Abstract

cancro do ovário

epitelial (EOC) é o mais letal de todos os cânceres ginecológicos, e engloba subtipos histológicos distintos que têm diferenças genéticas e tecidos de origem específicas. carcinoma de células claras do ovário (OCCC) representa aproximadamente 10% dos casos e que foi denominado um cancro sensível stress. OCCC é caracterizada pela expressão aumentada do stress oxidativo e de genes relacionados com a glicólise. No presente estudo, a hipótese de que profiling bioenergética pode distinguir exclusivamente OCCC de outros subtipos histológicos EOC. Utilizando um analisador de fluxo extracelular, linhas OCCC (ES-2, TOV-21-G) mostraram-se altamente metabolicamente activa, com elevada taxa de consumo de oxigénio (OCR) e elevada taxa de acidificação extracelular (ECAR), indicativa da fosforilação oxidativa mitocondrial aumentada e taxa glicolítica, respectivamente. Um perfil de elevado bioenergética foi associada com a capacidade das linhas celulares ‘para formar esferóides independentes de ancoragem. Dada a sua elevada actividade glicolítica e mitocondrial, células OCCC exibida forte sensibilidade para 2-desoxi-D-glucose e a inibição do crescimento rotenona, embora esse perfil quimiossensibilidade não era específico para apenas as células OCCC. profiling bioenergética também identificou uma linha não-OCCC celular, OVCA420, ter severamente comprometida a função mitocondrial, com base no baixo OCR e uma falta de estimulação da respiração máxima após a aplicação do FCCP desacoplador. Isto foi acompanhado por alterações na morfologia mitocondrial indicativos de fissão melhorada, aumento da expressão da proteína mitocondrial de fissão Drp1, uma perda do potencial de membrana mitocondrial e para a glicólise. Mais importante, esta perda da função mitocondrial foi acompanhada pela incapacidade de células OVCA420 para lidar com o stress hipóxico, e uma capacidade comprometida para estabilizar HIF-1α em resposta a 1% O

2 hipóxia. Este conhecimento pode ser imperativo para pesquisadores planejam utilizar esta linha de células para estudos do metabolismo e hipóxia, e sugere que alterou a dinâmica de fissão mitocondriais representa um fenótipo de uma subpopulação de EOCs

Citation:. Dier U, Shin DH , Hemachandra LPMP, Uusitalo LM, Hempel N (2014) Análise bioenergética de linhas celulares de cancro do ovário: Profiling de histológicos subtipos e identificação de uma linha de células mitocôndrias-defeituoso. PLoS ONE 9 (5): e98479. doi: 10.1371 /journal.pone.0098479

editor: Jianhua Zhang, da Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de janeiro de 2014; Aceito: 02 de maio de 2014; Publicado: 23 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Dier et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) conceder R00CA143229 do Instituto Nacional do Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário permanece um dos cancros mais mortais nas mulheres, com pouca melhora na sobrevida global relatado ao longo das últimas três décadas. Tornou-se aparente que o cancro do ovário é um termo amplo usado para uma série de doenças distintas, partilhando o mesmo local anatómico no interior da cavidade intraperitoneal (IP). Os cinco subtipos de cancro epitelial do ovário (EOC) diferem significativamente no seu tecido de origem, os marcadores genómicos e dependência de diferentes vias de células pró-tumorigénica de sinalização [1] – [3]. Alto grau de câncer de ovário seroso (SOC) é o subtipo histológico mais comum e caracteriza-se pela alta frequência em mutações do gene TP53, instabilidade genômica e como sendo de origem trompa de Falópio [3], [4]. carcinomas de células claras de ovário (OCCC) representam cerca de 10% dos casos EOC em populações ocidentais (até 25% em populações asiáticas) [5]. OCCCs parecem consistem de subpopulações heterogéneas que exibem vários graus de aberrações cromossômicas [6]. Os mais comuns são associados com o domínio AT-rico interagindo 1A contendo proteína (mutação ARID1A -50%) [7], [8] e da via PI3K (perda de PTEN ~ ​​40% [9], mutação PIK3CA [10]; AKT2 amplificação [5]). mutações ARID1A têm permitido aos pesquisadores associam lesões precoces OCCC com tecidos endometrióides e cistos de endometriose [8], [11].

