Sumário
Phyllanthus watsonii
Airy Shaw é uma planta endêmica encontrada na península da Malásia. Embora existam numerosos relatórios sobre as propriedades anti-câncer de outras
Phyllanthus
espécies, publicado informações sobre a citotoxicidade de
P. watsonii
são muito limitados. O presente estudo foi realizado com abordagem fracionamento biomonitorado para avaliar a capacidade de indução de citotoxicidade e apoptose da
P. watsonii
extratos e frações sobre ginecológica humana (SKOV-3 e Ca Ski) e cólon (HT-29) as células cancerosas.
P. watsonii
extratos exibiram forte citotoxicidade em todas as células cancerosas estudados com IC
50 valores de ≤ 20,0 mg /mL. extrato de hexano de
P. watsonii
foi submetido a fracionamento biomonitorado e rendeu 10 fracções (PW-1 → PW-10). PW-4 → PW-8 retratado actividade citotóxica forte e foi ainda submetido a fraccionamento guiado por bioensaio e resultou com 8 sub-fracções (PPWH-1 → PPWH-8). PPWH-7 possuía maior citotoxicidade (IC
50 valores variaram 0,66-0,83 ug /ml) e foi selectiva sobre as células cancerosas estudados. A análise por LC-MS /MS de PPWH-7 revelou a presença de ácido elágico, ácido geranic, glochidone, betulina, e filantina esterol glicósido. alterações morfológicas marcados, aparência escada-like do ADN e incremento na atividade da caspase-3, indicando a apoptose foram claramente observado em ambas as células ginecológicas e câncer de cólon humanos tratados com
P. watsonii
especialmente com PPWH-7. O estudo também indicou que
P. watsonii
extratos preso ciclo celular em diferentes fases de crescimento em SKOV-3, Ca Ski e células HT-29. Potencial citotóxico e apoptótica da endemia
P. watsonii
foi investigado pela primeira vez pela abordagem guiada por bioensaios. Estes resultados demonstraram que
P. watsonii
inibe selectivamente o crescimento de células SKOV-3, Ca Ski e células HT-29 através da indução de apoptose e a modulação do ciclo celular. Assim,
P. watsonii
tem o potencial de ser mais bem explorada para a descoberta e desenvolvimento de novas drogas anti-câncer
Citation:. Ramasamy S, Abdul Wahab N, Zainal Abidin N, Manickam S, Zakaria Z (2012) Crescimento A inibição da Gynecologic humanos e de células do cancro do cólon por
Phyllanthus watsonii
através da apoptose indução. PLoS ONE 7 (4): e34793. doi: 10.1371 /journal.pone.0034793
editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América
Recebido: 08 de setembro de 2011; Aceito: 08 de março de 2012; Publicação: 20 de abril de 2012
Direitos de autor: © 2012 Ramasamy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Fundo de Pesquisa de Pós-Graduação (PPP) Concede UM 524 PS130 /2008A e UM PS307 /2010A, financiado pela Universidade da Malásia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Há uma longa história no uso de plantas em países do Sudeste Asiático, alguns dos quais têm sido comprovadamente possui atividades biológicas interessantes com potenciais aplicações terapêuticas [1]. O uso de plantas como medicamento resultou no isolamento e caracterização de compostos farmacologicamente activos [2] e hoje existem pelo menos 120 substâncias químicas distintas derivadas de plantas que são considerados como importantes drogas e ingredientes activos, na indústria farmacêutica [3].
o cancro é uma das principais causas de morte em ambos os países desenvolvidos e em desenvolvimento e continua a ser um importante problema de saúde pública em muitas partes do mundo [4]. Muito esforço tem sido feito para desenvolver várias abordagens para reduzir a ameaça causada por câncer e apenas progressos modestos foi feito na redução da morbidade e mortalidade desta doença terrível [5]. Segundo o relatório World Cancer lançado pela Agência Internacional de Investigação do Cancro, a nível mundial, havia 12,4 milhões de novos casos de câncer em 2008 (6,672 milhões de homens e 5.779.000 nas mulheres) e 7,6 milhões de mortes por câncer (4.293.000 em homens e 3,3 milhões de mulheres) [6]. Actualmente, o tratamento do cancro por agentes quimioterapêuticos, radiação e cirurgia não foram totalmente eficaz contra a incidência elevada ou baixa taxa de sobrevivência da maior parte dos cancros [7]. A pesquisa de novos agentes anti câncer de fontes vegetais é uma das abordagens realistas e promissoras no domínio da quimioprevenção do cancro e isto conduziu à descoberta de diversos novos medicamentos anti câncer, incluindo alcalóides da vinca, vinblastina e vincristina, taxol, camptotecinas, e podofilotoxinas [8]. Abordagens também foram tomadas no sentido de descobrir agentes anti-câncer de plantas tropicais [2] como remédios alternativos de câncer por causa de suas toxicidades baixos e custos [9].
