Abstract
Fundo
A metástase associado no adenocarcinoma de pulmão transcrição-1 (malat-1) é abundante durante a progressão do câncer e promove a migração e invasão celular em muitos tumores sólidos. No entanto, o seu papel no câncer de ovário ainda é pouco compreendido.
Métodos
Expressões de malat-1 foram detectados em 37 tecidos ovarianos normais e 45 tecidos de cancro do ovário por RT-PCR (RT- PCR). A proliferação celular foi observada por CCK-8 de ensaio; A citometria de fluxo foi usada para medir o ciclo celular e apoptose; A migração celular foi detectada por migração Transwell e ensaio de invasão. A fim de avaliar a função da malat-1, combinada com shRNA microarranjo de DNA e análise funcional de enriquecimento foram realizadas para determinar os efeitos da transcrição de malat-1 silenciamento em células OVCAR3. RNA e proteína expressão foram medidos por qRT-PCR e Western blot, respectivamente.
Resultados
Nós descobrimos que a regulação positiva de malat 1-mRNA em tecidos de cancro do ovário e reforçada malat-1 expressão foi associada com o estágio FIGO. Knockdown de malat-1 em células OVCAR3 inibiu a proliferação celular, migração e invasão, levando a G0 /G1 paragem do ciclo celular e apoptose. Overexpressed expressão malat-1 em células SKOV3 promoveu a proliferação celular, migração e invasão. Regulação negativa do malat-1 resultou numa alteração significativa da expressão do gene (pelo menos 2 vezes) em 449 genes que regulam a proliferação, do ciclo celular, e a adesão. Como consequência da malat-1 knockdown, a expressão da proteína MMP13 diminuiu, enquanto a expressão de MMP19 e ADAMTS1 foi aumentada.
Conclusões
O presente estudo constatou que malat-1 é altamente expresso no ovário tumores. Malat-1 promove o crescimento e migração de células de câncer de ovário, sugerindo que malat-1 pode ser um contributo importante para o desenvolvimento de cancro do ovário
Citation:. Zhou Y, Xu X, Lv H, Wen Q, Li J , Tan L, et ai. (2016) The Long não codificante RNA malat-1 é altamente expresso no cancro do ovário e Induz Crescimento Celular e Migração. PLoS ONE 11 (5): e0155250. doi: 10.1371 /journal.pone.0155250
editor: Zhiqian Zhang, Pequim Hospital Institute, CHINA
Recebido: 04 de janeiro de 2016; Aceito: 26 de abril de 2016; Publicado em: 26 de maio de 2016
Direitos de autor: © 2016 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da Agência de Ciência e Tecnologia da Informação do Guangzhou (No. 2010GNE00221) eo estudo Mecanismo de MALAT1 Promover a invasão e metástase de cancro do ovário por alvejado Reguladora STAT3 via de sinalização (No. 2014A020212517)
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
carcinoma do ovário
epitelial ( EOC) é o mais mortal malignidade ginecológica, representando a morte significativa de câncer a cada ano [1]. e [2]. Devido aos sintomas não específicos na fase inicial da doença e da falta de técnicas de rastreio eficazes na clínica, a maioria (até 75%) dos pacientes são diagnosticados em estágios avançados, quando a doença já se espalhou além da pélvis, resultando em um mau prognóstico [3,4]. Apesar dos esforços contínuos para melhorar o diagnóstico eo tratamento EOC, a recorrência de tumores e metástases continuam a ser grandes obstáculos para o sucesso do tratamento de pacientes EOC [5]. Assim, é urgentemente necessária investigação sobre o cancro detecção precoce do ovário e aperfeiçoamento de estratégias de tratamento atuais.