Embora existam diferenças significativas na aberrações cromossômicas entre espécime OCCC individuais, Yamaguchi e seus colegas relataram recentemente uma assinatura de expressão do gene que está unicamente associado OCCC [12]. Em particular, este estudo reconfirmada outros relatórios que OCCC é caracterizado como um cancro de stress responsivo [12] – [14]. Alta expressão de enzimas antioxidantes e os genes associados com o metabolismo da glicose também são predominantes [12], [15]. Este perfil de expressão é pensado para representar adaptações de OCCC contra as agressões do microambiente tumoral, incluindo o estresse redox induzida livre de ferro e inflamação [16]. Algumas dessas mudanças de expressão são igualmente observadas em cistos endometriais, ainda sugerindo que este representa o tecido precursor do OCCC [12]

.

Enquanto os pacientes fase inicial OCCC geralmente têm uma taxa de sobrevivência melhor do que pacientes estágio SOC cedo, uma fase III e IV OCCC está associada a menor sobrevida. Além disso, menos de 10% de OCCC recorrente respondem à terapia e este subtipo histológico tem sido associada com elevado [5] cisplatina-resistência. Dado que existem diferenças significativas no genoma e expressão perfil OCCC comparação com SOC, existe uma necessidade de compreender os mecanismos moleculares que conduzem OCCC tumorigénese e progressão para adaptar terapêutica para este tipo histológico em particular. Dado que OCCCs são caracterizados por uma elevada expressão de mediadores da via glicolítica, o objectivo do presente estudo foi investigar se linhas celulares OCCC também diferem significativamente no seu perfil bioenergética em comparação com outras células EOC em cultura. Usando medições de células vivas de consumo de oxigênio ea acidificação extracelular, fomos capazes de estabelecer que linhas celulares OCCC são altamente metabólica. Além disso, esta análise revelou uma linha celular SOC com função mitocondrial com defeito, que se manifesta em uma perda de resposta hipóxica destas células.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares

OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13 e NOSE007 células foram generosamente fornecidos pelo Dr. Susan K. Murphy (Duke University) e cultivadas em RPMI1640 contendo soro fetal bovino a 10% (FBS). OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13 as células foram originalmente isoladas a partir de ascites de doentes do cancro do ovário [17], [18]. células NIHOVCAR3 (referido aqui como OVCAR3) e linhas claras de células de carcinoma de ovário ES-2 e da TOV-21-G foram adquiridos da ATCC. células ES-2 foram cultivadas em meio 5a de McCoy modificação com 10% de FBS. células TOV-21-G foram cultivadas numa mistura 01:01 de MCDB 105 contendo 1,5 g de bicarbonato de L /sódio e Meio 199 contendo 2,2 g /L de bicarbonato de sódio, com soro bovino fetal a 15%. células OVCAR3 foram mantidas em RPMI 1640, contendo 0,01 mg /ml de insulina bovina e 20% de FBS. Glutamina e privação de glicose foi realizada utilizando MP Biomedicals RPMI 1640, 1X Liq., W /o L-glutamina e glicose.

Análise Bioenergética de Consumo de Oxigênio Rate (OCR) e Extracelular A acidificação Rate (ECAR)

O Seahorse XF24

3 extracelular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA) foi utilizado para avaliar os fenótipos bioenergéticos de linhas celulares de cancro do ovário. O Extracelular Flux Analyzer permite a medição de células vivas simultânea da taxa de consumo de oxigênio (OCR), um indicador da respiração mitocondrial e taxa de acidificação extracelular (ECAR), um indicador de perda de protões net durante a glicólise. Antes do início da experiência, as células foram semeadas uniformemente (40.000 células /poço; seguintes optimização do número de sementeira de células) na placa de cultura celular XF24 e deixadas a aderir durante 24 horas. meios de cultura celular foi substituído com meio XF (cavalo marinho Bioscience), sem o bicarbonato de sódio e de FBS, depois da lavagem prévia com meios XF. As células foram colocadas em um não-CO

