Abstract

Fundo

Duas moléculas de sinalização que são atraentes para terapia-alvo são o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e do gamma PPAR (PPAR). Nós investigamos possível interferência entre estes 2 vias, particularmente à luz da recente evidência implicando PPAR para a terapia anticâncer.

principais conclusões

Como avaliadas por ensaios de MTT, gefitinib (inibidor EGFR) e DIM- C (PPARy agonista) inibiu o crescimento de linhas celulares de cancro da bexiga 9 de um modo dependente da dose, mas com sensibilidade variável. Além disso, a combinação de tratamento com gefitinib e DIM-C demonstraram inibição máxima da proliferação de células em comparação com cada fármaco isolado. Estas conclusões foram confirmadas

in vivo

, onde a terapia de combinação do crescimento do tumor maximamente inibida em contraste com somente cada tratamento em relação ao controle (p 0,04). A indução de expressão de PPARy juntamente com acumulação nuclear foi observada em resposta a concentrações crescentes de gefitinib através da activação do factor de transcrição CCAT /proteína de ligação a β-intensificador (CEBP-β). Nessas linhas celulares, DIM-C linhas celulares de cancro da bexiga significativamente sensibilizadas que eram resistentes à inibição EGFR de um modo específico do cronograma.

Conclusão

Estes resultados sugerem que PPAR agonista DIM-C pode ser uma excelente alternativa para a bexiga tumores resistentes à inibição EGFR e eficácia combinação pode ser alcançada de uma forma específica do cronograma

Citation:. Mansure JJ, Nassim R, S Chevalier, Szymanski K, Rocha J, Aldousari S, et ai. (2013) um novo mecanismo de PPAR gama de indução via EGFR Sinalização Constitui Rational para a terapia combinada em cancro de bexiga. PLoS ONE 8 (2): e55997. doi: 10.1371 /journal.pone.0055997

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 21 Setembro, 2012; Aceito: 03 de janeiro de 2013; Publicação: 08 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Mansure et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Sociedade de Pesquisa do Câncer. (https://www.src-crs.ca/en-CA) W. Kassouf é um destinatário de um prêmio clínica pesquisadora do FRSQ. (https://www.frsq.gouv.qc.ca/en/index.shtml). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Quase todos os pacientes com metastático sucumbem câncer de bexiga à doença, com sobrevida média de 18 meses, mesmo com os melhores esquemas quimioterápicos disponíveis. Como a compreensão da biologia do carcinoma urotelial (UC) melhora, novas abordagens precisam ser estudadas. Duas moléculas de sinalização que são atraentes para terapia-alvo são o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e os γ PPAR (PPARy). A inibição da função de EGFR é extremamente atraente entre o vasto leque de alvos biológicos implicados no carcinoma urotelial (UC) progressão. Embora mecanismo pelo qual o EGFR regula a biologia do tumor no cancro da bexiga não está claramente definida, foi demonstrado que a sinalização de EGFR regula a sobrevivência celular, a proliferação, diferenciação, invasão e [1]. Além disso, o EGFR está implicada na angiogénese e metástase [2] induzida por tumor. No entanto, os ensaios clínicos com inibidores de EGFR em cabeça e pescoço, pulmão e câncer de cólon demonstrou que apenas uma minoria dos pacientes parecia beneficiar dessa abordagem. No contexto das células cancerosas não pequenas do pulmão (NSCLC), foi mostrado que as respostas clínicas foram ligados a activação de mutações dentro do domínio de tirosina-cinase EGFR, o que sugere que a melhor compreensão dos efeitos biológicos dos inibidores de EGFR em cancro irá ajudar a identificar tumores que respondem a terapia [3], [4]. Embora nenhuma das 17 linhas de células humanas UC nem qualquer um dos 75 tumores primários avaliados em M.D. Anderson Cancer Center de activação continha mutações no domínio de cinase de EGFR [5], inibidores de EGFR bloquearam a progressão do ciclo celular em linhas de células 6/17 de UC. Mostrámos que a alta expressão de EGFR é associada com um fenótipo agressivo [6] e que a modulação da GSK-3β pode ser um indicador de resposta aos inibidores de EGFR em cancro [7] bexiga. Nós acreditamos que EGFR permanece um forte eixo de sinalização na progressão do câncer de bexiga, onde a sua inibição pode beneficiar pacientes selecionados.