É amplamente aceito que o desenvolvimento do câncer é o resultado da expressão do gene alterado e /ou alterações estruturais dos genes codificadores de proteínas. No entanto, os dados de sequenciação do genoma revelou que milhares de genes não têm a capacidade de codificação da proteína, enquanto que joga um papel importante na regulação do crescimento celular, sobrevivência e a apoptose, e a tumorigénese ou outras doenças [6]. A nossa investigação centra-se em malat-1, originalmente identificado no cancro do pulmão de células não pequenas, é um ARN não codificante grande que está intimamente associado com a metástase do tumor e regula a expressão de vários genes associados a metástase [7]. Malat-1 está localizada no cromossoma 11q13.1, estende por uma região genómica 8.7kb, e é largamente expressa em tecidos normais, principalmente no pulmão e pâncreas [8] ,. Malat-1 é especificamente retidos nas manchas nucleares [9], em que factores de splicing de pré-mRNA são enriquecidos e, assim, podem funcionar como uma montagem, armazenamento e /ou a modificação do compartimento [10]. Malat-1 também tem sido implicado na progressão tumoral [11]. Os dados indicaram que malat-1 foi envolvida no desenvolvimento do cancro através da regulação de splicing alternativo de seus genes-alvo [12] ou a expressão do gene [13,14]. Malat-1 expressão foi encontrado para ser sobre-reguladas em muitos tumores sólidos, tais como pulmão [8], fígado [15], e os cancros da próstata [16] e possui uma função de promoção do tumor. No presente estudo, nós medimos malat-1 níveis de expressão em tecidos de tumor de ovário e cancro dos ovários normais primárias e investigou o papel biológico de malat-1 na patogénese do cancro do ovário.
Materiais e Métodos
2,1 Tissue amostras
37 amostras epiteliais de ovário normal e 45 espécimes de tecidos de câncer de ovário foram obtidos a partir do terceiro Affiliated Hospital da Universidade de Medicina de Guangzhou durante 2009-2013. Todos os casos de câncer de ovário não receberam terapia antes da cirurgia e foram diagnosticados histologicamente de acordo com o livro da OMS de patologia ginecológica (Tabela 1). Estas amostras de tecido foram congeladas em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Este estudo foi aprovado pela revisão institucional da ampla da University Medical Guangzhou e um consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes antes da participação deste estudo.
2.2 linha celular e cultura
a linha celular de cancro do ovário OVCAR3, SKOV3 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) e cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de estreptomicina /penicilina a 37 ° C em 5% de CO
2. As células foram colhidas na fase logarítmica de crescimento em todas as experiências descritas abaixo.
Isolamento
2.3 ARN e qRT-PCR
O ARN celular total foi isolado a partir de tecidos e linha de células utilizando o reagente Trizol (Takara Bio, Inc., Shiga, Japão) e depois reversamente transcrito em ADNc utilizando RT PrimeScript master mix (Takara) de acordo com as instruções do fabricante. qPCR foi realizado para determinar a expressão de malat-1, MMP-13, MMP-19, ADAMTS1, e ARNm β-actina utilizando um kit de SYBR Green MIX da Promega (Madison, WI, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante. sequências de iniciadores são apresentados na Tabela 2. Os níveis de mRNA de p-actina foram usados como uma inferência interna.
2.4 Projeto e construção de malat-1vectors e transfecção gene
Para avaliar o papel de malat-1 em cancro do ovário, que derrubado malat-1 e expressão usando shRNAs overexpressed malat-1 usando expressão pcDNA3.1 (+) – malat-1 (a-malat-1). Nós concebido e construído de quatro conjuntos de malat-1 oligonucleotídeos shRNA (shM1-M4) e clonado-los para o pGPU6 /GFP /vetor Neo (Jima, Xangai, China). As sequências foram malat-1-shM1, 5′-GCCGAAATAAATGAGAGAT GA-3 ‘; shM2, 5’-GG CAGCTGTTAACAGATAAGT-3 ‘; shM3, 5’-GCTGTGGAGTTCTTA AATATC-3 ‘; shM4, 5’-GGGCTTCAGTGATGGGATAGT-3 ‘. A /GFP /vector de neo pGPU6 que contém uma sequência de ADN aleatória foi utilizado como um controlo precipitação (SHNC). Após a clonagem, amplificação e sequenciação de ADN, que estes vectores transfectados em células OVCAR3. Em resumo, as células foram semeadas numa placa de 6 poços e cultivadas durante a noite quando se atinge 70-80% de confluência. OVCAR3 foram transfectadas com shM1, shM2, shM3, shM4, ou SHNC utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. SKOV3 foram transfectadas com pcDNA3.1 (+) – 1-malat e pcDNA3.1 (SKOV3-NC). As células foram examinadas 48 horas após a transfecção com um microscópio invertido de fluorescência para avaliar a eficácia de transfecção. As células foram então recolhidas e sujeitas a análise de qRT-PCR da expressão malat-1. Porque malat-1 shM3 foi mais eficaz na consecução knockdown de malat-1 expressão, todos os experimentos subsequentes foram realizados usando este shRNA.