2 37 ° C incubadora durante 1 hora, antes do início da experiência. OCR e ECAR foi medida ao longo de um período de 3 minutos, seguido de 3 minutos de mistura e re-oxigenação dos meios de comunicação. Três medições taxa basal foram tiradas antes da injecção de manipuladores farmacológicas de proteínas da cadeia respiratória mitocondrial, também conhecido como o teste de stress mitocondrial. Vários parâmetros bioenergética pode ser deduzida através da monitorização do OCR em resposta a estes compostos [19]. Após o estabelecimento de uma leitura OCR basal, oligomicina A é aplicada para inibir prótons (H +) fluir através da ATP sintase, essencialmente, bloqueando todo o consumo de oxigênio ATP ligada. respiração máxima pode ser iniciada por células de cianeto de carbonilo-ptrifluoromethoxyphenyl hidrazona (FCCP) expondo, que é um ionóforo que transporta H + através da membrana mitocondrial levando ao colapso do potencial de membrana e o rápido consumo de O

2. Antimicina A impede a respiração mitocondrial, bloqueando complexo III (Ubiquinone: citocromo complexo b-c). inibição da ATPsintetase foi conseguida através da injecção de 1 uM oligomicina A (Sigma), que foi seguido por injecção de 750 nM de FCCP (Sigma) para a medição de OCR máxima. Isto foi seguido pela adição de 1 ^ M antimicina A (Sigma) para desligar todos respiração mitocondrial. Três medidas de OCR /ECAR foram obtidos após a injecção de cada concentrações de medicamentos e drogas otimizadas em linhas de células anteriores a experimentos. OCR e eCar leituras foram normalizados para os níveis de proteínas totais (ensaio de proteína BCA, Pierce) em cada poço. Cada linha de células foi representada em 5 poços por experiência e replicar experiências realizadas pelo menos três vezes. respiração basal foi obtido subtraindo-se a terceira leitura OCR, antimicina A seguinte disso, a partir da terceira leitura OCR basal. Estado respiratória aparente, uma indicação do estado respiratória mitocondrial, foi calculada usando: 4- (basal OCR-Oligo OCR) /(FCCP OCR-Oligo OCR) [20]. Antes do início destas experiências de dose das curvas de resposta (100 nM-3? M) foram realizadas para estabelecer a concentração de FCCP necessária para alcançar máxima OCR. Todas as linhas celulares responderam por atingir um patamar de OCR máxima a 750 nm FCCP, com inibição de OCR observada em 3? M em algumas linhas celulares (OVCA429, Ovca433, OVCAR3, ES-2). OVCA420 células não respondeu a FCCP a qualquer das concentrações testadas

em tempo real semi RT-PCR quantitativo

Na sequência do isolamento do RNA. (RNeasy Mini Kit; Qiagen) e transcrição reversa usando iScript cDNA Synthesis (BioRad), em tempo real semi-quantitativo de RT-PCR foi realizada em um Applied Biosystems 7500 real Time PCR reciclador, usando iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Os seguintes pares de iniciadores foram utilizados para análise em tempo real semi-quantitativo de RT-PCR: sentido HNF-1β: 5′-GCCCACACACCACTTACTTCG-3 ‘; HNF-1β anti-sentido, 5’-GTCCGTCAGGTAAGCAGGGAC-3 ‘[21]. GLUT-1 sentido 5’-CATCCTTATTGCCCAGGTGTTT-3 ‘; GLUT-1 anti-sentido 5’-GAAGACGACACTGAGCAGCAGA-3 ‘[22]. Os dados foram analisados ​​utilizando o método CT comparativo com os valores normalizados para p-actina níveis e expressa em relação aos níveis em células NOSE007.

