Sumário
A interleucina-17 (IL-17) é predominante no tecido tumoral e suprime as respostas imunes anti-tumor eficazes. No entanto, a fonte do aumento infiltrantes de tumor de IL-17 e a sua contribuição para a progressão do tumor no cancro gástrico humano permanecem pouco compreendidos. Neste estudo, foram inscritos 112 doentes com cancro gástrico, imunofluorescência foi usada para avaliar a co-localização de CD3, CD4, CD56, CD20, CD68, e a triptase de mastócitos (MCT) com IL-17. A imuno-histoquímica foi utilizada para avaliar a distribuição de densidade de microvasos (CD34), CD66b
+, CD68
+, e FoxP3
+ células em diferentes áreas microanatômico. valor prognóstico foi determinada por análise de Kaplan-Meier e um modelo de regressão de Cox. Os resultados mostraram que os mastócitos, mas não as células T ou macrófagos, foram o tipo de célula predominante produção de IL-17 em cancro gástrico. correlações positivas foram detectadas entre as densidades de IL-17 derivada de células mastro e microvasos, neutrófilos, e células T reguladoras (Tregs). Como complemento, descobriu-se que a maioria das células endoteliais vasculares que expressam receptor de Interleucina-17 (IL-17R). A análise de Kaplan-Meier revelou que o aumento de células intratumorais infiltrado mastócitos e IL-17
+ células, bem como MCT
+ IL-17
+ células, foram significativamente associados com a sobrevida global pior. Estes resultados indicaram que os mastócitos foram a principal fonte de IL-17 em cancro gástrico, e intratumoral de IL-17 de infiltração podem ter promovido a progressão do tumor, aumentando a angiogénese no microambiente do tumor através do eixo de IL-17 /IL-17R. mastócitos IL-17-positivas mostrou fator prognóstico no câncer gástrico, indicando que a imunoterapia visando mastócitos pode ser uma estratégia eficaz para controlar intratumoral IL-17 infiltração, e, consequentemente, a imunossupressão reverter no microambiente tumoral, facilitando a imunoterapia do cancro.
Citation: Liu X, Jin H, Zhang G, Lin X, Chen C, Sun J, et al. (2014) As células intratumoral IL-17-positivo de mastro são a fonte principal da IL-17 que é preditiva de sobrevida em pacientes com câncer gástrico. PLoS ONE 9 (9): e106834. doi: 10.1371 /journal.pone.0106834
editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China
Recebido: 12 de maio de 2014; Aceito: 01 de agosto de 2014; Publicação: 08 de setembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. XSL foi apoiado pela concessão do National Science Foundation da China (81273254 /H1006), https://www.nsfc.gov. cn /. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Durante as últimas décadas, aumentando a atenção tem sido dada ao mecanismo (s) de escapar vigilância imunológica no microambiente do tumor e, em especial, a relação entre a inflamação ea imunossupressão. Um dos componentes mais importantes do sistema imune na inflamação associada com cancro foi recentemente reconhecida como a interleucina-17 (IL-17). IL-17 tem funções pleiotrópicas e múltiplos alvos que têm sido quase sempre exploradas em modelos de ratos, mas cada vez mais ligada a doenças humanas [1] – [5]. IL-17 foi identificada em vários tumores, incluindo cancro da mama [6], o cancro gástrico [7], [8], o cancro colo-rectal [9], induzida por carcinogénico cancro da pele [10], colangiocarcinoma intra-hepática [11], e hepatocelular carcinoma [12]. -IL-17 de células produtoras de aumentar gradualmente em número no microambiente tumoral durante o desenvolvimento do tumor e estão correlacionados com fraca sobrevivência em doentes relacionados com o cancro.
tem sido considerado que o grande fonte celular de IL-17 é + linfócitos CD4
T (células Th17). Recentemente, muitos estudos visando a IL-17 demonstraram que a IL-17, a produção não está limitado aos linfócitos Th17, mas é também encontrada numa variedade de células imunes adaptativas e inatos, incluindo células γδT, células NKT, células NK, células mastro, e granulócitos [3], [13].
