Abstract

Fundo

fibroblastos associados ao câncer, composta por fibroblastos ou miofibroblastos activados, são encontrados no estroma circundante tumores sólidos. Estes miofibroblastos promover a invasão e metástases de células cancerosas. Os mecanismos que regulam a activação dos fibroblastos e o início de tumorigénese invasiva são de grande interesse. A sobre-regulação da proteína do citoesqueleto, palladin, foi detectada nos miofibroblastos do estroma que rodeiam muitos cancros sólidos e em telas de expressão de genes envolvidos na invasão. Usando um modelo de cancro pancreático, investigamos a conseqüência funcional da superexpressão de palladin exógena em fibroblastos normais

in vitro

e seu efeito sobre os estágios iniciais de invasão tumoral.

PRINCIPAIS CONCLUSÕES

expressão Palladin em fibroblastos do estroma ocorre muito cedo na tumorigênese.

In vivo

, expressão concordantes de palladin eo marcador de miofibroblastos, alfa actina de músculo liso (α-SMA), ocorre no início nas fases displásicas em estroma peri-tumoral e aumenta progressivamente em tumorigênese pancreático.

In vitro

introdução exógena de 90 kD palladin em fibroblastos dérmicos humanos normais (HDFs) induz a activação de fibroblastos do estroma em miofibroblastos, tal como indicada pela indução de α-SMA e vimentina, e através da mudança física da morfologia celular. Além disso, a expressão palladin nos fibroblastos aumenta a migração celular, invasão através da matriz extracelular, e criação de túneis através do qual as células cancerosas pode seguir. A invasão de fibroblastos e a criação de túneis resulta do desenvolvimento de protuberâncias celulares invadopodia semelhante que expressam proteínas invadopodia e enzimas proteolíticas. expressão palladin em fibroblastos é acionado pelo co-cultura de fibroblastos normais com K-ras-expressando células epiteliais.

Conclusões

No geral, a expressão palladin pode conferir propriedades miofibroblastos, por sua vez, promover a invasiva potencial dessas células tumorais com peri-degradação-driven invadopodia de matriz extracelular. palladin expressão em fibroblastos pode ser desencadeada pela expressão K-ras em células epiteliais adjacentes. Estes dados apoiam um modelo em que os fibroblastos ativados por Palladin facilitar a metástase dependente do estroma e crescimento do epitélio tumorigênico

Citation:. Brentnall TA, Lai LA, Coleman J, Bronner MP, Pan S, Chen R (2012) Excitação of Cancer-Associated Stroma: a superexpressão de Palladin ativa os fibroblastos para Promover a invasão tumoral. PLoS ONE 7 (1): e30219. doi: 10.1371 /journal.pone.0030219

editor: Donald Gullberg, da Universidade de Bergen, Noruega |

Recebido: 22 Março, 2011; Aceite: 15 de dezembro de 2011; Publicado: January 23, 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Brentnall et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Gene e Mary Fundo Walters Ann para a Investigação do cancro do pâncreas (TAB), a Fundação Canárias (TAB), e NIH NCI 5K07 CA116296 (RC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os fibroblastos têm um papel essencial na invasão do cancro, metástase, e quimiorresistência [1] – [7]. fibroblastos associados ao câncer são miofibroblastos com propriedades contráteis e actina de músculo liso (α-SMA) coloração é uma característica marcante dessas células [8]. O mecanismo pelo qual miofibroblastos melhorar tumorigênese é sublinhada por três estudos fundamentais que revelam: 1) fibroblastos associados ao câncer Chaperone as células cancerosas a partir do site principal para o nicho metastático 2) bloqueando os fibroblastos activados

antes

iniciados invasão tumoral pode prevenir o câncer; mas parando os miofibroblastos após a invasão começou muito tarde para prevenir o câncer e 3) tratamento terapêutico de câncer pancreático que reduz os fibroblastos associados ao câncer é mais eficaz em prolongar a sobrevivência do que a quimioterapia padrão que tem como alvo apenas as células cancerosas [9] – [11 ].