2.5 celular ensaio de proliferação
Para avaliar os efeitos da malat-1 em células de cancro do ovário, que em primeiro lugar as células semeadas em placas de 96 cavidades com 5 x 10
3cells /poço e cultivadas durante a noite. As células foram então transfectadas com malat-1-shM3, SHNC, aMALAT-1 e SKOV3-NC. A proliferação celular foi medida utilizando o ensaio CCK-8 (Biyuntian, Xangai, China) em incrementos de 24 h até às 96 horas. Resumidamente, 10 uL de CCK-8 solução foi adicionada a cada poço de cultura de células e as placas foram ainda incubadas durante mais 2,5 h. A densidade óptica foi então medida por análise de FACS na absorvância de 450 nm. As experiências foram realizadas em triplicado e repetidas pelo menos três vezes, independentemente.
2,6 Transwell migração de células tumorais e invasão de ensaio
As câmaras Transwell com poros de 8 um foram obtidos a partir de Corning (Corning, NY, EUA ). As células transfectadas foram recolhidas, ressuspensas em DMEM sem FBS a uma concentração de 1 x 10
6 células em 100 uL, e em seguida semeadas em câmaras superior da placa de 24 poços. As câmaras inferiores foram cheias com 600 ul de DMEM contendo 10% de FBS. As células foram então incubadas durante 24 h. No final da experiência, as células que migraram para o lado oposto da membrana Transwell foram fixadas com metanol, coradas com violeta de cristal, e, em seguida, contados sob um microscópio de luz com uma ampliação de x100. foi examinada uma média de cinco campos visuais. Para o ensaio de invasão de células tumorais, a membrana Transwell foi pré-revestido com 30 ul de Matrigel (1: 3 com PBS misturado; BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) e procedeu da mesma, tal como descrito acima
2,7 celular. ciclo e apoptose por citometria de fluxo de ensaio
As células foram colhidas e ressuspensas a uma densidade de 5-10 x 10
6 células /ml, e em seguida fixadas com etanol a 75% arrefecido em gelo e coradas com iodeto de propidio 400 ul solução de (PI) (BestBio, Xangai, China) durante 30 min e, em seguida, submetido a análise do ciclo com um citómetro de fluxo (BD). Para a análise da apoptose, as células foram coradas com 5 jil de anexina V-FITC (BD Biosciences) durante 15 min e 5 ul PI durante mais 5 min antes de serem submetidas a análise de citometria de fluxo.
2.8 Perfis de gene diferencial expressão após malat-1 knockdown em células de cancro do ovário
o RNA total foi extraído com o reagente TRIZOL e quantificadas pela NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific). A integridade do ARN foi avaliada usando Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). bibliotecas de ADNc foram construídas a partir de amostras com um número ≥7.0 integridade do RNA (NIR). Os ARNs totais foram transcritos para ADNc de cadeia dupla e ARNc então sintetizados. Em seguida, 2º cDNAs ciclo foram sintetizados a partir de ARNc. fragmentação seguido e rotulagem biotina, o 2º ciclo cDNAs foram hibridizadas para o microarray. Após a lavagem e coloração, as matrizes foram digitalizados pelo scanner Affymetrix 3000 (Affymetrix)
2.9 Gene análise de expressão
software GeneSpring (versão 12.5; Agilent Technologies). Foi usada para completar a expressão do gene análise. genes diferencialmente expressos (DEG) foram identificados utilizando a mudança de dobragem, bem como cálculos de valor de P. O limiar para a selecção de genes expressos diferencialmente era uma mudança vezes 2,0 e um valor de P 0,05. KEGG e análise GO foram realizados para determinar as vias e GO termos associados com mRNAs expressos diferencialmente. Agrupamento hierárquico (HCL) foi realizada para apresentar padrão de expressão do gene distinguíveis “entre amostras.