o câncer gástrico é um dos tipos de câncer mais comuns e uma das principais causas de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [14]. Mais de 1 milhão de novos pacientes são diagnosticados com câncer gástrico cada ano no mundo, 42,5% dos quais estão na China. estratégias terapêuticas tradicionais, incluindo cirurgia, quimioterapia e radioterapia são os principais tratamentos para o câncer gástrico. Recentemente, a imunoterapia do cancro tem sido trazida para o foco [15] – [17]. No entanto, a imunossupressão associada ao tumor é um grande desafio para imunoterapia, porque enfraquece a actividade citotóxica de células T eficazes e células assassinas naturais. Durante o desenvolvimento do tumor, a imunossupressão tumor é comumente associado com a inflamação excessiva e descontrolada no microambiente tumoral [18]. é bem sabido que várias células inflamatórias infiltrar tumores, incluindo mastócitos, macrófagos, neutrófilos subtipos, assim como linfócitos T e B, uma indicação de inflamação associada a cancro [19].
No estudo actual , examinámos as fontes celulares de IL-17, a distribuição, a relevância funcional, e o valor preditivo de IL-17 produtoras de células em 112 doentes com cancro gástrico. Nós proporcionar novas perspectivas sobre o potencial mecanismo (s) de IL-17 no microambiente do tumor em doentes com cancro gástrico através da avaliação da relação entre a IL-17 produtoras de células e mediadores inflamatórios. O nosso objectivo é fornecer mais informações que podem ser úteis para a concepção de imunoterapias contra o câncer mais eficazes que visam IL-17.
Materiais e Métodos
Ética declaração
Antes da pesquisa , foi obtido consentimento informado de cada paciente. apropriado permissão foi concedida pelo comitê de ética da Primeira Affiliated Hospital, Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang.
As amostras dos pacientes
No total, 112 pacientes entre Fevereiro de 2009 e Março de 2010 no nosso hospital foram inscritos . Os pacientes que preencheram foram selecionados os seguintes critérios: a) diagnosticado como câncer gástrico com base em patologia; b) recebeu ressecção eficaz. Os critérios de exclusão foram pacientes que tinham evidências de metástases à distância, evidência de doença concomitante auto-imune, HIV ou sífilis e pacientes que receberam terapia anticâncer antes da cirurgia. Os critérios de ressecção eficaz foram definidos como ressecção sem tumor residual (R0) ou tumor residual microscópico (R1) de acordo com a 7
th edição do American Joint da Comissão sobre o Câncer. Após a ressecção curativa, os pacientes receberam quimioterapia adjuvante com base em 5-fluorouracilo e platina de acordo com a classificação TNM patológico. Os pacientes foram acompanhados com intervalo de 3-6 meses, incluindo ensaios de sangue periférico para marcadores tumorais e ultra-sonografia, e reforçada CT a cada 6 meses, Endoscópio cada 12 meses. As características clínicas dos pacientes estão apresentadas na Tabela 1.
A imuno-histoquímica e imunofluorescência
hematoxilina e eosina de rotina foi realizada para confirmar o diagnóstico patológico, intratumoral região foi definido como menos de 2 cm na fronteira com a margem do tumor no estômago, enquanto a região normal foi definida como pelo menos 5 cm que fazem fronteira com a margem do tumor no estômago.
imunohistoquímica
a imuno-histoquímica foi realizada como descrito em nosso estudo anterior [20 ]. Os anticorpos primários foram cabra anti-IL-17 (R D Systems, Reino Unido), de ratinho anti-CD66b (BD Pharmingen, EUA), de ratinho anti-CD68 (Abcam, EUA), de ratinho anti-FoxP3 (Abcam, EUA), e rato anti-CD34 (Beijing Zhongshan golden Bridge Biotech, China). Para o controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído por solução salina tamponada com fosfato (PBS).