O 90 kD isoforma de palladin, uma proteína do citoesqueleto embrionário e vital para a motilidade celular, é sobre-expressa nos fibroblastos associadas a cancro de uma multiplicidade de tipos de tumor, incluindo pâncreas, mama, pulmão, rim, ovário e mas é expressa em níveis mais baixos em fibroblastos do estroma normais [12] – [15]. palladin fibroblastos que expressam também se encontram adjacentes às células cancerosas no nódulo linfático e metástases no fígado [12]. A desregulação da palladin a partir de células cultivadas em resultados aberrante organização da actina, a adesão celular desregulado e motilidade, e perturbações da morfologia celular bruto [16] – [20]. Não surpreendentemente, palladin foi detectado em telas de expressão para genes específicos de invasão em pâncreas e câncer de mama [21], [22].

Uma associação interessante entre fibroblastos e palladin associados ao câncer no cenário de câncer pancreático veio à luz. Nós relatamos uma forma altamente penetrante, rara de câncer pancreático familial (Familiar X) que é causada por uma mutação em uma região altamente conservada de 90 kD palladin. Esta mutação induz alterações do citoesqueleto e aumenta a migração quando transfectado em células que normalmente expressam quantidades mínimas de a isoforma de 90 kD palladin [19]. Foi intrigante descobrir que a proteína palladin é sobre-expresso preferencialmente e universalmente no compartimento estromal de câncer pancreático, em vez de células epiteliais ductais [12], [23].

O papel fundamental da palladin na motilidade celular e a consciência crescente de que activado fibroblastos pode realmente parceria com células cancerosas para promover a invasão e metástase levou a essas investigações. Aqui, usando o cancro do pâncreas como um modelo, nós desvendar 1)

quando

na progressão neoplásica faz palladin ativar fibroblastos, 2) a

mecanismo

subjacente a transição do fibroblasto normal em uma miofibroblastos ativados em a definição de câncer e 3)

como in the miofibroblastos poderia ajudar as células cancerosas para escapar. Além disso, nós também explorou os efeitos de uma herdada mutado 90 kD palladin nos fibroblastos de uma linhagem predispostos ao câncer de pâncreas (Familiar X ou FX). Poderia um mutante-Palladin fibroblastos estromais iniciar o câncer?

Resultados

expressão Palladin em fibroblastos associados ao tumor ocorre no início da progressão neoplásica e co-localiza com α-SMA no câncer humano

pancreático

imuno-histoquímica (IHC) coloração do marcador de miofibroblastos, α-SMA, e 90 kD palladin foram realizados concomitantemente em blocos de microarrays de tecido humano contendo todas as fases histológicos de cancro pancreático humano, incluindo lesões pré-cancerosas (Figura 1). pâncreas normal faltava de 90 kD a expressão da proteína palladin excepto no revestimento das células endoteliais. Em contraste, 90 kD aumentou com a expressão palladin progressão neoplásica nas lesões displásicas pré-cancerosas e a característica mais marcante foi a de que a coloração palladin foi limitada aos fibroblastos imediatamente adjacentes às células ductais displásicas (Figura 1). No câncer de pâncreas, difusa e forte expressão palladin foi observada em todo o estroma, em particular na área em torno das células de adenocarcinoma, de acordo com por relatórios anteriores [12], [23]. Expressão de α-SMA no estroma cancro paralelo estreitamente ao da palladin como relatado anteriormente em carcinoma de células renais [15]. A co-expressão de α-SMA e palladin nos fibroblastos que rodeiam as lesões pré-cancerosas sugere que o fenótipo de miofibroblastos é activada no início de progressão neoplásica e torna-se mais generalizada em cancro

.

A) Expressão de palladin e α- SMA foi examinada através de coloração IHC em espécimes pâncreas. Esquerda: há pouca ou nenhuma coloração no pâncreas normal. Médio: expressão aumentos nos fibroblastos peri-tumoral de displasia de pâncreas ou PanIN 2. Direito: expressão é mais alto e mais difundida nos fibroblastos cercam o câncer de pâncreas. B) leituras semi-quantitativos fornecer pontos de IHC para coloração tissue microarray do normal (NL), displasia de baixo grau (pancreáticas intraepiteliais 2), displasia de alto grau (PanIN 3) e câncer (CA) por palladin e α-SMA. Coloração de palladin ou α-SMA foi pontuado como 0 a 4. Veja também Tabela S1.