Outro receptor de interesse é PPAR, um receptor activado pelo ligando e um membro da superfamília de receptores nucleares de factores de transcrição [8], [9]. Importante, PPAR desempenha um papel importante na carcinogênese. PPARy é altamente expressa em amostras de tumores de diferentes sites, incluindo o cancro da bexiga (revisto em referência [10]). PPAR é um alvo interessante para terapia de câncer, não só por causa de sua expressão elevada em tumores, mas também porque PPAR ativação resulta na proliferação celular diminuiu, diminuiu G

0 /G

1 a S progressão fase, o aumento da diferenciação terminal, e apoptose [11], [12], [13]. Além disso, os agonistas PPAR são potentes inibidores da angiogénese

in vitro

e

in vivo

, em parte devido à regulação baixa de VEGF [14], [15]. Recentemente, uma nova classe de agonistas de PPARy, 1,1-bis (3′-indolil) -1 – (

p fenilo substituído com

) metanos (PPARy-activo DIM-Cs), tem sido desenvolvidos e apresentados ao ser significativamente mais potente do que a geração anterior de drogas. Nós publicou o primeiro relatório sobre a atividade anti-tumorigénica significativo de PPAR-ativa DIM-Cs em células UC

in vitro

e

in vivo

[16]. Uso de potentes PPAR-ativa DIM-Cs era atraente e garante uma avaliação mais aprofundada no tratamento da UC.

Um estudo anterior mostrou que os agonistas PPAR aumentar a atividade antitumoral de gefitinib, possivelmente mediado por indução da expressão de PTEN

em vitro

[17]. Além disso, a curcumina foi mostrado para induzir a expressão de PPARy e inibir a proliferação de células estreladas hepáticas [18]. Outros mostraram que a curcumina pode também inibir a activação de EGFR e esses achados corroboram ainda mais a interferência potencial entre os dois eixos de sinalização de interesse.

O objetivo deste estudo é investigar a interferência entre estes dois eixos de sinalização como eles compartilham alguns efetores sinalização a jusante comuns e avaliar se a combinação dos agonista PPAR e um inibidor EGFR pode superar a resistência à terapia EGFR no cancro da bexiga.

Materiais e Métodos

Cultura de células

a UC a linha celular 253J BV foi gerado a partir da linha celular de UC 253J humana como descrito anteriormente [19] e foi gentilmente fornecido pelo Dr. Colin PN Dinney da M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas. A série UM-UC de linhas de células de carcinoma urotelial utilizados neste estudo foram genotipicamente caracterizados e fornecido pelo Specimen núcleo do geniturinário Programas Especializados de Investigação de Excelência no cancro da bexiga no MD Anderson Cancer Center [20].

Drugs

Gefitinib (Iressa ZD1839) foi fornecido pela AstraZeneca, Londres, Reino Unido) ea via oral disponíveis PPAR-ativa DIM-C foi generosamente fornecidos pelo Dr. S. Seguro, Houston, TX pó seco.

celular Ensaio de Proliferação

células cancerosas da bexiga foram tratadas com diferentes concentrações de gefitinib (0,001 uM a 100 uM) e DIM-C (0,01 uM a 10 uM) em EMEM suplementado com de 10% de FBS durante 48 A proliferação celular foi avaliada utilizando Hs ensaios MTT (Sigma-Aldrich, Canadá). O valor GI 50 foi definido como a concentração média de fármaco que gerou 50% de inibição do crescimento.

Análise Western Blot

As células foram colhidas em -75% a 80% de confluência em tampão de lise (RIPA ) e um cocktail de inibidores de fosfatase e protease (Roche Diagnostics, Alemanha). As proteínas foram sujeitas a SDS-PAGE, transferidos para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA) por electrotransferência semi-seco. Os anticorpos monoclonais primários [Receptor de EGF (15F8), a tubulina e de b-actina (Cell Signaling Technology, Nova Inglaterra, MA)] e PPARy (sc-7273, Santa Cruz Biotechnology, Califórnia, EUA) foram aplicadas para detectar as bandas de interesse. Além disso, foram utilizados os seguintes anticorpos de coelho de sinalização celular: Akt; fosfo-Akt (Ser473); A GSK-3β; fosfo-GSK-3β (Ser9); p21 WAF1 /Cip1; p44-42 MAPK (ERK1 /2); fósforo-p44 /42 MAPK (ERK1 /2). As imunoglobulinas anti-coelho e anti-IgG de ratinho () acoplados a HRP /rábano foram utilizados como anticorpos secundários de acordo com o anticorpo primário.