2.10 Análise da expressão de mRNA de degs por qRT-PCR
Para verificar os resultados de microarray, doze expressa de forma diferente genes foram escolhidos para a validação de qRT-PCR, utilizando um kit de SYBR Green MIX (Promega, EUA) e um sistema 7500 de PCR em tempo real RÁPIDO seguindo as instruções do fabricante, usingβ-actina como um controlo interno. quantificação comparativo foi determinada pelo método de cálculo 2-ΔΔCt. Os genes candidatos gene andβ-actina foram amplificados na mesma reacção e realizada em triplicado. sequências iniciadoras de PCR foram listados na Tabela 2.
2.11 Proteína de extracção e Western blot
de proteína celular total foi extraído de células transfectadas e a concentração de proteína foi determinada utilizando um kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime, Pequim , China). Estas amostras de proteína foram resolvidos em gel de poliacrilamida SDS a 10% desnaturado e transferido para membranas de PVDF com um tamanho de poro de 0,45 um (Millipore, Billerica, MA, EUA). Após bloqueio em 5% de leite desnatado em Tris-base salino-Tween 20 (TBST) durante 60 minutos à temperatura ambiente, as membranas foram incubadas com anticorpos anti-humano de rato /coelho em diluições recomendadas pelo fabricante [ADAMTS1 e MMP19 a uma diluição de 1: 1000, MMP13 a 1: 500 (todos da Abcam, Cambridge, MA, EUA)] durante a noite a 4 ° C. Depois de lavadas em TBST, as membranas foram incubadas adicionalmente com um anti-murganho secundário (1: 2500) ou anti-coelho (1: 10000) durante 1 h anticorpo. quimioluminescência aumentada (ECL) foi adicionada solução sobre as membranas e a expressão da proteína foi quantificada utilizando o Laboratório de trabalho Aquisição de Imagem e software de análise (UVP, Upland, CA, EUA). Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi utilizada como um controlo de carga.
2,12 estatística A análise
Todos os dados foram expressos como média ± DP. As diferenças entre dois grupos foram avaliados utilizando o teste exato de Fisher ou
t
teste de Student, enquanto diferença entre vários grupos foi analisada utilizando-se ANOVA seguida pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni. genes diferencialmente expressos após knockdown de malat-1 expressão foram avaliados usando cDNA microarray (Affymetrix HTA 2.0), identificadas como alterações de dobra e analisados utilizando
t
teste de Student. p . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
3.1 A expressão diferencial de malat 1-mRNA em amostras de tecido de cancro do ovário
malat-1 expressão do mRNA no controle ovário normal e tecidos de cancro do ovário primários foi avaliada por qRT-PCR e normalizados para um controlo interno (β-actina). Expressão de malat-1 em tecidos de cancro do ovário é significativamente maior do que o de em células de ovário normal (Figura 1). Além disso, malat-1 expressão é significativamente associada com os estágios da FIGO, mas nenhuma associação foi identificada entre malat-1 expressão e idade, tipo histológico, grau, ou a presença de ascite (Tabela 1). Estes dados sugerem que o elevado nível de expressão malat-1 foi associada com a progressão do cancro do ovário.
malat-1 é significativamente mais elevada expressão em tecidos de cancro do ovário. *
p Art 0,05.
3.2 malat-1 estão associados com a proliferação, migração e invasão de células de cancro do ovário
Em seguida, construímos quatro shRNAs segmentação malat-1. shRNA3 foi o mais eficaz em silenciar malat-1 em células OVCAR3 (Fig 2A). Portanto, nós utilizamos este shRNA em todas as experiências seguintes. Malat-1 knockdown reduziu significativamente a proliferação de células de cancro do ovário começando no dia 2 atingir os mais altos níveis de dia 5 (Fig 3A). Além disso, malat-1 knockdown também suprimiu significativamente a migração OVCAR3 e capacidade de invasão (Figura 3C e 3E). SKOV3 foi altamente expressa por transfectadas por pcDNA3.1 (+) -. Malat-1 e a regulação positiva de malat-1 induzida SKOV3 proliferação, migração e invasão (Figura 3B e 3D e 3F)
(A) qRT- análise de PCR de malat-1 seguinte expressão shRNA knockdown. células OVCAR3 foram cultivadas e transfectadas com quatro malat-1 diferentes vectores (shRNA shM1 para shM4) e depois sujeito a análise de qRT-PCR. *
p Art . 0,05 versus os grupos de controlo de células (B) SKOV3 foram cultivadas e transfectadas com pcDNA3.1 (+) – 1-malat e pcDNA3.1 (NC) e submetido a análise de qRT-PCR, *
P
0,05 contra grupos de controlo.