Palladin up-regula α-SMA e ativa fibroblastos para se tornar miofibroblastos

Com base na a expressão da proteína de palladin e α-SMA nos fibroblastos peri-tumoral, buscou-se desvendar a relação entre essas proteínas. Palladin é marcadamente regulado para cima durante a transição após o tratamento de fibroblastos-a-miofibroblastos com TGF-β1 [4] como é ácido a-SMA [3]. Em células de músculo liso vascular, expressão palladin é necessário para α-SMA upregulation [24], [25]. Nós quisemos saber qual o efeito regulamentar estas duas proteínas associadas a miofibroblastos poderia ter sobre o outro eo fenótipo de miofibroblastos (ver dados abaixo). Transfecção de 90 kD isoforma de tipo selvagem (WT) ou P239S mutantes (FX) palladin em fibroblastos dérmicos humanos normais (HDFS) up-regula marcadores de miofibroblastos, α-SMA e vimentina, e é suficiente para desencadear uma miofibroblastos fenótipo seguinte palladin indução. Ao dia 5 pós-transfecção palladin, α-SMA é significativamente elevada (27,4% ± 2,8%) e ainda mais aumentada por dia 9 (79% ± 15,7%) (Figura 2). A transfecção de palladin também resultou na supra-regulação de proteínas contrácteis 11 miofibroblastos relatados por Malstrom et ai. [26] (incluindo cofilina, vimentina, profilin, caldesmona, tropomiosina, alfa enolase, actina beta, tubulina, Rho GTP dissociação inibidor 1, calponina e peptidil-prolil cis-trans isomerase A). Esta análise proteômica é discutido em maior detalhe mais tarde.

células A) HDF transfectadas com 90 kD palladin (WT ou FX) ou vector vazio (EV) foram examinados para os marcadores de miofibroblastos a-SMA e vimentina via IF. Vermelho = α-SMA ou vimentina; Azul = DAPI. B) células HDF foram tratados como acima descrito em (A) e a expressão de α-SMA foi analisado por RT-PCR. O ARN foi colhido no número de dias indicados após a transfecção. C) A expressão da α-SMA foi analisado por RT-PCR. GAPDH foi usada como um controlo de carga interno e a expressão relativa de cada amostra contra TGF-p1 amostras tratadas foram representados graficamente como a indução de dobragem ± DP.

Palladin fibroblastos activados desenvolver um fenótipo de miofibroblastos

Introdução de 90 kD palladin (WT ou FX) em células HDF (subsequentemente referidas como HDF-WT ou HDF-FX) resultou em alterações na morfologia celular (Figura 3A). Sob condições normais de crescimento (com meio completo), fibroblastos que expressam Palladin demonstraram uma diminuição da área da célula, e um aumento em saliências celulares finas com apêndices de pico semelhante em comparação com as células de controlo parental. alterações do citoesqueleto incluídos tanto o alongamento e espessamento /agregação de fibras de stress de actina (Figura 3A). saliências celulares finos com apêndices spike-like são visíveis por microscopia eletrônica nos fibroblastos expressando Palladin (Figura 3B). Porque muitos cancros formar em um ambiente inflamatório, e porque o câncer é considerado a ferida que não cicatriza [27], que também analisou os fibroblastos expressando Palladin após incubação em ferindo mídias (meios condicionados a partir de fibroblastos que foram feridos com uma ponta de pipeta ) para determinar se mais alterações foram notáveis ​​(Figura 3A). As alterações morfológicas foram marcadamente melhorada em comparação com os fibroblastos de controlo vazio do vector (Figura 3C). As células desenvolveram uma mais fusiforme ou forma mesenquimais com saliências finas e longas, em comparação com os fibroblastos controle empty-vector (Figura 3C).