Imunofluorescência
Para imunofluorescência, foram utilizados métodos semelhantes, excepto que a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada e não o Ab primário utilizado foi um cocktail de anticorpos. De cabra anti-IL-17 e anticorpos de cabra anti-IL-17R (ambos da R D Systems, USA) foram usadas para
detectadas células IL-17 + e expressão de IL-17R. Um painel de anticorpos reactivos com CD3, CD20, CD34, CD56, c-kit (monoclonal, tudo a partir de Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotech, China), CD4 (monoclonal, Leica, Alemão), monoclonal CD66 (mouse, BD Pharmingen, EUA), CD68, FoxP3 e a triptase de mastócitos (MCT) (monoclonal de ratinho, a partir de todos Abcam, EUA) foram utilizados. Após incubação durante a noite a 4 ° C, as secções foram submetidos a incubação com uma mistura de anticorpos secundários: Alexa Fluor 488/568-conjugada de burro anti-ratinho ou com Cy3 /Alexa Fluor 488 conjugado de burro anti-cabra ou Alexa Fluor 488 de burro anti-coelho ( todos os produtos da Invitrogen, EUA) a 37 ° C durante 1 h. As lâminas foram montadas com Vectashield contendo DAPI (Vector Laboratories, EUA) e visualizadas utilizando um microscópio de fluorescência de imagem (Olympus BX51, Japão) acoplado a uma câmara CCD (Nikon DS-Ri1). As imagens foram analisadas usando o software 3.2 NIS-Elements BR.
Os controlos negativos, em que PBS foi usado no lugar dos anticorpos primários, foram incluídos para cada marcador.
Quantificar parâmetros imunocoloração
Os dados foram obtidos por meio da contagem manualmente células coradas positivamente em 10 campos representativos de regiões normais e intratumorais menos de 400 × ampliação de alta potência. Especificamente, células ou grupos de células coradas Brown-endoteliais vasculares foram identificados como microvasos se tivessem limites claros com estruturas adjacentes [21]. Densidades foram determinadas calculando a média do número de células marcadas positivamente por alta potência campo microscópico (HPF). coloração dupla foi determinada por contagem manual das células positivas em 10 campos de alta potência; as proporções de células por marcador de superfie de IL-17 que expressam foram calculados. Todas as análises foram realizadas por dois observadores independentes, cegos (GE Z e XK L), e as contagens médias dos dois observadores foram utilizados na análise seguinte.
A análise estatística
Os valores medianos de CD34
+, CD66b
+, CD68
+, FoxP3
+, e triptase de mastócitos (MCT
+) e IL-17
+ células foram utilizadas como corte- offs para definir os subgrupos em nossos resultados. testes t de Student foram utilizados para comparar a infiltração de diferentes subconjuntos de células imunes no tecido tumoral e tecido normal correspondente. O teste do qui-quadrado foi utilizado para avaliar a relação entre IL-produtora de 17 células e características clínico-patológicas. As correlações entre a densidade microvascular (CD34), neutrófilos (CD66b), macrófagos (CD68), células T reguladoras (FoxP3) e células IL-produzindo-17 foram avaliadas por meio do coeficiente de correlação de Pearson ou Spearman. A sobrevida global foi definido como o intervalo entre a data da cirurgia e data da morte ou último follow-up, o que ocorrer mais cedo. estimativas função de sobrevivência foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier. Um modelo de riscos proporcionais de Cox foi utilizado para avaliar o efeito de células sobre a sobrevivência geral de IL-17 produtoras. Um valor de p 0,05 foi considerado como indicativo de significância estatística. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism (versão 5.00 para Windows;. GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) e da SPSS.; Software (versão 16.0. SPSS Inc., Chicago, IL, EUA)
resultados de
população do estudo
características dos pacientes estão apresentados na Tabela 1. no total, 78 machos e 34 fêmeas foram inscritos. A idade da população do estudo variou de 33 a 89 (60 mediana) anos. Dos 112 pacientes com câncer gástrico, o estado da infecção por H. pylori foi positiva para 65 pacientes, enquanto 47 foi negativa. 110 pacientes receberam ressecção R0 e 2 pacientes receberam R1 ressecção. classificações TNM patológicos foram baseados no 7
th edição do American Joint da Comissão sobre o Câncer: 33 pacientes não tinham metástase linfática, enquanto 21 foram N1, 22 eram N2, e 36 foram N3. 1 paciente pertencia Tis, 23 pacientes pertenciam à fase I, e 25, 63 pacientes para as fases II, III, respectivamente. 3 (2,7%) pacientes perdidos para follow up e 39 (34,8%) pacientes morreram durante o período de observação. A mediana do tempo de seguimento foi de 51 meses, variando de 39 a 57 meses e as taxas de sobrevida global (OS) foram 83,0% em 1 ano, 71,4% em 3 anos e 65,7% em 4 anos, respectivamente.