Formação Spheroid Ensaio

linhas de células de cancro do ovário foram semeadas (1000 células /poço) em placas de 96 poços de fundo redondo de ultra-baixo de fixação (ULA) (Corning) e monitorizados para a formação de agregado esferóide até ao dia 9 em condições de cultura normais (meios totalmente suplementados, 37 ° C, 21% de O

2, 5 % de CO

2).

ensaios de viabilidade celular

números iguais de células foram semeadas em placas de 96 poços e a viabilidade celular em resposta a agentes quimioterapêuticos medida após 72 horas de tratamento com droga indicada doses. A viabilidade celular foi avaliada através da captação de violeta de cristal. Resumidamente, as células foram coradas com violeta de cristal durante 10 minutos, seguido por lavagem em PBS e H

2O. corante de violeta de cristal foi libertado a partir de células, utilizando 30% de ácido acético e a absorvância medida a 590 nm, utilizando um leitor de microplacas Molecular Devices SpectraMax Paradigm. A viabilidade celular foi expressa como percentagem de viabilidade relativamente a células não-tratadas. Cisplatina (cis-Diamineplatinum (II) dicloreto), paclitaxel e 2-desoxi-D-glucose (2-DG) foram adquiridos da Sigma. Rotenona foi obtido a partir do cavalo marinho Biosciences.

Mitotracker coloração

Células cultivadas em lamelas foram incubadas com 250 nM Mitotracker vermelho CMX ROS (Life Technologies) durante 15 minutos, seguido por lavagem em PBS e fixação com 4% de paraformaldeído. As amostras foram montadas em lâminas utilizando Prolong Ouro /DAPI (Life Technologies) e fotografada usando um eVOSfl AMG baseada em LED microscópio de fluorescência (100x objectiva de imersão em óleo).

mtDNA /nDNA relação em tempo real RT-PCR

para mitocôndrias quantificar ADN (mtDNA) e o DNA nuclear (DNAn) DNA total a partir de células de cancro do ovário foi extraído utilizando AllPrep ADN /ARN /proteína Mini Kit (Qiagen), que foi diluído até uma concentração final de 10 ng /ul. Para quantificar o mtDNA relação: proporção DNAn foram utilizados os seguintes iniciadores; do gene de ARNr 16S de mitocondrial (MT) de ADN (com sentido: 5′-CCAAACCCACTCCACCTTAC-3 ‘; anti-sentido: 5′-TCATCTTTCCCTTGCGGTA-3′); De rRNA 18S de (N) de ADN nuclear (sentido: 5’-AGAAACGGCTACCACATCCA-3 ‘, anti-sentido: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3’) [23], [24]. Os valores CT para mt16S n18S e foram obtidos seguindo PCR em tempo real de 50 ng de ADN total utilizando iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad), a uma temperatura de recozimento de 59 ° C.

Membrana Mitocondrial potencial

potencial de membrana mitocondrial foi medido usando um corante JC-(5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’-iodeto tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine; Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram incubadas com 10 ug /ml de corante JC-1 durante 15 min e de fluorescência imagens captadas usando uma objectiva de 20x. A razão de fluorescência vermelha de JC-1 e agregados verde de JC-1 foi medido utilizando monómeros imagem J, a seguir a correcção de fundo da imagem.

clonogenicidade

As células foram semeadas (100 células /cavidade) em um 6 placa bem e cultivadas por 10 dias sob condições de cultura normais (21% O

2) ou hipoxia (1% O

2, Biospherix câmara hipóxica). Clonogenicidade foi avaliada por coloração colônias com violeta cristal e número de colónias contadas usando o Image J e os dados expressos em fração de sobrevivência celular.

Immunoblotting

As linhas celulares foram cultivadas em placas de 10 cm a sub-confluência e lisadas em tampão RIPA (+ inibidores da protease), seguido por electroforese em 4-12% de gel SDS-PAGE (Bio-Rad). Após transferência Western, as membranas foram sondadas com o anticorpo primário anti-Drp1 (Millipore) ou GAPDH (Applied Biosystems-Life Technologies) durante a noite em 5% de leite magro /TBS, 0,1% Tween20. Seguintes borrões incubação do anticorpo secundário foram visualizadas utilizando substrato quimiluminescência Femto ou Pico (Thermo Scientific). Para a análise de HIF-1α, as células foram cultivadas sob condições hipóxicas (1% O

2) durante duas horas. As células foram imediatamente lisadas em tampão de amostra 2x e SDS a quantidades iguais carregados em SDS-PAGE (4-12%, Bio-Rad), seguido por transferência de Western e para imunotransferência HIF-1α e controlo de carga β-actina. anticorpo anti-HIF-1α foi comprado de BD Transduction Laboratories e anticorpos β-actina de Applied Biosystems-Life Technologies.