A) HDF transfectadas com WT-palladin (WT) ou FX-palladin (FX) foram comparados com vector vazio (EV), utilizando, se a análise de células phalloidin manchado cultivadas em meios completos ou mídias ferindo. B) faloidina-manchado protrusão células HDF-WT foi ampliada por micrografia do elétron (

inserir

). C) HDF foram tratados como acima descrito em (A) e cultivadas em meios ferindo. células coradas phalloidin foram analisados ​​por IF. Parcelas ilustrar a área de superfície relativa de células (

topo

) e comprimento médio de saliências (

parte inferior

). Os dados são representativos de duas experiências independentes; Os valores são expressos como a média ± SEM. (T-teste, *, valor de p 0,05; ** Valor de p 0,01).

Palladin expressando fibroblastos mais um gatilho estimulante realça o comportamento invasivo e migratória

a seguir, perguntou se 90 kD expressão palladin afetaria a migração e /ou capacidade invasiva de fibroblastos. A migração foi testada utilizando um sistema Transwell, onde as células podem atravessar directamente através dos poros de uma câmara superior para uma câmara inferior. Invasão foi testada utilizando um Transwell revestidas com Matrigel. Os resultados do ensaio foram comparadas para incubação com meio completo, ferindo media (meio condicionado recolhido a partir de células confluentes HDF feridos manualmente com uma ponta de pipeta), ou meios condicionados a partir Panc-1 células epiteliais. Estudos anteriores têm demonstrado que a exposição das células a meios ferindo, aumenta a taxa de migração de células epiteliais [28]. De acordo com estudos recentes que mostram os efeitos anti-migratórias de expressão palladin em células de cancro da mama [29], na ausência de um sinal de ferimento, os fibroblastos Palladin-activado não têm reforçado a migração ou invasão. No entanto, um sinal de ferida aumentou dramaticamente a migração e a capacidade invasiva de fibroblastos activados por Palladin (WT e FX) comparado com o controlo vector vazio (HDF-EV) (Figuras 4A 4B). Embora o factor de crescimento epidérmico (EGF) teve um resultado semelhante nas células como meios de feridas (dados não mostrados), a incubação com o meio condicionado a partir de células de cancro do pâncreas (Panc-1) não aumentar a capacidade de invasão de células Palladin-expressando (Figura 4B) .

a) Migração através de um Transwell foi comparado por HDF transfectadas com vector vazio (EV), WT-palladin (WT), FX-palladin (FX), quando expostos à mídia completas normais ou mídia ferindo. Os dados mostrados são média ± SEM representativo de três experiências independentes. (T-teste, *, p-valor 0,05) B) Invasão através de um Transwell coberto-matrigel foi comparada para as células HDF tratadas como acima descrito em (A), quando exposto a completar meios, meios ferindo, ou meio condicionado de Panc-1 células. Os dados mostrados são média ± SEM representativo de três experiências independentes. (T-teste, **, p-valor 0,01); c) As células HDF foram transfectadas como descrito acima em (A) e plaqueadas em lamelas de cobertura revestidas com gelatina vermelho do Texas marcado. Imagens representativas tomadas via IF são mostrados. DAPI (azul) foi usada para visualizar os núcleos. Os lisados ​​D) de proteína a partir de células HDF transfectadas como descrito acima em (A) foram testados quanto à actividade de RhoA. Cada amostra foi executado em triplicado em duas experiências independentes. As barras de erro indicam SD. (T-teste, **, p-valor 0,01) E) Ensaio de Proliferação de células HDF transfectadas como descrito acima em (A). Os dados indicam significa ± SD para três poços independentes.