IL-17 foi expressa predominantemente por MCT
+ mastócitos
as amostras aleatórias de 20 pacientes de toda a coorte foram usadas para avaliar a distribuição e fenótipo das células produtoras de IL-17 na região intratumoral e o correspondente tecidos normais (Fig.1). Encontrámos citoplasmática de IL-17 de coloração em células com um fenótipo ovóide, como descrito anteriormente [13], e em células de uma forma mais irregular. Além disso, descobrimos que as células IL-17 que expressam foram mais frequentes nos tecidos intratumorais do que tecidos normais. Para identificar os
células IL-17 + nos tecidos intratumorais, realizamos experimentos co-localização e calculou a proporção de IL-17
+ células em cada subconjunto. Em primeiro lugar, foi realizada uma co-localização de c-kit, um marcador de células mastro adicional, com a triptase de mastócitos (MCT), os resultados mostraram que todos os MCT
+ células que expressam c-kit (Fig. S1), indicando que o MCT pode ser utilizado para mastócitos identificados representativamente. Em células do fenótipo ovóide, que seleccionado um número de células T, células B, e marcadores de células NK: especificamente, CD3, CD4, CD20, e CD56, e avaliada a sua co-localização com a IL-17. No entanto, foram identificadas CD20
+ IL-17
+ e CD56
+ IL-17
+ células, embora raramente ( 1%; Fig.2, painéis superior direito). Embora ocasional CD3
+ IL-17
+ e CD4
+ IL-17
+ células foram observadas, os percentuais médios de IL-17
+ células em ambos os subgrupos foram de 12,4% ( 2,2-34,1%) e 8,4% (0-26,7%; Fig.2, painéis superiores esquerdas; Tabela 2) a seguir, investigou o fenótipo de IL-17
+ células de forma irregular; Os macrófagos têm sido sugeridos como potenciais fontes de produção de IL-17 [22]. Consistente com isto, até 18,5% das células de IL-17 produtoras em tecidos de cancro gástrico foram macrófagos (Figura 2, painel inferior esquerdo; Tabela 2). No entanto, a maior parte da IL-17 produtoras de células ainda não foram identificados. Para determinar se os mastócitos foram uma fonte adicional de IL-17 na produção de cancro gástrico, foi realizada uma co-localização de IL-17 e a triptase de mastócitos (MCT). Descobrimos que a maioria dos IL-17
+ células colocalized com o MCT
+ células. (40-60% de IL-17
+ células; Fig.2, painel inferior direito; Tabela 2)
quadrados indicam exemplos diferentes (marrom, mostrados em 400 × ampliação).
As secções foram contrastadas com DAPI. Marcadores de CD3 ou CD4 (verde) e marcador de células B CD20 (verde), natureza killer (NK) marcador CD56 (verde) e CD68 marcador de macrófagos (laranja), bem como triptase de mastócitos (MCT) (laranja) são apresentados na 400 × ampliações.
Distribuição de MCT
+ IL-17
+ células e correlação com características clinicopatológicas
Para confirmar que derivada dos mastócitos IL-17 foi uma grande fonte celular de IL-17 no microambiente do cancro gástrico, foi realizada imunofluorescência dupla coloração de tecidos e intratumoral amostra normal dos 112 pacientes. A maior parte da IL-17
+ células duplamente coradas fortemente com o MCT (14-68,1% de IL-17 que expressam células) em tecidos intratumorais (Fig. 3A). Descobrimos que as densidades de células MCT
+ mastro e IL-17
+ células em tecidos intratumorais foram encontrados para ser significativamente maior do que em tecidos normais (MCT
+
T vs. MCT
+
N, 10,02 ± 4,06 vs. 8,66 ± 3,29, p = 0,0023; IL-17
+
T vs. IL-17
+
N, 8,16 ± 3,89 vs. 7,18 ± 3,48, p = 0,0165; Fig. 3B). Além disso, a densidade de MCT
+ IL-17
+ células em tecidos intratumorais foi significativamente mais elevada do que nos tecidos normais (4,55 ± 2,48 vs 3,93 ± 2,24, p = 0,0154; Fig. 3B).