Imunofluorescência

Células cultivadas em oito poços de plástico câmaras foram lavadas em gelo com PBS frio contendo inibidores de protease (Roche Diagnostics, Alemanha) e fixadas com paraformaldeído a 3,7%. As células foram incubadas com diferentes concentrações de gefitinib (0, 2, 4 e 8 uM) durante 24 hs e, em seguida, incubadas com o anticorpo primário monoclonal de ratinho PPARy (01:50) durante a noite. Imunofluorescência foi revelada utilizando anticorpos anti-ratinho acoplados a FITC (Alexa Fluor 488) ou rodamina (CY3; Invitrogen). 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) foi utilizado para corar os núcleos. Fotomicrografias foram tiradas com um invertido Olympus IX-81 microscópio equipado com uma câmera digital CoolSnap HQ eo ImagePro + software (versão 5.0.1; Media Cybernetics).

Isolamento RNA e Real Time PCR

o ARN total foi extraído a partir de células usando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. A síntese de cDNA foi realizada utilizando o Kit de Transcrição Reversa Quantitec (Qiagen, Mississauga, ON). Para a amplificação por RT-PCR, foram utilizados os iniciadores validados de Qiagen (Hs_CEBPB_2_SG QuantiTect Primer Ensaio QT00998494). Não há contaminação de ADN genómico ou pseudogenes foram detectadas por PCR, sem o passo de transcrição inversa no ARN total usado. β actina foi utilizado como um controlo interno. As reacções começou a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 20 s. Picos de fusão dos produtos de PCR foram determinadas por calor desnaturação ao longo de um gradiente de temperatura de 35 ° C a 0,2 ° C /s dos 60 aos 95 ° C. Os números do ciclo que cruzam um limite arbitrário (

C t

) foram determinados utilizando MyIQ software do sistema, a versão 1.0.410 (BioRad, CA, EUA). Dobre mudança no mRNA-alvo em relação a p actina foi calculado da seguinte forma: Dobre a mudança = 2

-ΔΔ

C

t onde ΔΔ

C

t = (

C

t

alvo –

C

t β actina)

tempo

X Restaurant – (

C

t

alvo –

C

t β actina)

tempo 0 tempo

X

é ponto de tempo após 3 hs gefitinib. Tempo 0 representa o tempo da experiência de partida (sem fármaco adicionado).

xenoenxertos tumorais de bexiga

ratinhos nus fêmea (adquiridos a Charles Rivers, Wilmington, MA) foram injectados subcutaneamente com células KU-7 (10

6 células por injecção). Animais de cada série (10 ratos por grupo) foram randomizados e atribuído ao tratamento e um placebo braços. DIM-C foi dada 60 mg /kg, 3 vezes por semana e gefitinib foram administrados 2 mg /dia, 5 vezes por semana. Todos os fármacos e o placebo foram administrados por gavagem oral. O tratamento foi continuado durante 4 semanas e, subsequentemente, os tumores foram colhidos e pesados. Os tumores foram congeladas em nitrogênio líquido para posterior análise.

Este estudo foi realizado seguindo os Procedimentos Operacionais Padrão para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Comitê Animal Care da Universidade McGill. O protocolo foi aprovado pelo Comitê Animal Care da Research McGill University Health Center (Permit Number: 5428) Facility. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Imunohistoquímica