Para verificar se células que expressam Palladin eram capazes de degradar a matriz extracelular, HDF-EV, HDF-WT, e HDF-FX foram cultivadas em lamelas revestidas com gelatina fluorescentemente marcado. Na presença de meios ferindo, pacotes de gelatina foi observada e a superfície da gelatina foi destruída pelas células HDF-FX-WT ou HDF-expressando Palladin, mas não o normal, parental HDF-EV (Figura 4C). Estas alterações destrutivas são muito mais dramática e difundida do que seria normalmente esperado apenas com invadopodia. Nós se perguntou se os miofibroblastos induzida por Palladin tinha melhorado contratilidade que poderia causar um “ripagem” da matriz. Para responder a isto, foi investigado se RhoA, uma proteína envolvida no movimento do citoesqueleto e remodelação [30], foi activada nas células que expressam Palladin e descobriram que os níveis foram aumentados RhoA quase duas vezes (Figura 4D). Isto sugere que a expressão palladin exógeno promove a capacidade de miofibroblastos para ambos invadir e destruir matriz extracelular (Figura 4C). Os efeitos invasivos de ferindo meios de comunicação e de EGF sobre os fibroblastos que expressam Palladin não foram devidos a uma diferença na taxa de proliferação (Figura 4E).

investigadores anteriores sugeriram que os fibroblastos associados a tumores pode levar as células cancerosas através da matriz extracelular [31]. Nós questionaram se os fibroblastos ativados por Palladin poderia caber esse paradigma. Para examinar esta hipótese, foram realizados ensaios de invasão 3D usando lâminas desenvolvidas por Bellbrook Labs (Figura 5A). Dois poços circulares foram ligados por um canal central, em frente de 1 mm x 1,8 mm. O canal estava cheio matrigel fluorescente diluído; EGF foi adicionado ao poço de um lado do canal como um atractivo e HDF ou HDF palladin-activados foram carregados para dentro do poço oposto. invasão celular dentro do canal preenchido-matrigel foi avaliada em intervalos de 12 horas como fibroblastos movido para o atractor. De acordo com os nossos ensaios de invasão transpo�, fibroblastos Palladin-activado invadiu os canais de forma mais rápida e migraram através do canal em um número significativamente maior número do que os fibroblastos de controlo (Figura 5B). Mesmo com tempo prolongado, nenhuma das células HDF sem palladin foram capazes de atravessar o canal. Em contraste, os fibroblastos activados por Palladin cruzado completamente o canal de um milímetro por 72 horas, a criação de túneis que foram utilizados por outros fibroblastos activados que se seguiram para trás. Os túneis negro criado pelos fibroblastos activados por Palladin são claramente visto no canal fluorescente vermelho da câmara de invasão 3D (Figura 5C). Além da grande encapsulamento criado pelos fibroblastos activados por Palladin para com o atraente, as células contendo Palladin parecia ter movimento direccional melhor para o atractor de EGF do que as células de controlo (Figura 5B); este último frequentemente circulou de volta ao poço casa, onde eles começaram.

A) esquemática do ensaio de 3-D invasão mostrando Texas Red marcado gelatina mistura /matrigel no canal com 5 ng /ml EGF como um atrativo na porto e células esquerdo (HDF ± palladin marcado com Qtracker 585 com ou sem Panc-1 marcada com QTracker655) semeado na porta direita. movimento celular foi avaliada como células atravessado o canal (direito de movimento direcional para a esquerda), utilizando microscopia confocal. B) fibroblastos Palladin-ativado (verde) invadem mais para dentro do canal de matrigel vermelho em todos os tempos testados (24 e 72 horas)

(painéis da direita)

comparação com HDF com EV

(painéis da esquerda)

. Imagens representativas tiradas com microscopia confocal são mostrados. As barras indicam a 100 uM. C) A região em caixa amarelo é mostrado em maior ampliação para a direita.

topo

, matrigel Red é uniforme no canal vazio antes da invasão.

média

, fibroblastos Palladin-ativados (emissão de fluorescência verde) criado túneis negros (desprovidos de sinal de Texas Red, ver seta) dentro da matriz.

inferior

, fibroblastos (mancha phalloidin branco) pode mover-se em fila indiana através dos túneis. São mostradas imagens representativas tiradas com microscopia confocal. As barras indicam a 50 uM. D) células Panc-1 (rosa, ver setas) siga fibroblastos Palladin-activado (branco) através do canal, enquanto eles não seguem o HDF-EV. Mostram-se imagens representativas obtidas com microscopia confocal após 72 horas de co-cultura. Canais foram fixadas e coradas com DAPI.