A. Os mastócitos altamente expressa IL-17 no câncer gástrico (incorporada em amarelo painel, à direita). B. MCT
+ e células IL-17
+ células, bem como MCT
+ IL-17
+ células em tecidos intratumorais foram significativamente maiores do que as dos tecidos normais correspondentes.
Para identificar associações significativas entre características clínicas e MCT
+ IL-17
+ células, foi utilizado o teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher (mostrados na Tabela 1). No entanto, MCT
+ IL-17
+ células nos tecidos intratumorais não se correlacionou com nenhuma característica clínica avaliada, incluindo H. pylori estado de infecção, tamanho do tumor, grau de diferenciação e classificação de TNM.
Aumento intratumoral MCT
+ celular, IL-17
+ celular, e MCT
+ IL-17
+ densidades celulares foram correlacionados com a sobrevida global pobres
Na análise univariada (Tabela 3), o clínico-patológico convencional apresenta preditivo de má sobrevida global (oS) foram tumores pouco diferenciados e estágio TNM avançado. Para uma análise mais aprofundada, o número de MCT
+ células, IL-17
+ células, e MCT
+ IL-17
+ células foram divididos em dois grupos: acima e abaixo dos valores medianos. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram preparadas usando o teste log-rank para investigar a associação com o OS. Os doentes com elevado número de intratumoral infiltrando MCT
+ células e IL-17
+ células tinham um sistema operacional mais pobres do que aqueles com menor número de MCT
+ células (p = 0,004) e IL-17
células + (p = 0,014, Fig. 4B). Além disso, os pacientes com números mais elevados de MCT
+ IL-17
+ células teve a duração de sobrevivência mais curta do que aquelas com menor número de MCT
+ IL-17
+ células (p = 0,018, Fig. 4C).
(A) A sobrevivência global para todos inscritos 112 doentes (b) alta intratumoral de IL-17
+ células infiltração conferido um elevado risco significativo de morte. (C) Os pacientes com alta MCT
+ IL-17
+ celular intratumoral tiveram pior sobrevida significativa do que pacientes com baixa MCT
+ IL-17
+ celular.
Variáveis de P 0,1 na análise univariada foram incluídas em um Cox análise de risco proporcional multivariada, verificou-se que ambas as células intratumorais MCT-positivos (HR = 2,057; IC 95%: 1,048-4,037; p = 0,036) e TNM fase (HR = 3,832; IC 95%: 1,679-8,745; p = 0,001) foram fatores prognósticos independentes (Tabela 3). Indicando que os pacientes com maior número de células MCT-positivos intratumorais foram quase 2,1 vezes mais probabilidade de morrer do que aqueles com menor número dessas células.