Cortes seriados de xenoenxertos de tumores de camundongos tratados com o tratamento combinado placebo e (gefitinib mais DIM-C ) foram incubadas durante a noite a 4 ° C, com anticorpos específicos primários contra PPARy (sc-7273 de IgG monoclonal de ratinho

uma diluição de anticorpo 1:1000, Santa Cruz, CA, EUA), p21 (anticorpo de coelho 12D1 1:100 diluição, sinalização celular, MA, EUA). Foi adicionado policlonal de cabra anti-coelho IgG de anticorpo secundário, conjugado com HRP e incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente. O desenvolvimento da cor foi realizado com o substrato DAB (Sigma Aldrich, Canadá), de acordo com as instruções do fabricante. A imunocoloração foi avaliada por um método semi-quantitativo com base na média de cinco focos na percentagem de células viáveis ​​que mostram expressão positiva. As amostras foram classificadas com base na intensidade de coloração nuclear e citoplasmática anticorpo em cada lâmina. Os valores foram comparadas pelo teste t de Student não pareado.

Análise Microarray

tumores de bexiga xenotransplantes, foram setorizadas coradas pela hematoxilina e eosina e os tumores foram mapeados para um maior isolamento. O ARN total foi extraído como descrito anteriormente. O ARN foi quantificado utilizando um espectrofotómetro NanoDrop-ND1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) e a qualidade foi monitorizada com o Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Genome Quebec Innovation Center, CA). análises de microarray foram realizados na Universidade McGill e Genome Quebec Innovation Center, usando a tecnologia de Illumina BeadArray ™. O HumanHT-12 Expressão BeadChip ™ foi usada e continha mais de 22.000 sondas a partir da base de dados RefSeq NCBI, o que proporciona uma maior taxa de transferência de processamento de 12 amostras por chip. Há uma cobertura de 99,99% de todos os tipos de grânulo em qualquer dado HumanHT-12. A amplificação de ARN TotalPrep kit da Ambion foi usado para realizar um ciclo de amplificação 50-500 ng de ARN total. A síntese de cDNA e

in vitro

amplificação de transcrição foram seguidas de hibridização. Os BeadChips foram fotografadas usando o leitor BeadArray ou iScan da Illumina. A análise estatística e visualização de dados de microarrays experimentos foi realizada utilizando o software pacote FlexArray versão 1.6 desenvolvido e fornecido pela Genome Quebec. análises via funcionais e de sinalização foram avaliados utilizando software Ingenuity Pathway Analysis (IPA).

Análise Estatística

Todos os dados foram analisados ​​usando a versão STATA 10,0 software. Os resultados de

in vivo

foram comparados por meio de medidas repetidas análise de variância e teste exato de Fischer. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Expressão da linha de base de PPAR e EGFR em um painel de linhas celulares urotelial Carcinoma

Temos relatado anteriormente que a inibição da. EGFR eixo de sinalização e activação de PPARy eixo são ambos eficazes na inibição significativa da proliferação de células de carcinoma humano através de diferentes vias, em parte convergentes para PI3K /Akt, ciclina D1, e inibidores de quinase dependente de ciclina [7], [16]. Em nosso trabalho anterior, mostramos expressão significativa dos membros da sua família através de várias linhas de células UC [7]. Para investigar ainda mais para a interacção entre os dois eixos de sinalização, primeiro rastreadas para caracterizar os níveis de expressão do EGFR e PPARy através de um painel de 9 linhas de células de UC. Como revelado na Figura 1, A, todas as linhas celulares testadas expressaram vários níveis de EGFR, e PPARy. Nós não demonstrou uma correlação entre os níveis basais de expressão e estágio da doença da qual as 9 linhas de células foram derivadas (de superficial a invasiva para metastático). Nós também determinaram a resposta à dose de entre as linhas celulares de carcinoma urotelial (UM-UC1, UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, UM-UC13, RT4, 253JP, 253J-BV, KU7) a diferentes concentrações de EGFR inibidor (gefitinib) e PPAR agonista (DIM-C) após 72 hs de tratamento (Figura 1 B). Fomos capazes de estratificar várias linhas de células UC vão desde altamente sensível a relativamente resistentes à inibição EGFR, enquanto não foram observadas alterações significativas para justificar uma estratificação em resposta a DIM-C. De nota, UC5, a linha de células mais sensíveis a gefitinib, é diferente do resto das linhas de células, uma vez que contém a amplificação do gene de EGFR.