células Panc-1 foram adicionados um dia após os fibroblastos para avaliar se estas células epiteliais fariam uso de túneis previamente criadas pelos fibroblastos invasores. Na verdade, fomos capazes de identificar as células Panc-1 seguinte as células de fibroblastos activados por Palladin através dos túneis (Figura 5D). fibroblastos palladin ativados teve uma influência direta sobre o comportamento ea aparência dos Panc-1 células epiteliais de câncer pancreático. Após co-cultura de células Panc-1 e fibroblastos activados-Palladin no poço casa dos slides 3D-invasão, as células cancerosas Panc-1 migrou a distância- muito mais algum cruzar completamente a CANAL enquanto o controle palladin-livre co culturas a revelou as células Panc-1 mal deixando a casa bem. Além disso, na presença de fibroblastos activados por Palladin, as células Panc-1 desenvolveu uma aparência alongada (Figura 5D).

Palladin promove a invasão por meio do desenvolvimento de invadopodia preenchido com enzimas destruidoras da matriz

p> Para desvendar o mecanismo subjacente a capacidade invasiva dos fibroblastos que expressam Palladin, examinamos os “pés” dos fibroblastos ativados por Palladin, que se tornaram mais proeminentes com a transição em miofibroblastos (Figura 3B). HDF, transfectada com e sem palladin, foram plaqueadas em transwells Matrigel-revestidas. Embora o tamanho de poro do Transwell era demasiado pequeno para uma célula inteira de passar, que pode acomodar as podosomes, que tinham de primeiro penetrar na camada de Matrigel (Figura 6A). Os invadopodia /podosomes que invadiram através dos poros coberto-matriz foram cortadas a partir do corpo da célula com uma navalha. proteomic análise quantitativa marcado foi utilizado para comparar as proteínas nos “pés” de fibroblastos que expressam Palladin relativos aos “pés” de os fibroblastos normais parentais. proteomic análise revelou que mais de 200 proteínas foram desregulado por ≥1.5 vezes nos “pés” de fibroblastos que expressam Palladin relação aos das células de controlo marcadas. Estas proteínas desregulados incluindo proteínas invadopodia [30], [32], [33], relacionado com ras e proteínas de ligação GTP e enzimas proteolíticas, (proteínas seleccionadas, veja a Figura 6B; para a lista completa, consulte a Tabela S2). Estamos particularmente interessados ​​em proteínas invadopodia, incluindo cortactina, filamina A, beta-integrina 1, vinculin, profilin, alfa-actinina e cofilina [32], [33]. Quase metade das proteínas-regulada identificados em nossa análise proteômica foram recentemente relatados como componentes invadopodia novos [34].

A) A parte inferior a 3 mm transpoço mostra podosomes /invadopodia de um fibroblasto HDF-WT que invadiu através do matrigel via IF. Os “pés” foram cortados com uma lâmina para análise proteômica. células B) HDF transfectadas com vector GFP-vazio (EV) ou palladin (WT) GFP-tipo selvagem foram examinados com coloração phalloidin via IF. fibroblastos palladin expressam tem protuberâncias lineares (

setas

) cheios de proteases e lisozimas, tais como catepsina D. mostradas são imagens representativas. C) Análise Proteomic dos “pés” revela a sobre-expressão de enzimas proteoliticas, proteínas de activação Rho, e verifica a presença de proteínas previamente identificadas em invadopodia. São mostrados os índices de proteína a partir de fibroblastos com WT ou FX palladin em relação ao vector vazio. Veja também Tabela S2. células D) HDF transfectadas com palladin tipo selvagem foram cultivadas em matrigel coberta lamelas. faixas degradadas erosivos foram detectados através de microscopia eletrônica. Bar indica 1 um.

análise proteômica quantitativa revelou aumento da regulação da proteína, a alfa-actinina de ligação palladin que é outra proteína relacionada com invadopodia que tem sido associada com mau prognóstico no ovário e pâncreas [ ,,,0],35], [36]. O aumento marcado da alfa-actinina no estroma do cancro do pâncreas e cancro de pré-validado por IHC (Figura S1). Validação do aumento da expressão de proteínas invadopodia seleccionado -cofilin, cortactina, e pela análise proteómica detectado-profilina foi realizada por imunofluorescência e /ou análise de transferência de Western (Figura S2).