(A) e (B) A proliferação celular CCK-8 ensaio. células cancerosas do ovário foram cultivadas e transfectadas e, em seguida, submetido a CCK-8 de ensaio. *
p Art 0,05 contra grupos de controlo. (C) e ensaio de migração de células (D) Transwell tumor. células cancerosas do ovário foram cultivadas e transfectadas e, em seguida, submetido a Transwell ensaio de migração de células de tumor. (E) e ensaio de invasão de células (F) Transwell tumor. células cancerosas do ovário foram cultivadas e transfectadas e, em seguida, submetido a ensaio de invasão de células tumorais Transwell **
P
0,0001 contra grupos de controlo.
3.3 Knockdown de malat-1 expressão induz ciclo celular apoptose e prisões em G0 /G1 fase
Porque knockdown de malat-1 inibiu a proliferação de células (Fig 3A ), que analisou, em seguida malat-1 função na regulação da progressão do ciclo celular de cancro do ovário e apoptose. Os nossos dados demonstraram que as células apoptóticas em células OVCAR3-shM3 foram marcadamente aumentada para 17,8%, em comparação com 0,03% nas células OVCAR3-SHNC e 0,02% nas células parentais OVCAR3 (p 0,001, Figura 4A e 4C). Além disso, a análise do ciclo celular por citometria de fluxo demonstraram que o knockdown de malat-1 expressão presos as células OVCAR3-shM3 no Ir fase /G1 do ciclo celular e as percentagens de células em S e G2 /M fases foram também diminuiu (P 0,05, Figura 4B e 4D). Estes dados sugerem que o efeito inibitório de um knockdown malat-OVCAR3 na proliferação e crescimento pode ser causada pela paragem do ciclo celular e aumento da apoptose.
(A) Queda de malat-1 levou a apoptose de células tumorais. células OVCAR3 transfectadas com malat-1 shM3 foram analisadas por citometria de fluxo para a apoptose. (B) Knockdown de malat-1 levou à interrupção do ciclo celular. células OVCAR3 transfectadas com malat-1 shRNA3 foram analisados por análise de citometria de fluxo para a distribuição do ciclo celular. (C) A quantificação dos dados em A. *** p 0,0001 versus controlos. (D) A quantificação dos dados em B, * p 0,05 versus controles.
3.4 regulação negativa do malat-1 afeta a expressão de um grande número de genes
Os perfis de células OVCAR3-shM3 OVCAR3-SHNC e de expressão de genes foram analisados por análise de microarray, e 449 genes expressos diferencialmente significativamente ( 2 vezes) foram identificadas. Entre eles, 206 genes foram regulados negativamente, enquanto que 243 genes foram supra-regulados em células de cancro do ovário com shRNA mediada malat -1-silenciamento em comparação com o controlo de células OVCAR3. Uma lista distinta de genes são regulados por malat-1 como demonstrado por agrupamento hierárquico não supervisionado (Fig 5A). Nós, então, realizada qRT-PCR para 12 selecionados aleatoriamente genesto confirmar os resultados de microarray. Os resultados qRT-PCR são altamente comparável com os resultados da análise de cDNA microarray, em que
FRK
,
MUC16
,
MAP2K6
,
FXYD3
,
FDCSP
,
MAOB
,
GBP2
, e
TNFSF10
foram jusante regulada,
NEXN
,
TSPAN2
,
ANKRD1
, e
BHLHE41
foram regulados positivamente em células OVCAR3-shM3 em comparação com as células SHNC (Fig 6). Além disso, GO e análise KEGG enriquecimento dos genes mais para cima e para baixo-reguladas, respectivamente, identificado significativamente as funções sobre-representados destacando um papel de malat -1 relativa à invasão e metástase de células de cancro do ovário. Além disso Regul ção da transcrição, regulação positiva de proliferação celular, ciclo celular, crescimento celular e adesão celular por MAPK sinalização ou P53 vias de sinalização foram afectados por malat-1. (S1-S4 Figs).
não supervisionada hierárquica análise de agrupamento dos perfis de expressão global de genes diferencialmente expressos. Coluna representa sampl e linha representa gene, o verde representa a expressão do gene nível inferior e vermelha representa um parente maior da expressão do gene.