características imuno-histoquímica e a associação entre o MCT
+ IL-17
+ densidade celular e variáveis imunoquímicas
IL-17 é um conhecido factor de pró-inflamatório, que pode promover o crescimento do tumor através da promoção da angiogénese e do recrutamento de neutrófilos, bem como o recrutamento de outros tipos de células inflamatórias e imunitárias. Para explorar o potencial mecanismo (s) de acumulação de IL-17 no microambiente tumoral com prognóstico pobre. Foi realizada imuno-histoquímica para vários mediadores inflamatórios, especialmente, a densidade microvascular, neutrófilos, macrófagos e células T reguladoras em toda a população estudada (
n
= 112). campos representativos de CD34
+ microvasos, CD66b
+ neutrófilos, CD68
+ macrófagos e FoxP3
+ linfócitos T reguladores em intratumoral e tecido normal são mostrados na Fig. 5A. As densidades de intratumorais CD34
+ microvasos (p = 0,0030), CD66b
+ neutrófilos (p 0,0001), CD68
+ macrófagos (p 0,0001)
+ linfócitos T reguladores e FoxP3 (p 0,0001) foram significativamente maiores do que aqueles em tecidos normais (Fig 5B)
a… campos representativos de CD34
+ microvasos (A1), CD66b
+ neutrófilos (A2), CD68
+ macrófagos (A3) e FoxP3
+ linfócitos T reguladores (A4) em intratumoral e tecido normal ( marrom, mostrado em 400 × ampliação). o número de células B. absolutos de CD34
+ microvasos (B1), CD66b
+ neutrófilos (B2), CD68
+ macrófagos (B3) e FoxP3
+ linfócitos (B4) por campo de alta potência em intratumoral e tecidos normais foram analisados. As linhas horizontais representam o valor médio ± erro padrão do grupo. Os valores de P foram calculados por amostra de teste t pareado para CD34
+ microvasos e FoxP3
+ linfócitos, enquanto que o teste Man-Whitney foi usado para CD66b
+ neutrófilos e CD68 análise
+ macrófagos.
Em seguida, foi analisada a correlação entre MVD intratumoral, a densidade de neutrófilos, macrófagos densidade, densidade de células T reguladoras, e uma densidade populacional de IL-17
+, particularmente MCT
+ IL-17
+ células. Os resultados mostraram uma correlação significativa entre MVD e IL-17
+ células (r = 0,4040, p = 0,0001), embora significativa, mas fraco, foram encontradas correlações entre IL-17
+ células e neutrófilos (r = 0,2135, P = 0,0238) e Tregs (r = 0,2963, P = 0,0017) (dados não mostrados). No entanto, analisamos ainda mais a correlação entre MCT
+ IL-17
+ células e esses mediadores inflamatórios. A correlação significativa mais forte foi encontrada entre o MCT
+ IL-17
+ células e MVD (r = 0,4396, p 0,0001). No entanto, as correlações entre MCT
+ IL-17
+ células e neutrófilos (r = 0,2578, P = 0,0061) e Tregs (r = 0,2898, P = 0,0021) foram semelhantes aos de IL-17
+ (mostrados na figura 6).
(a) CD34
+ densidade de microvasos. (B) CD66b
+ neutrófilos. (C) CD68
+ macrófagos. (D) FoxP3
+ linfócitos. Os valores de P foram determinados pelo coeficiente de correlação de Pearson para CD34
+ microvasos e FoxP3
+ linfócitos, enquanto coeficiente de Spearman foi utilizado para CD66b
+ neutrófilos e CD68 análise
+ macrófagos.
co-localização entre a IL-17R e várias células inflamatórias e imunitárias
de forma a explorar o mecanismo (s) sob a estreita relação entre a IL-17 de células produtoras e MVD, bem como outras inflamatória e imune células. Foram realizadas experiências de co-localização para avaliar a expressão de IL-17R em células vasculares endoteliais, neutrófilos, macrófagos e células T reguladoras (aleatório seleccionado, n = 20). Os nossos resultados mostraram que a maioria das células endoteliais vasculares que expressam a IL-17R (6-58% das células endoteliais vasculares; Fig.7) em tecidos intratumorais. Consistente com nossa hipótese, apenas neutrófilos e células T reguladoras foram detectados que expressam a IL-17R. Curiosamente, verificou-se a expressão de IL-17R na superfície das células tumorais. (Fig. S2).