(A) Expressão de PPARy e EGFR em relação aos níveis endógenos de β- actina e tubulina, respectivamente, e representada em unidades de entre linhas celulares de cancro da bexiga 9 reflectindo diferentes fases da doença (de superficial a invasiva nenhuma metástase, invasão e metástase linfático). (B) Dose-resposta de linhas celulares de cancro da bexiga para PPAR agonista (DIM-C) e inibidor EGFR (gefitinib). O valor GI50 foi definida como a concentração média de droga que gera 50% de inibição de crescimento em comparação com controles.

Efeitos da Combined EGFR inibidores e PPAR agonistas Terapia

Nós investigamos a efeitos antiproliferativos de terapia combinada, gefitinib e DIM-C, em comparação com cada fármaco sozinho no crescimento de células de câncer de bexiga

in vitro

. O crescimento e a proliferação celular foram monitorizados por ensaios MTT e conduzida em duas linhas de células resistentes relativamente-EGFR (KU7 e UM-UC13). As células foram tratadas durante 72 hs e utilizado uma proporção fixa de diferentes fracções de GI50 (0,25, 0,5, 1,0 e 2,0) de cada fármaco isoladamente acordo com o método efeito mediano. A inibição máxima da proliferação de células foi demonstrada no tratamento combinado em comparação com qualquer um dos fármacos sozinhos (Figura 2). DIM-C tornou as células resistentes sensíveis à inibição EGFR.

O crescimento foi monitorizado por ensaios de MTT. As células foram tratadas com 5 uM de gefitinib e DIM-C 3 uM e em comparação com cada fármaco isolado. Vermelho: gefitinib; Amarelo: DIM-C; Blue: gefitinib + DIM-C

Efeito da combinação sobre a sinalização a jusante de EGFR e PTEN Expressão

A ligação de EGFR ao seu ligando leva à ativação de vários sinais, incluindo os Ras. /Raf /via mitogen-activated proteína quinase (MAPK) [21]. Por isso, nós investigamos o efeito de combinação no estado de fosforilação de p42 /44 MAPK (ERK1 /2). Como pode ser visto na Figura 3A, foi observada uma significativa desactivação curso de tempo da via ERK, em comparação com o controlo, entre as células tratadas com 5 uM de gefitinib e DIM-C 3 uM. Além disso, como mencionado anteriormente, a expressão de PTEN aumentos no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) tratados com os agonistas de PPARy, rosiglitazona [17]. Portanto, também investigamos o efeito do tratamento combinado na expressão de PTEN. Tal como mostrado na Figura 3B, foi observada nenhuma diferença na expressão de PTEN, em comparação com o controlo, quando as células foram tratadas com gefitinib combinadas e DIM-C durante 24 hs.

(A) padrão de fosforilação de p42 /44 MAPK (ERK1 /2) em células tratadas com gefitinib 5 mM e DIM-C 3 M para 5, 15 e 30 minutos. T0 é o controlo não tratado. Os lisados ​​de células inteiras foram imunotransferidas com phosho-p42 /44 MAPK e p42 /44 MAP. GAPDH foi usada como controlo de carga sobre a transferência de Western. (B) Comparação da expressão de PTEN em linhas de células tratadas com 5 uM de gefitinib e DIM-C 3 uM durante 24 hs. T0 é o controle sem tratamento.

Efeitos do tratamento na bexiga crescimento tumoral in vivo

Para avaliar se estes resultados podem ser traduzidos

in vivo

, ratinhos nus foram subcutaneamente inoculados com células de câncer de bexiga relativamente resistentes (células KU-7). Os ratinhos foram tratados com agentes alvo via sonda oral (PPARy-activo DIM-Cs receberam 60 mg /kg, 3 vezes por semana, gefitinib dada 2 mg /dia, 5 vezes por semana, ou ambos), durante 4 semanas. Como mostrado na Figura 4, os pesos dos tumores foram marcadamente reduzidas no grupo combinado em contraste com cada fármaco isoladamente quando comparado com o controlo (

P

0,02). Estes achados sugerem tratamento combinado tem uma melhor actividade anti-tumoral. Além disso, a expressão do gene profiling análise dos xenoenxertos de tumor da bexiga, mostraram que vários genes envolvidos no ciclo celular, morte celular, o crescimento e a proliferação celular foram expressos de forma diferente no grupo de tratamento combinado, em comparação com o grupo de controlo. (Tabela 1). Notavelmente, inibidor de quinase dependente de ciclina (CDKN1A ou p21), que funciona como um regulador da progressão do ciclo celular em G1, foi significativamente regulada positivamente (Fold mudança 2.6,

