR-451) que pode detectar CE foram comparados entre os dois miRNAs. Os resultados também não apresentaram diferenças significativas [

p

= 0,8251 (miR-10b *

vs

. MiR-21), 0,7699 (miR-10b *

vs

. MiR -451), 0,7102 (miR-10b *

vs

. miR-144), 0,6079 (miR-21

vs

. miR-451), 0,8729 (miR-21

vs

. miR-144) e 0,3529 (miR-144

vs

. miR-451)]. Em conclusão, os poderes discriminatórios de todos os miRNAs em todo ambos saliva e saliva sobrenadante foram semelhantes.

Correlação entre saliva total e os níveis de expressão sobrenadante saliva

amostras de saliva e sobrenadante saliva total foram coletadas de cada sujeito. De acordo com os resultados acima, o miR-10b *, miR-144 e miR-451 foram significativamente regulados positivamente em conjunto tanto saliva e saliva sobrenadante no grupo CE. teste de correlação de Spearman foi utilizado para avaliar correlações dos níveis destes 3 miRNAs entre saliva total e sobrenadante saliva de expressão. Os níveis destes 3 miARNs em toda a saliva e saliva sobrenadante de expressão mostrou correlações significativas [

p = 0,000

(miR-10b *), 0,035 (miR-144), e 0,003 (miR-451)].

as relações entre os níveis de expressão de miRNA e as características clínicas dos pacientes CE

os níveis de expressão de toda saliva miR-10b *, miR-144 e miR-451 e sobrenadante saliva miR-21, miR -10b *, miR-144 e miR-451 não foram influenciados pela idade, sexo, residência, os hábitos alimentares, tabagismo, consumo de álcool, tipo de patologia, estadiamento do câncer, a diferenciação câncer, ou metástase nodal de pacientes com CE (Tabela 3 .)

Discussão

miRNAs se dividem em duas categorias: celular e extracelular. Extracelular miARNs estão presentes no plasma ou outros fluidos corporais; Eles também são chamados miARNs secretoras. Vários estudos têm encontrado perfis de miRNA característicos do e estáveis ​​em fluidos corporais. miRNAs extracelulares podem ser moléculas de sinalização intercelular e transduct sinais intercelulares quando fluindo [24].

Os mecanismos de como miRNA entra fluidos corporais de células não são claras. Kaosuka

et al

. [25] descobriu que miRNA lançado a partir de células é regulada pela esfingomielinase neutra 2 (nSMase2). Quando ceramida aumenta nas células, nSMase2 promove a libertação de miARN. A inibição da nSMase2 por o inibidor químico GW4869 impede a libertação a partir de células de miARN.

RNase está presente no plasma, saliva, urina, e outros fluidos corporais. No entanto, vários estudos descobriram que miRNAs em fluidos corporais são estáveis ​​e podem resistir à degradação a temperaturas altas e baixas, em ácidos e bases fortes, e por RNase. Isto é provavelmente porque miARNs livres em fluidos corporais são envoltos por proteínas ou armazenados dentro de vesículas [26] – [28]

A saliva é um líquido complexo que compreende as secreções de maiores e menores glândulas salivares.. Existem 450 a 750 pequenas glândulas salivares acessórias situados na língua, mucosa bucal, e palato excluindo a parte anterior do palato duro e gengiva [29]. Existe também um grande suprimento de sangue para estas glândulas; Consequentemente, as moléculas presentes no plasma também estão presentes na saliva, tais como proteínas, ADN, ARN,

etc. Vários estudos têm relatado que as moléculas salivares pode detectar doenças orgânicas e sistêmicas orais e outros. Li

et al

. [30] relatou que mRNAs salivares de DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL-8 e IL-1 pode detectar câncer bucal mais accuately que pode mRNAs plasmáticos destes genes. Mbulaiteye

et al

. [31] descobriu que testes salivares poderia substituir exames de sangue para detectar a infecção pelo vírus EB. Além disso, salivar C-erbB-2 e CA153 proteínas poderia ser novos biomarcadores de câncer de mama [32] – [34].