Discussão
fuga imunológico desempenha um papel fundamental na gênese e desenvolvimento de câncer. Os mediadores e efectores celulares do sistema imunitário são componentes importantes de um ambiente tumoral imunossupressora. O papel da interleucina-17, como um factor pró-inflamatória, tem atraído recentemente a atenção em cancros, doenças auto-imunes, e doenças de imunodeficiência. CD4
+ células Th17 foram pensado para ser a única fonte celular de IL-17 no microambiente tumoral humana [23]. No entanto, cada vez mais evidências tem demonstrado que vários tipos de células pode produzir IL-17 [3], [24]. Os mastócitos, um importante componente celular do sistema imune inato, têm sido reconhecidos como uma importante fonte celular de IL-17. Com efeito, eles podem produzir e /ou secretar uma variedade de citocinas e quimiocinas que contribuem para a defesa imune e inflamação, incluindo o recrutamento de leucócitos e a proliferação celular vascular. Recentemente, foi demonstrado que os mastócitos infiltre no interior do microambiente do tumor por meio da via de sinalização SCF /c-Kit, que conduz à exacerbação da inflamação e da imunossupressão [25]. -Mastro de células derivada de IL-17 foi estudado em várias doenças auto-imunes, incluindo artrite reumatóide [13], psoriase [26], e espondiloartrite [27], no qual os mastócitos foram uma grande fonte celular de IL-17, e mostrou uma forte correlação com a patogênese e progressão da doença. No entanto, a fonte do aumento de IL-17 de nível que se infiltram no tumor e da contribuição para a progressão do tumor, bem como o mecanismo (s) subjacente, permaneceu pouco compreendidos.
No presente estudo, foi observado que as células IL-17 que expressam em amostras de cancro gástrico humano exibiu dois fenótipos. Alguns tinham um fenótipo relativamente regular, formas ovóides /plasmocitóides, mas alguns tinham formas mais irregulares. Além disso, verificou-se que a IL-17
+ linfócitos composto apenas ~ 10% das células de IL-17 que expressam, em contraste com estudos anteriores em microambientes tumorais humanas [7], [23]. Recentemente, Bo Wang et al. [28] descobriu que os mastócitos, mas não células T ou macrófagos, foram o tipo predominante expressando IL-17 em tecidos de carcinoma de células escamosas do esôfago. Curiosamente, também descobrimos que a maioria dos IL-17
+ células colocalized com o MCT
+ células (14-68,1% de IL-17
+ células), indicando que os mastócitos eram a fonte celular predominante de IL-17 em cancros gástricos humanos. Vários estudos têm demonstrado que a IL-17 prejudica a vigilância imunitária e promove a angiogénese e a carcinogénese em tumores [1], [29], o que sugere que o ambiente inflamação impulsionada pelos níveis de IL-17 endógena pode contribuir para a progressão do tumor. Os nossos resultados sugerem que o nível de IL-17 que expressam células foi maior em amostras de tecido tumoral do que as amostras de tecidos normais correspondentes e que derivada de células mastro de IL-17 foi mais abundante em cancros gástricos humanos. A análise de Kaplan-Meier revelou que intratumorais de IL-17
+ células e MCT intratumoral
+ IL-17
+ células foram correlacionados com pior sobrevida em pacientes com câncer gástrico humanos.
O mecanismo preciso (s) subjacente à associação entre os níveis cada vez maiores de IL-17 na progressão tumoral microambiente tumoral e permanecem (s) claro. Um estudo relatou que a IL-17 promovem o desenvolvimento do tumor por meio do recrutamento de células mielóides derivadas supressores (MDSCs), tais como CD11b
+ Gr1
+ células, para o ambiente tumoral [30]. Por outro lado, vários estudos têm demonstrado que a IL-17 pode aumentar o crescimento de células endoteliais vasculares e influenciar o progresso angiogénico através do aumento da secreção de citoquinas, tais como TNF-α, IL-8, e VEGF [29], [31], incluindo um estudo relatou que a rede parácrina de IL-17 mediada por promove a resistência do tumor à terapêutica anti-angiogénica [32]. Coerente com isso, nossos resultados indicaram uma correlação significativa entre MVD e IL-17
+ células. Tem sido bem estabelecido que os mastócitos poderia estimular a proliferação vascular [33], em nosso estudo, encontramos uma correlação mais significativa entre MVD e MCT
+ IL-17