dados e análise estatística

Todos os dados apresentados são representativos de pelo menos três repetições experimentos. Imagem J foi utilizado para quantificar a fluorescência relativa e medir o tamanho da área de esferóide. Todos os dados são representados como média ± erro padrão da média. análise estatística dos dados (ANOVA com o teste de Tukey post, ou T-test) foi realizada utilizando GraphPad Prism Software (v6), e os dados considerados significativos para p . 0,05

Resultados

Perfil Respiratório de linhas celulares de cancro do ovário

para caracterizar o perfil bioenergética de linhas de células de cancro do ovário que utilizou um analisador de fluxo extracelular para determinar a taxa ao vivo de oxigênio celular consumo (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR; Seahorse Bioscience). Duas linhas de células OCCC, ES-2 e TOV-21-G foram comparados com as linhas não-OCCC EOC celulares (OVCA420, OVCA429, OVCA433, Dov-13, OVCAR3) e uma linha de células epiteliais normais da superfície do ovário (NOSE007).

a Figura 1A mostra o OCR de linhas celulares em resposta a compostos utilizados no teste de stress mitocondrial ao longo do tempo. Basal e leituras OCR dependentes de ATP indicou que a maioria das linhas celulares tumorais testadas, com a excepção de as células OVCA420, tinham significativamente mais elevada do OCR em comparação com uma linha celular epitelial da superfície do ovário normal (NOSE007, Figuras 1B C). A linha celular NOSE007 não foi escolhida como representante para o tecido de origem do cancro do ovário, uma vez que estes variam grandemente entre os subtipos histológicos, mas sim como um representante de uma linha de células epiteliais normais. Basais mitocondriais leituras OCR (Figura 1B) foram normalizadas pela subtracção não-mitocondrial OCR, que era baixo e não foi significativamente diferente entre as linhas de células testadas (não mostrado). A maior parte do basal mitocondrial OCR foi dedicado a ATP-produção, como indicado pela oligomicina A inibição (Figura 1C). Qualquer remanescente OCR pode ser um pouco atribuído ao vazamento de prótons através da membrana [19], que foi semelhante em todas as linhas celulares testadas, exceto TOV-21-G e Dov-13 células, que exibiu um ligeiro mas significativo aumento em comparação com NOSE007 e OVCA420 células (Figura 1D). Todas as linhas de células, exceto OVCA420 células respondeu a FCCP, aumentando a sua OCR da máxima taxas (Figura 1E). Assim, OVCA420 células não têm uma capacidade de reserva respiratória significativa, a diferença entre máxima e respiração basal (Figura 1F). capacidade de reserva respiratória alta também está ligada à alta fidelidade mitocondrial. Cálculos do Estado respiratória

aparente mostrou que as células epiteliais normais de ovário NOSE007 estão a operar a capacidade respiratória submáxima em comparação com as linhas celulares de cancro do ovário (Figura 1G). Verdadeiro estado respiração 4 é caracterizada por uma ausência de geração de ATP mitocondrial, como no caso de depleção de ADP, e imitada no nosso ensaio por oligomicina Uma adição. estado 3 mitocôndrias isoladas são caracterizados por uma actividade máxima na presença do substrato ADP ilimitada e [20]. Embora esses parâmetros nunca são plenamente alcançados no contexto de uma célula (celular Estado

Aparente é, portanto, considerado como 3,5), observou-se que as células cancerosas, exceto OVCA420s, exibido um estado aparente abaixo de 3,5, enquanto que o Estado

valores aparentes para células NOSE007 aproximou estado 4 (Figura 1G). Nenhum Estado

aparente poderia ser obtido para OVCA420 células devido a uma falta em resposta a FCCP.