O gráfico mostrou a diferença média vezes, FRK, MUC16, MAP2K6, FXYD3 , FDCSP, MAOB, GBP2, TNFSF10 foram regulados negativamente, NEXN, TSPAN2, NKRD1, BHLHE41 foram regulados positivamente em células OVCAR3-shM3. (P 0,05)
3.5 malat-1 pode envolvidos no cancro do ovário, regulando a expressão de
MMP13
,
MMP19
,
ADAMTS1
degs Entre estes, 79 genes foram significativamente regulada para cima ou para baixo-regulado por, pelo menos, de três vezes. De acordo com os estudos anteriores,
MMP19
,
ADAMTS1
e
MMP13
genes estão intimamente associado com a metástase e desenvolvimento de tumores malignos. Nós, então, realizada qRT-PCR e Western blot para confirmar a expressão de
MMP19
,
ADAMTS1
e
MMP13
genes entre as células OVCAR3-SHNC OVCAR3-shM3 e. A expressão de ARNm de
MMP13
é regulada negativamente em células shM3, enquanto a expressão de
MMP19 e ADAMTS1
foi aumentada (P ** 0,01, Figura 7A). A expressão proteica foi consistente com resultados de ARNm (Figura 7B). Supressão de malat-1 resultou em downregulating a expressão de
MMP13 Comprar e up-regulação da expressão de genes
MMP19 e ADAMTS1
, indicando que malat-1 pode envolvidos no cancro do ovário através da regulação da expressão da expressão de mRNA
MMP13
,
MMP19
,
e ADAMTS1
genes.
(a) de ADAMTS1, MMP13 e MMP19 são regulados por malat -1. * P 0,05 versus os grupos de controlo. (B) a expressão da proteína ADAMTS1, MMP13, MMP19 e são alteradas como resultado da malat-1 knockdown. (C) Quantificação de B. * p 0,05 versus o controlo.
Discussão
no genoma humano, os dados de sequenciação de ADN demonstrou que, apesar de milhares de genes não têm a capacidade de codificação da proteína, que poderia desempenhar papéis importantes, no entanto, na regulação o crescimento celular, sobrevivência, apoptose, e tumorigénese [6]. RNA não-codificante podem ser classificados de acordo com seu tamanho em miRNAs (22 nt), piRNAs (18-30 nt), RNAs translacionais-regulação curtos (100-200nt), e muito mais ncRNAs (até 10.000 nt) [17] . O ARN não codificante de comprimento com um comprimento de 200 nt ganhou atenção significativa nos últimos tempos. No presente estudo, nós examinamos malat-1 expressão em tecidos câncer epitelial de ovário e investigou o papel da malat-1 na regulação da migração de células tumorais e invasão in vitro. Descobrimos que malat-1 mRNA foi overexpressed no tumor tissuesand malat-1 expressão foi associada com a progressão do câncer de ovário. Knockdown de malat-1 expressão suprimiu a proliferação de células de tumor, a migração e a invasão, as células presas na fase G0 /G1 do ciclo celular e a apoptose induzida. Nós ainda identificados 79 genes cuja expressão foi alterada significativamente ( 3 vezes) seguintes malat-1 knockdown. Curiosamente, três desses genes,
MMP19
,
ADAMTS1
, e
MMP13
, foram previamente implicado na regulação da angiogênese, matriz extra-celular, adesão celular, e progressão do câncer. Assim, nossos dados sugerem que a superexpressão de malat-1 pode promover a progressão do câncer de ovário, regulando a expressão de
MMP19
,
ADAMTS1
e
MMP13
genes.