+ células, demonstrando que estes IL-17 produzindo mastócitos tem efeito mais forte na promoção da angiogênese. Além disso, verificou-se que a maioria das células endoteliais vasculares que expressam IL-17R, que é mais interessante, verificou-se que as células de cancro gástrico foram positivas para IL-17R. Estudos anteriores relataram que a expressão de IL-17R foi associado com a malignidade de tumores [34], [35]. Combinando estes resultados, a IL-17 de infiltração podem ter promovido a progressão do tumor, aumentando a angiogénese no microambiente do tumor através do eixo de IL-17 /IL-17R, em função de células endoteliais vasculares e células tumorais. Outro mecanismo possível reside no recrutamento de células inflamatórias por IL-17, tais como neutrófilos e macrófagos. Tem sido demonstrado que a IL-17 promove a progressão tumoral através de efeitos directos sobre o recrutamento de neutrófilos [36], [37]. Em nosso estudo, intratumoral IL-17
+ células e MCT
+ IL-17
+ células ambos mostraram correlações fracas, mas significativas, com o número de neutrófilos intratumorais, enquanto os macrófagos intratumorais não mostrou significância. Embora, apenas foram encontrados neutrófilos que expressam a IL-17R. Mastro derivada de IL-17 pode desempenhar um papel importante no recrutamento de neutrófilos por quimiocinas CXC, tais como CCL2, como descrito anteriormente [38]. A evidência a partir de vários tipos de cancro demonstra que a proporção de células T reguladoras (Tregs) está aumentada em tecido de tumor em pacientes com várias doenças malignas [39], [40]. Tem sido relatado que as Tregs recrutamento teve um papel chave no estabelecimento de um microambiente tumoral rico-VEGF e aumentando a angiogénese de tumores [41]. estudo anterior tenha relatado o papel regulador de mastócitos na medida em que eles interagem com CD4 convencional
+ células T para gerar a IL-10 de células T produtoras de regulação através do eixo de ICOSL /ICOS [42]. Ganeshan et ai. [43] relataram que Tregs realmente aumentar, em vez de inibir, a produção de células mastro de IL-6, uma citoquina pleiotrópica, o que tem sido demonstrado que desempenham um papel crucial na regulação do equilíbrio entre as células IL-17 produzem e FoxP3
+ células T reguladoras. Assim, podem existir correlações intensas entre Tregs e mastócitos de IL-17 produtoras. Em nosso estudo, a correlação entre a IL-17
+ células Tregs e era fraca, mas significativa, bem como o MCT
+ IL-17
+ células. Estes resultados demonstraram que a IL-17 de produção de mastócitos pode induzir a diferenciação e acúmulo de Tregs através da secreção de vários tipos de citocinas e quimiocinas, que precisam ser mais bem investigado.
Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório do fenótipo e distribuição de intratumorais de IL-17 produtoras de células e a sua relevância clínica, e em particular o valor prognóstico da IL-17 derivada de células mastro intratumoral no cancro gástrico. Os nossos dados demonstram que a maioria das células produtoras de IL-17 foram mastócitos, enquanto que a IL-17
+ linfócitos foram raras. Além disso, descobrimos que intratumorais de IL-17
+ células e MCT intratumoral
+ IL-17
+ células foram correlacionados com pior sobrevida. No entanto, o mecanismo (s) da infiltração de mastócitos para o microambiente do tumor e o mecanismo específico entre a sobre-expressam a IL-17 e as células inflamatórias e imunitárias permanecem em grande parte desconhecida. Além disso, a função distintiva de armazenados e de secreção de IL-17 ainda necessária a ser ilustrado. Assim, estudos prospectivos com foco em recrutamento de mastócitos e produção de IL-17 no microambiente do tumor do estômago são necessários para avaliar o valor preditivo de-derivado de mastócitos intratumoral mais.
Informações de Apoio
Figura IL-17 S1.
co-localização entre c-kit e triptase de mastócitos (MCT)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0106834.s001
(TIF)
Figura S2.
co-localização entre IL-17R (verde) e neutrófilos, macrófagos, células T reguladoras (laranja)
DOI:. 10.1371 /journal.pone.0106834.s002
(TIF)
Agradecimentos
Agradecemos Lin Zhou, Haiyang Xie e Xiaowen Feng no Laboratório de Key of Combined multi-Transplante de Órgãos, Ministério da Saúde Pública, primeiro Hospital Filiado, Faculdade de Medicina, Universidade de Zhejiang para obter suporte técnico em imuno-histoquímica e imunofluorescência.