Além das proteínas invadopodia, proteolítica enzimas também foram up-regulada nos “pés” de fibroblastos Palladin expressando incluindo ADAM22, aminopeptidases e catepsina D e B (Figura 6C). coloração de imunofluorescência da catepsina D, confirmou que a proteína é selectivamente sobre-expresso nas células WT-FX e HDF, mas não nos fibroblastos parentais com vector vazio (Figura 6C). Curiosamente, a catepsina D tem sido mostrado que estimula a invasão e crescimento de fibroblastos e é declaradamente envolvidos em interacções entre parácrinos epitélio do tumor e fibroblastos [37]. Para além da expressão de enzimas proteolíticas e proteínas de matriz de remodelação, destruição de Matrigel pelas células HDF-WT-expressando Palladin é evidente por microscopia electrónica (Figura 6D).

Palladin é sobre-regulada em fibroblastos pela adjacentes K-ras activado células epiteliais

Palladin geralmente não é mutado no cancro pancreático esporádica (dados não apresentados) ou em cancros pancreáticos familiares, outros do que a família X [38] – [41]. No entanto, a expressão da 90 kD palladin foi avaliado nos fibroblastos que rodeavam displásico pâncreas ou células ductais cancerosas em 96% de cancros do pâncreas, enquanto que os fibroblastos que envolvem as células ductais normais não [12], [23] (Figura 1). Colocámos a hipótese de que a sinalização parácrina entre as células epiteliais e fibroblastos cancerosas foi provavelmente responsável pelo aumento da regulação da expressão palladin nos fibroblastos, eventualmente, transformando-os em miofibroblastos associados a tumores. Para testar esta hipótese, os fibroblastos humanos normais foram co-cultivadas em um transwell com células imortalizadas normais do pâncreas (células ductais HPDE) e com linhas de células de cancro do ducto pancreático que têm mutações K-ras (MiaPaCa e Panc-1). Ao dia 5 de co-cultura, palladin foi regulada nos fibroblastos adjacentes a ambas as linhas de células ductais do cancro do pâncreas (Figura 7A). Por comparação, os fibroblastos normais que estavam adjacentes às células do ducto pancreático normais não expressaram palladin (Figura 7B).

A) As células HDF foram examinados para a expressão palladin através Se, após a co-cultura com linhas de células de cancro do pâncreas, MiaPaCa ou Panc-1, durante 7 dias. TGF-p1 é mostrado como um controlo positivo para cima-regulação palladin em fibroblastos normais, não há células epiteliais é o controlo negativo. As barras de escala indicam 20 jim. B) células HDF foram examinados para α-SMA ou expressão palladin através Se, após a co-cultura com as células normais epiteliais do ducto pancreático (HPDE) que foram falsamente transfectadas ou transfectadas com o tipo selvagem ou K-ras mutante. Barras de escala indicam 20 jim.

Em seguida, perguntou o que o sinal era de que as células cancerosas que up-regulam palladin em fibroblastos adjacentes? À luz dos nossos dados que mostram o curso de tempo mais curto para o aumento da regulação do palladin nos fibroblastos peri-tumoral ocorre em displasia de baixo grau (conhecido como PanIN 2 no pâncreas), temos a hipótese de que a regulamentação palladin deve ocorrer relativamente cedo na tumorigênese . mutações K-ras são onipresentes no câncer de pâncreas: presente em ambas as células ductais cancerosas e pré-cancerosas [42]. Porque palladin sobre-expressão é observado nos miofibroblastos imediatamente adjacentes às células ductais pré-cancerosas (Figura 1), especulamos se a ativação do K-ras sozinho em células ductais era suficiente para provocar a sobre-regulação de 90 kD palladin em fibroblastos normais vizinhas . Uma experiência de co-cultura semelhante, utilizando os transwells foi concebido com os fibroblastos normais na câmara inferior; a câmara superior continha as células normais epiteliais do ducto pancreático (HPDE) transfectadas com o tipo selvagem de K-ras, K-ras mutantes, ou um vazio do vector. A expressão de ambos os constitutivamente activada do tipo selvagem