Durante as últimas décadas, muitos estudos têm indicado que o mecanismo de ação de muitas drogas anti-câncer é baseado na indução de apoptose, e abrindo assim uma nova estratégia na busca de drogas anti câncer [10]. Uma indução de apoptose é uma característica altamente desejável de estratégia de tratamento para o controlo do cancro, que é, por conseguinte, importante para pesquisar indutores apoptóticos a partir de plantas, quer sob a forma de extractos brutos ou compostos como componente [11]. Esses tipos de estudos deve ser feito por avaliar a citotoxicidade e indução de apoptose em linhas celulares de cancro antes de estudos com animais inteiros ou ensaios clínicos foram realizados.
Phyllanthus watsonii
Airy Shaw é um pequeno arbusto crescendo a cerca de 1 m de altura e pertence à família phyllanthaceae (Figura 1). A espécie é uma estreita endêmica e só é conhecida a ocorrência do norte para o sul Johor Pahang (dois estados na Península da Malásia), nas margens do rio Endau [1], [12]. Um certo número de estudos demonstraram que os extractos e compostos derivados de outra
Phyllanthus
espécies poderia suprimir o crescimento de vários cancros, incluindo o útero [13]; fígado [14], do pulmão [15], macrófagos [16], do útero, gástrica [17], da mama e do cancro do cólon [18]. No entanto, houve nenhum estudo detalhado foi realizado para avaliar o efeito citotóxico e apoptóticos de
P. watsonii
em linhas celulares de cancro humano, com exceção de um relatório que demonstram o efeito do extrato aquoso e metanol da
P. watsonii
contra MEWO células de melanoma de pele e células PC-3 de cancro da próstata [19]. estudos fitoquímicos revelou a presença de dois novos nor-triterpenos insaturados (26-nor-D: A-friedoolean-14-en-3-ona e 26-nor-D: A-friedoolean-14-en-3beta-ol), palmitato lupenyl, friedelina, epifriedelanol, glochidone, glochidonol, lupeol, Lup-20 (29) -en-1 beta, 3 beta-diol, sitosterol e sitosterol-beta (D) -glucoside em
P. watsonii
[20].
O presente estudo foi realizado para avaliar o potencial citotóxico de metanol, hexano e acetato de extratos de
P. watsonii
contra ginecológica humanos e linhas celulares de cancro do cólon. MRC-5, uma linha de células de fibroblasto humano normal do pulmão foi também utilizado para determinar a especificidade dos extractos de células cancerosas. células MRC-5 foram usados como um controlo em muitos estudos similares [21] – [23]. fraccionamento guiado por bioensaio foi também levada a cabo a fim de determinar os metabólitos secundários bioactivos com propriedades citotóxicas. Para o nosso conhecimento, esta será a primeira vez que extratos e frações de
P. watsonii
estão sendo testados contra estas linhas celulares. Além disso, o processo de apoptose associada ao efeito citotóxico nestas células também foi investigado.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Todas as licenças e permissões necessárias para a coleta de materiais foram obtidos para os estudos de campo descritos ea parte envolvida é devidamente reconhecido. As espécies (
Phyllanthus watsonii
) está localizado no Parque Nacional Rompin Endau que pertence ao governo do estado de Johor e gerido pelo Johor National Parks Corporation (JNPC), Malásia. A espécie não está ameaçada eo habitat não seja ameaçada e que também não está listado nos apêndices da CITES (Convenção sobre o Comércio Internacional de Espécies Ameaçadas de Fauna e Flora).
materiais vegetais
As folhas de
Phyllanthus watsonii
foram coletadas de Endau Rompin Parque Nacional, Johor (Malásia peninsular) em junho de 2008. a autenticação de
P. watsonii
foi realizada no herbário do Jardim Botânico de Rimba Ilmu, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Malaya e um material voucher (Ref. No. KLU46068) para este estudo foi depositado ao mesmo herbário.
Preparação de Extratos de
P. watsonii
As folhas secas de
P. watsonii
(PW) (2 kg) foram moídos e extraiu-se com metanol (MeOH) (Fisher Scientific, Reino Unido) (6 L x 3 vezes) à temperatura ambiente durante 72 horas e filtrou-se através de filtros Whatman No. 1 papel de filtro (Whatman , Inglaterra). O filtrado foi recolhido MeOH e o excesso de solvente foi evaporado sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo (Buchi, Suíça) a 40 ° C até à secura produzindo 160,3 g de extracto de MeOH-esverdeado escuro (PW-H). Uma parte do extracto de MeOH foi reservada para o ensaio, enquanto a parte restante foi adicionalmente agitado vigorosamente com hexano (Fisher Scientific, Reino Unido) até que o hexano resultante tornou-se quase incolor. A solução de hexano foi filtrada e solúvel reunidas, seguido por concentração sob pressão reduzida por um evaporador rotativo para se obter 6,5 g de extracto de hexano (PW-H). O insolúvel hexano remanescente foi submetido ao solvente-solvente de extracção com uma mistura de acetato de etilo (EtOAc) (Fisher Scientific, Reino Unido) e água destilada (01:01, v /v) seguido de mistura bastante vigorosa. Esta mistura foi, em seguida, sucessivamente fraccionado usando um funil de separação no qual duas camadas distintas formadas. A camada inferior (camada de água) foi descartada enquanto a fase EtOAc (camada superior) foi lançado para um copo limpo. Este filtrado foi concentrado sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo para se obter 9,7 g de extracto de EtOAc (PW-E). Em todas as experiências, os extractos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma) como uma solução estoque e armazenado a -20 ° C. Antes da análise, a concentração final de cada amostra foi preparada por diluição da solução de stock em 10% de DMSO. A concentração final de DMSO na cultura celular foi 0,5%. PW-M, PW-H e PW-E da
P. watsonii
foram ainda submetidos a ensaio de Absorção de Vermelho Neutro de acordo com os procedimentos descritos mais adiante. PW-H foi encontrado para expor mais forte citotoxicidade quando comparado com o PW-M e PW-E e justifica uma investigação mais aprofundada.