A. Taxa de Consumo de Oxigénio (OCR) medições foram obtidas ao longo do tempo (min) utilizando um analisador de fluxo extracelular (cavalo marinho Bioscience). O teste de stress mitocondrial foi utilizado para obter os parâmetros bioenergética, através da adição do inibidor da ATP sintase A oligomicina A (S, 1 uM), para derivar OCR ATP-ligada, FCCP (M, 750 nM) para desacoplar a mitocôndria para OCR máxima, e antimicina A (A, 1 uM). B. basal mitocondrial OCR de linhas celulares de cancro do ovário foi obtido subtraindo-se não-mitocondrial OCR (OCR remanescente após antimicina A adição). OCR C. ATP-ligada foi calculado como a diferença entre basal e antimicina A inibiu OCR. D. OCR atribuída ao vazamento de prótons foi calculada como a diferença entre OCR seguinte oligomicina A inibição e OCR seguinte Antimicina A inibição. E. máxima OCR foi estimulada por FCCP disso. F. A reserva de capacidade respiratória foi calculada como a diferença entre a máxima e basal OCR. Gráficos BF representar os dados de um experimento replicadas (n = 5, ANOVA, de Tukey após o ensaio * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 estatisticamente significativa em comparação com NOSE007; # p 0,05, ## p 0.01, ### p 0,001, #### p 0,0001 estatisticamente significativa em comparação com OVCA420). linhas celulares OCCC são destacadas em preto e uma linha celular epitelial normal em branco. G. Média Estado respiratória

aparente foi calculado a partir de 3-4 experiências replicativas usando:. 4- (Basal OCR-Oligo OCR) /(FCCP OCR-Oligo OCR)

Enquanto todas as células cancerosas claramente tinha alta respiração mitocondrial em comparação com células NOSE007 não observamos uma diferença significativa nos parâmetros respiratórios entre as células OCCC e outras linhas de células de cancro do ovário, sugerindo que o perfil de consumo de oxigênio mitocondrial não diferencia câncer de ovário subtipos histológicos. No entanto, usando esta abordagem fomos capazes de identificar OVCA420 células como tendo a função mitocondrial defeituoso, indicado por baixo OCR basal e uma falta de resposta a FCCP.

células OCCC tem alta taxa de acidificação extracelular

simultânea de medir OCR, análise de fluxo extracelular permite a avaliação de taxa de acidificação extracelular (ECAR) de meios de cultura. Esta é considerada uma análise indirecta da taxa glicolítica de células [19]. OCCC linhas celulares ES-2 e TOV-21-L exibida alta ECAR basal, enquanto que outra linha celular tinha ECAR inferior, semelhante ao NOSE007 (Figura 2A). A oligomicina A foi usado para estimular ECAR máximo, que encerra dependente de ATP OCR, mudando efectivamente o metabolismo da fosforilação oxidativa a glicólise (Figura 2B). A diferença entre o máximo e ECAR basal é considerada a capacidade de reserva glicolítica de células (Figura 2C). OVCA420 células, que apresentou defeito respiração mitocondrial (Figura 1), também tiveram baixa capacidade de reserva glycolytic, indicando estas células estão operando perto de sua taxa glicolítica máxima como uma compensação pela perda de OCR. Isto sugere uma dependência de glicólise por OVCA420 células. A linha de células epiteliais normais NOSE007 exibido o menor reserva glicolítica, sugerindo que a sua capacidade de glicólise é menor do que a das outras linhas celulares de cancro.

. níveis basais eCar foram medidos utilizando um analisador de fluxo extracelular (Seahorse Bioscience). B. máxima ECAR foi estimulada por adição de 1 ^ M oligomicina A. C. Glicosidases Capacidade de reserva foi calculada como a diferença entre máximo e basal OCR. Dados a partir de um experimento replicativa é mostrado (n = 5, ANOVA, de Tukey após o ensaio * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 estatisticamente significativa em comparação com NOSE007; # p 0,05, ## p 0,01, ### p . 0.001 estatisticamente significativa em comparação com OVCA420)