a metástase é a principal causa de mortalidade em pacientes com câncer. O mecanismo subjacente para a metástase do tumor e recorrência é muito complexo, incluindo a adesão tumor de células, invasão, intravasation, circulação, extravasamento, e crescimento em organizações distantes [18]. As alterações nas vias de sinalização intracelular que controlam a proliferação celular e a apoptose, assim como a secreção extracelular das proteínas que estão envolvidas na adesão celular, migração, e a proteólise são de primordial importância para a metástase do cancro [19]. Recentemente, a função de ARN não codificante, tal como malat-1, durante a metástase está começando a ser apreciado [8, 14]. Em neoplasias malignas ginecológicas, cancro do ovário é geralmente diagnosticado como uma doença metastática. Nosso estudo demonstra que a regulação positiva de malat-1 está associada com a progressão do câncer de ovário. De facto, estudos anteriores mostraram que malat-1 foi significativamente sobre-regulada em diversos tipos de cancros, incluindo o pulmão, fígado, pancreático, e cancros da próstata. Além disso, malat-1 tem servido como um metastático e recorrência biomarcador para o câncer de pulmão de não pequenas células e câncer hepatocelular [15]. No entanto, são necessários estudos futuros com maior tamanho da amostra para confirmar nossos resultados.
Estudos anteriores mostraram que as células tumorais foram capazes de produzir fatores que induzem a angiogênese do tumor, bem como metaloproteinases e moléculas relacionadas a degradar a matriz extracelular [20 ]. O nosso estudo mostrou malat-1 knockdown modulada a expressão de MMP13 e MMP19, membros da família da metaloproteinase de matriz (MMP) de proteínas que estão envolvidas no metabolismo alterado da matriz extracelular, a progressão tumoral e metástase [21, 22]. Alguns estudos anteriores mostraram que a MMP13 é anormalmente expresso em alguns tumores sólidos, tais como o carcinoma da tiróide papilar e cancro colo-rectal e está associada com a progressão e metástase [23,24]. Em contraste, MMP19, que apresenta características estruturais únicas, desempenha um papel duplo em tecidos. Por um lado, a deficiência de MMP19 aumentou a resposta angiogénica precoce, agindo como um regulador negativo da invasão. No entanto, a MMP-19, que é regulado em vários tecidos de cancro, facilita a invasão tumoral [25]. Consistente com a eficácia anti-angiogénico de MMP19, vários relatórios demonstraram que metalopeptidase com trombospondina Tipo-1 motivo (ADAMTS1), o qual foi regulado para cima em células malat-1-silenciamento para inibir a angiogénese [26-28]
, e diminuição ADAMTS1 estimulou a migração e invasão de células de cancro da mama [29].
Até o momento, não há relato implicando malat-1 na regulação de MMPs ou expressão ADAMTS1 no câncer de ovário. No entanto, com base em nossos dados atuais, a hipótese de que a eficácia da malat-1 para promover a progressão do câncer de ovário pode ser mediada pelo aumento da regulação do MMP13 e para baixo-regulação da MMP19 e ADAMTS1.
Para elucidar ainda mais a mecanismos moleculares de metástases induzida malat-1, foram identificados genes regulados por malat-1 expressão, comparando shRNA inibido contra células de cancro do ovário de controle. Uma maior exploração dos genes-alvo e via de sinalização irá fornecer novos insights sobre os mecanismos moleculares de malat-1 envolvidos na progressão do câncer de ovário e vai ajudar na construção de uma previsão e prevenção regra mais forte no cancro do ovário.
Informações de Suporte
S1 Fig. GO análise de enriquecimento do processo biológico de genes up-regulamentados e para baixo-regulados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0155250.s001
(JPG)
S2 Fig. GO análise enriquecimento do componente celular dos transcritos up-regulamentados e para baixo-regulados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0155250.s002
(JPG)
S3 Fig. GO análise de enriquecimento de funções moleculares de up-regulamentada e regulada transcrições
doi:. 10.1371 /journal.pone.0155250.s003
(JPG)
S4 Fig. análise de enriquecimento KEGG (análise de caminho)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0155250.s004
(JPG)
Reconhecimentos
Agradecemos Jiachun Lv para o conselho útil com experimentos .