O fracionamento Bioensaio-guiada de PW-H
A fração citotoxicamente activos de PW -H (6,1 g) foi cromatografada numa coluna (4 cm DI × comprimento 40 cm) empacotada com silica gel 60 F254, espessura de 0,25 milímetros (Merck, Darmstadt, Alemanha) (160 g). eluição gradiente STEP começou com 100% de hexano e polaridade do solvente eluente foi gradualmente aumentada por utilização de acetona (Me
2CO) (Fisher Scientific, Reino Unido) e MeOH. Eluentes de 25 ml de volume foram coletadas em frascos numerados. A separação de cada eluente foi monitorizado por cromatografia em camada de pré-revestimento fina (TLC) de gel de sílica 60 F254 placa usando n-hexano /acetona (20:80, v /v) como um desenvolvimento zonas de solventes e o TLC foram detectados após a pulverização com
P
reagente de anisaldeído e aquecimento a 105 ° C durante 5 – 10 min. Os eluentes foram reunidas de acordo com a semelhança da composição química detectado em TLC e o excesso de solvente foi evaporado sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo para se obter um total de 10 fracções designadas como PWH-1, PWH-2, PWH-3, … …., PWH-8, 9-PWH * e PWH-10 * (Figura 2). As fracções PWH-9 * e PWH-10 * foram encontrados contendo gel de sílica e foram posteriormente dissolvido em clorofórmio e filtrado através de filtros Whatman No. 1 papel de filtro (Whatman, Inglaterra) para remover a sílica. As fracções PWH-9 e PWH-10 foram obtidos após a remoção do excesso de solvente por evaporação até à secura a 40 ° C sob pressão reduzida num evaporador rotativo. Todas as fracções foram ainda submetidos a Captação de ensaio de Vermelho Neutro (procedimentos descritos mais tarde) e frações PWH-4, … .., PWH-8 revelou que as frações mais ativas em atividade citotóxica.
Estas fracções (PWH-4, … .., PWH-8) (581,0 mg) foram reunidas e ainda purificado por cromatografia em coluna de sílica (2,6 cm Dl x comprimento 60 cm) empacotada com silica gel 60 F254, espessura de 0,25 milímetros (Merck, Darmstadt, Alemanha) (160 g). Eluição começou com 100% de hexano e polaridade do solvente de eluição foi gradualmente aumentada usando Me
2CO e MeOH. Eluentes de 25 ml de volume foram coletadas em frascos numerados. A separação de cada eluente foi monitorizado por cromatografia em camada de pré-revestimento fina (TLC) de gel de sílica 60 F254 placa usando n-hexano /acetona (20:80, v /v) como solvente de desenvolvimento e as zonas de TLC foram detectados após a pulverização com
P
reagente de anisaldeído e aquecimento a 105 ° C durante 5 – 10 min. Os eluentes foram reunidas de acordo com a semelhança da composição química detectado em TLC e o excesso de solvente foi evaporado sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo para se obter um total de 8 sub-fracções designadas como PPWH-1, PPWH-2, … .. , PPWH-8. As sub-fracções foram submetidas a ensaio de Absorção de Vermelho Neutro, como descrito mais tarde. O perfil do sistema de solvente e o rendimento de cada uma das fracções e sub-fracções obtidos encontram-se resumidos na Tabela 1.
Subsequentemente, extractos citotoxicamente activos (PW-M, H-PW e PW-E) e a maioria sub-fração ativa foram selecionados (PPWH-7) e ainda avaliada por seu efeito apoptótica para as linhas de células de câncer ginecológico e de cólon.
LCMS-MS Análise
O sub-fração mais ativa, PPWH-7 foi analisada pelo sistema de LC-MS /MS equipado com o espectrómetro de massa 3200 QTrap (Applied Biosystem, Darmstadt, Alemanha) e sistema Shidmazu UHPLC. A separação cromatográfica foi realizada num 50 mm x 2,0 mm x 5