bioenergética perfil

para obter uma melhor visão global do perfil da bioenergética de as linhas celulares de cancro do ovário estudados plotamos ECAR basal contra mitocondrial OCR (Figura 3A). Isto demonstrou claramente como as diferentes linhas de células se dividem em várias categorias bioenergética. Encontrámos 3 grupos distintos de perfis bioenergética celular. células OCCC TOV-21-G e ES-2 representam claramente células altamente energéticas com alto respiração e glicólise. células OVCAR3 semelhante exibido este padrão. OVCA433, OVCA429 e DOV-13 tinha um fenótipo mais aeróbico, enquanto NOSE007 e OVCA420 células foram as células menos energéticos, tanto com baixa OCR e ECAR. Deve notar-se que, ao contrário de OCR, as medições foram ECAR mais variável entre os dias experimentais, que foi particularmente evidente para OVCAR3 e linhas celulares DOV-13 (Figura 3A). Interessantemente, as células aeróbias mais OVCA433, OVCA429 e DOV-13 tinha uma reserva relativamente alta glicolítico, o que sugere que estas células são capazes de incrementar sua actividade glicolítica, quando necessário, como pode ser o caso sob condições hipóxicas (Figura 3B). As células ES-2 apresentou os menores capacidades de reserva, o que indica que esta linha celular pode estar operando perto de sua respiratórias máximas e capacidade glicolítica em condições de cultura normais (Figura 3B). Ao considerar ambos os parâmetros de OCR e eCar, nossos dados sugerem que as células OCCC são altamente energético, baseando-se tanto a fosforilação oxidativa e glicólise para satisfazer as suas necessidades energéticas. No entanto, os perfis respiratórios e glicolíticas pode não ser suficiente para diferenciar células OCCC de outros subtipos histológicos, como células OVCAR3 compartilham características semelhantes bioenergética.

A. Plotagem níveis Basal eCar e OCR fornece um snap-shot das bioenergética perfis das linhas de células de cancro do ovário estudados. OCCC linhas celulares ES-2 e TOV-21-L, bem como células OVCAR3 exibir alta glicólise e fosforilação oxidativa e, portanto, são classificados como células altamente energéticas. B. plotagem Glicosidases Reserve contra a reserva respiratória indica que algumas células parecem estar operando perto de sua taxa máxima, tais como as células ES-2, ao passo que outros têm alta reserva respiratória (NOSE007) ou alta glycolytic Reserve (DOV-13, OVCA429). linhas celulares OCCC são rotulados como triângulos pretos, outras linhas celulares de EOC como círculos cinzentos (OVCA420 como círculo com X), e as linhas de células epiteliais normais NOSE007 como um quadrado branco. Dados em A e C representa a média das médias leituras OCR e eCar 3-4 experimental replica formação C. Spheroid correlaciona-se com a assinatura bioenergética de células de cancro do ovário. As células foram cultivadas em placas e tamanho ULA (área de agregado esferóide em pixels) plotados (n = 6).

A capacidade de sobreviver como agregado esferóide independente de ancoragem desempenha um grande papel na rota transcoelomic de metástases do cancro do ovário, através da cavidade IP. Por conseguinte, verificou se um perfil de elevada bioenergética proporciona uma vantagem na formação de esferóides e sobrevivência. Interessantemente, as células altamente energéticos, ES-2, TOV-21-G e OVCAR3 foram capazes de formar e manter grandes agregados esferóides quando semeadas em superfícies de fixação ultra-baixo (Figura 3C). Enquanto esferóides OCCC continuaram a aumentar em tamanho, agregados OVCAR3 começou a desagregar no Dia 9. As células com um fenótipo mais aeróbica foram incapazes de formar esferóides (Dov-13) ou para manter agregados sob condições de crescimento independente de ancoragem para além do dia 4 (OVCA429 OVCA433). NOSE007 e OVCA420 foram capazes de formar muito pequenos agregados esferóides, que não aumentam de tamanho e começou a desintegrar-se após dias 4 e 9, respectivamente. Estes dados indicam que uma assinatura alta bioenergética (alta OCR e ECAR) pode ser associada com a capacidade para formar esferóides, potencialmente auxiliar anoikis-resistência e a proliferação celular independente de ancoragem.

Relação de bioenergética para Chemosensitivity perfis

Dada a identificação de diferentes bioenergética assinaturas no nosso conjunto de linhas celulares de cancro do ovário, nós quisemos explorar se este é preditiva de resposta linha de células de quimioterápicos. A cisplatina e paclitaxel são agentes habitualmente utilizados no tratamento do cancro do ovário. O desenvolvimento de resistência a cisplatina é uma característica comum de cancro do ovário e OCCC tem sido caracterizado como um subtipo histológico resistentes a cisplatina altamente. Por isso, foi surpreendente para ver uma forte diminuição da viabilidade celular em células ES-2 e TOV-21-G, em resposta a este composto (Figura 4A). OVCA429 e OVCA433 células teve a maior resposta ao paclitaxel, seguido por ES-2 e células TOV-21G (Figura 4B). No entanto, não havia um padrão claro associado com a cisplatina e paclitaxel sensibilidade e bioenergética fenótipo.