ou

mutadas K-ras em células de HPDE foi suficiente para causar o aumento da regulação do palladin e α-SMA nos fibroblastos normais adjacentes (Figura 7B). Nem a expressão α-SMA palladin nem foram aumentados em presença de co-cultura com células parentais Ductal Pancreático (HPDE) transfectadas com um vector vazio.

A sobre-regulação de α-SMA e palladin em fibroblastos pelas células cancerosas adjacentes é impedida pela silenciamento de 90 kD palladin

para determinar se a transformação ras-induzida de fibroblastos em miofibroblastos dependiam de uma via palladin dependentes, utilizou shRNA para gerar clones estáveis ​​de HDF com knockdown palladin e, em seguida, medido palladin e α-SMA a produção depois de 9 dias de co-cultura dos fibroblastos normais com a linha celular de cancro pancreático, Panc-1. Não foi possível detectar a expressão α-SMA por RT-PCR após a co-cultura de células HDF estavelmente transfectadas com qualquer um dos três distinta shRNA construções de direccionamento de 90 kD palladin (Figura 8A; dados não mostrados). No entanto, foi observada sobre-regulação de α-SMA em presença de co-cultura com células Panc-1 se células HDF foram transfectadas com um plasmídeo de controlo ou shRNA em células HDF não tratados. Houve também uma consequência funcional para silenciar palladin em fibroblastos, tal como demonstrado por ensaios de migração e invasão (Figuras 8B 8c). silenciamento palladin diminuiu as funções anteriormente associadas com o fenótipo de miofibroblastos. Em conjunto, estes resultados indicam que as células ductais contendo K-ras activado são suficientes para sobre-regular a expressão em fibroblastos palladin adjacentes através de sinalização parácrina. Isto por sua vez faz com que o fibroblasto de se transformar em um miofibroblastos. silenciamento completa de palladin anula o processo. células HDF

A) foram estavelmente transfectadas com shRNA controle (C) ou shRNA contra 90 kD palladin (Pal shRNA). a-SMA expressão após a co-cultura com células Panc-1 foi analisada por meio de RT-PCR. Análise de HDF não tratada (L) é mostrada para comparação. A primeira pista é um controle negativo não-modelo; GAPDH é mostrada como um controlo de carga interna. É mostrado dados de um representante shRNA clone estável (de três construções shRNA independentes testadas). B) através de uma invasão de matrigel Transwell revestida foi comparada por HDF transfectadas como em (A). É mostrada a média ± DP. É mostrado dados de um representante shRNA clone estável (de três construções shRNA testados). células C) HDF como em (a) foram cultivadas até à confluência em lamelas e feridos com teste de raspagem. Migração foi avaliada através de IF 24 horas após o ferimento. Pelo menos 3 observações para cada condição foram analisados. Azul = DAPI. É mostrado dados de um representante shRNA clone estável (de três construções shRNA testado).

palladin Mutante (FX) confere algumas diferenças na expressão da proteína e do comportamento em fibroblastos em comparação ao tipo selvagem palladin (WT)

Por várias razões, foram incluídos nestas experiências do estudo da mutação P239S em uma região altamente conservada de 90 kD palladin que causa uma forma rara de câncer pancreático familial autossômica dominante. Como desregulação de uma proteína do citoesqueleto em fibroblastos peri-tumoral pode predispor a uma letal de câncer tal, altamente penetrante? Nestes estudos, descobrimos que o FX palladin fibroblastos que expressam foram significativamente mais invasivo do que os fibroblastos contendo o tipo selvagem palladin. Além disso, a análise quantitativa do proteoma detectada expressão de 88 proteínas que são únicas dos HDF-FX (Tabela S2) e não detectada em HDF-WT.