Weber

et al

. [14] relatou os perfis de miRNA de 12 fluidos corporais e encontrou um máximo de 458 miRNAs na saliva. Patel

et al

. [35] verificaram que os níveis salivares de miARNs de expressão foram estáveis ​​e os níveis de miARN são reprodutíveis dentro de indivíduos. Parque

et al

. [15] avaliaram inteiros ambos saliva e sobrenadante saliva miRNAs em pacientes com câncer oral, e encontrou perfis de miRNA semelhantes. Eles também relataram que salivar miR-125a e miR-200a foram significativamente reprimidos e que tanto pode ser novos biomarcadores de câncer bucal

Por Agilent microarray, foram detectados os níveis de 923 miRNAs em 10 amostras de saliva inteiros de expressão.; 461 foram detectados. Os níveis de 25 miRNAs expressão mostrou diferenças significativas entre a CE e os grupos saudáveis. Usando a mesma tecnologia, Weber

et al

. [14] detectaram inteiros 458 miRNAs saliva de 5 indivíduos saudáveis. Após a validação por meio de RT-PCR, inteiros três miARNs saliva (miR-10b *, miR-144 e miR-451) e quatro miARNs saliva sobrenadante (miR-10b *, miR-144, o miR-451 e miR-21) foram significativamente upregulated em pacientes com CE. Com base no teste de correlação de Spearman, toda saliva e saliva sobrenadante miR-10b *, miR-144 e miR-451 mostrou correlações significativas. As diferenças em AUC não foram estatisticamente significativas. Isto sugere que os poderes discriminatórios de inteiros de saliva e sobrenadante saliva miRNAs foram semelhantes. No entanto, a maioria dos pacientes com CE quando admitido no hospital apresentava sintomas de dificuldade em engolir, regurgitação ou vómito, e sua saliva pode ter contido células esfoliadas CE regurgitados do esófago devido a obstrução esofágica pelo tumor. Portanto, se salivar testes miRNA é utilizado para rastrear CE em pacientes assintomáticos, saliva sobrenadante é uma escolha melhor, porque os componentes celulares foram removidos.

Biagioni F,

et al

[36] mostram que microRNA-10b * é um regulador mestre da proliferação de células do cancro da mama e é regulada negativamente em amostras tumorais contra homólogos peritumoural combinados, eles também sugere que a restauração de microRNA-10b * expressão pode ter a promessa terapêutica. Mas, em nosso estudo, miR-10b * foi regulada na saliva de pacientes da CE. Uma vez que a origem de circulação de miARNs actualmente não é claro, os seus níveis de expressão não são consistentes com miARNs teciduais ou celulares, por vezes. Por exemplo, Coulouarn

et al

[37] e Tsai

et al

[38] relatou que miR-122 foi reprimidos no tecido de câncer de fígado, mas Zen e Zhang [39] relatou que foi regulada positivamente no soro de pacientes com cancro do fígado. miR-10b * foi regulada na saliva de pacientes da CE, mas reprimidos no tecido do cancro da mama. A razão para isto pode estar relacionado com a expressão diferente de miR-10b * nos dois tipos diferentes de cancro. Além disso, pode ser também associada com a distribuição diferente entre tecidos e fluidos corporais. Rossing

et al

. [40] descobriram que miR-144 foi regulada negativamente em tecido de cancro da tiróide. Sureban

et al

. [41] relataram que a entrega à base de nanopartículas de siDCAMKL-1 aumentou microRNA-144 e o crescimento do tumor do câncer colorretal inibido através de um mecanismo dependente Notch-1-. Konishi

et al

. [42] relataram que o nível de plasma de miR-451 de expressão foi aumentado em doentes com cancro gástrico pré-operatório e pós-operatório diminuiu (AUC = 0,96). Assim, os dados sugerem que o plasma miR-451 possui excelente poder discriminatório para o câncer gástrico. Brenner

et al

. [43] descobriu que a regulação positiva de tecido miR-451 foi preditivo de mau prognóstico para pacientes com câncer gástrico. Em contraste, Bandres

et al

. [44] relataram que a regulação negativa de miR-451 em tecidos de cancro gástrico ou cólon previsto um mau prognóstico. Além disso, a sobre-expressão de miR-451 em células de cancro gástrico e colorectal reduziu a proliferação celular e aumento da sensibilidade a radioterapia. Assim, os dados sugerem que o miR-451 é um importante supressor de tumor miARN. Por último, mas não menos importante, Wang

et al

[45] relataram que a expressão regulada positivamente de miR-451 induziu apoptose e suprimiu a proliferação celular, invasão e metástase no esôfago EC9706 linha de células de carcinoma. Além disso, a injecção de miR-451 inibiu o crescimento tumoral num modelo de xenoenxerto de cancro do esófago.

miR-144 e miR-451 estão envolvidas na patogénese da isquemia e a manutenção da homeostase do miocárdio eritróide. Zhang

et al

. [46] relataram que os efeitos sinérgicos do cluster miR-144/451 GATA-4 mediada protegidos contra a isquemia simulada morte de cardiomiócitos /induzida por reperfusão. Wang

et al

.