As células foram tratadas com doses indicadas para 72A. A cisplatina, paclitaxel B., C. 2 desoxiglucose (2-DG), D. resveratrol, E. metformina, F. rotenona, e G. O tratamento de combinação de dose baixa com rotenona (R; 0,1 mM) e 2-DG (2 milímetros). Dados a partir de um experimento replicativa é mostrado (n = 5-6, A-F: A ANOVA, de Tukey após o ensaio * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 significativamente menos a viabilidade celular em comparação com NOSE007 a mesma concentração de tratamento; L: o t-teste de Student, estatisticamente significativo em comparação com cada tratamento linha de células apenas com rotenona [* P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, *** * p 0,0001], ou 2-DG sozinho [# P 0,05, ## p 0.01, ### p 0,001, #### p 0,0001]). Os asteriscos destacam OVCA420 células, que têm a respiração mitocondrial defeituoso. H. Expressão de GLUT-1 e mensagem HNF-1β em células de cancro do ovário, tal como avaliado pelo tempo de semi-quantitativo de RT-PCR verdadeiro. Expressão foi correlacionada com os níveis em células NOSE007 (n = 3; ND = sem sinal mensurável detectada).

Dado o elevado nível de ECAR observada em células OCCC, não foi surpreendente que ES-2 e células TOV-21-G apresentaram maior resposta à glicolítica inibidor de 2-desoxi-D-glucose (2-DG; Figura 4C). células OVCAR3 foram mais resistentes a 2-DG, que pode ser suportado pela sua elevada variabilidade nas leituras ECAR (Figura 3A). células OVCAR3 também exibiu um pouco maior reserva respiratória do que as linhas de células OCCC (Figura 1-I), o que pode indicar que estas células são capazes de incrementar sua fosforilação oxidativa em resposta a glicólise shut-down com mais eficiência. manipuladores alternativos de glicólise, incluindo resveratrol e metformina, resultou em perfis de viabilidade celular semelhantes às obtidas por 2-DG (Figura 4D E). células OVCAR3 NOSE007, DOV-13 e foram geralmente mais resistentes a estes compostos. Como esperado, OVCA420 células foram sensíveis à inibição da glicólise por 2-DG, resveratrol e Metformina, mas isto não foi marcadamente diferente da OVCA429 ou OVCA433 células.

em comparação com células NOSE007, OVCA429, OVCA433, e a célula OCCC linhas ES-2 e células TOV-21-G tiveram uma redução significativa na viabilidade celular em resposta ao inibidor mitocondrial rotenona (Figura 4F). Isto pode ser relacionado com a sua elevada dependência da respiração mitocondrial, o que é particularmente evidente para OVCA429 e OVCA433 células. NOSE007 e células DOV13, que tinha um perfil global inferior OCR foram menos sensíveis à inibição por mitocondrial rotenona a uma dose de 1 uM. Curiosamente, este padrão de sensibilidade rotenona paralelo que de paclitaxel (Figura 4B), sugerindo que o paclitaxel poderá ter uma actividade mais forte em células com respiração mitocondrial aumentada. Além mediar efeitos dependentes de microtúbulos, o paclitaxel tem sido mostrado para provocar os seus efeitos apoptóticos

através

as mitocôndrias [25] – [27]. A necessidade de mitocôndrias funcionais em provocar toxicidade Paclitaxel também foi destacada pela falta de OVCA420 resposta a este composto. As células com um aumento da sensibilidade para 2-DG, foram mais eficazmente alvo de tratamento de combinação de uma dose baixa de 2-DG (2 mM) e rotenona (100 nM), com maior morte observada em em OVCA420, OVCA429, OVCA433 e as duas linhas de células OCCC ES-2 e TOV-21-G (Figura 4G).