P

valor 0,02) e este foi validado pela imunohistoquímica mostrando maior percentagem de células positivas para p21 no braço combinado

in vivo

(66% vs 15%, p 0,001) (Figura 5A) bem como

in vitro

(Figura 5B) . Curiosamente, foi relatado que PPARy desempenha um papel importante mediar a expressão cascata dependente da diferenciação de inibidores de quinase dependentes de ciclina, proporcionando assim uma paragem do crescimento de acoplamento mecanismo molecular e diferenciação de adipócitos [22].

de crescimento de tumores de bexiga do grupo de tratamento de combinação em comparação ao braço de controlo (P 0,02). Dez ratinhos por grupo foram tratados com o placebo; DIM-C foi dada 60 mg /kg, 3 vezes por semana; Gefitinib foi dada 2 mg /dia, 5 vezes por semana. Todas as drogas foram administradas por gavagem oral. O tratamento foi continuado durante 4 semanas.

(A) imuno-histoquímica (IHC) para coloração de p21 em tecidos de tumor de xenoenxerto. Os ratinhos foram tratados com placebo ou com terapia de combinação (Gefitinib 2 mg /dia, 5 vezes por semana e DIM-C 60 mg /kg, 3 vezes por semana). Gráfico do lado direito representa a quantificação de células coradas positivamente. (B) a expressão in vitro de p21 em Western blot de células de lisados ​​tratados com gefitinib 5 mM e DIM-C 3 mM durante 24 hs. Gráfico no lado direito, representa quantificação da expressão p21 relacionadas com GAPDH.

EGFR Inibição Induz Expressão Gênica de PPARy em um Manner

dose-dependente

Foram avaliados o efeito de gefitinib em membros dos eixos de sinalização PPAR. Duas células resistentes (KU-7 e de UM-UC13) foram tratadas com diferentes concentrações de inibidor de EGFR durante 24 hs. expressão de PPARy foi determinada por análises de transferência de Western como previamente descrito. Como mostrado na Figura 6A, foi observada uma indução dramática de expressão de PPARy em ambas as linhas celulares, de um modo dependente da dose, seguido de inibição de EGFR. Curiosamente, uma acumulação nuclear de PPARy também foi observado após a sua sobre-regulação, que é, de facto, a forma activa do receptor. (Figura 6B). Estes resultados foram confirmados

In vivo

, como pode ser visto na Figura 7, que mostra a expressão de PPARy é maior entre os tumores de xenoenxertos tratados com gefitinib, em comparação com o grupo placebo. De nota, uma coloração nuclear foi também observada, sugerindo uma translocação nuclear PPARy após a indução da sua expressão.

(A) Fold aumento em relação ao controlo foi determinada após normalização com β-actina como controlo de carga externa. (B) regulação positiva e acumulação nuclear de PPAR após o tratamento com gefitinib (24 hs).

Graphic no nível mais baixo representa quantificação de células coloração positiva. Setas pretas indicam coloração nuclear.

A eficácia específica do Horário de Terapia combinada

Se as células são sensibilizados à inibição EGFR via indução da expressão de PPAR, em seguida, seria de esperar que a eficácia da terapia de combinação também pode ser significativamente afetada e melhorado por sequência de administração de gefitinib e DIM-C. Na verdade, observou-se efeito significativo sobre a proliferação entre três relativamente resistente e um linhas sensíveis celulares a gefitinib (Ku-7, UM-UC3; UM-UM13) quando as células foram pré-tratados com gefitinib por 24 hs para permitir a indução de PPAR expressão em comparação com quando as células foram exposição simultânea a gefitinib e DIM-C (Figura 8). Estes resultados sugerem fortemente PPAR agonista poderia sensibilizar significativamente linhas de células UC, particularmente aqueles que eram resistentes à inibição EGFR, de um modo específico do cronograma e proporcionar um excelente potencial para a terapia de combinação.

Três linhas de células relativamente resistentes a gefitinib (uM-UC3, uM-UC13, e KU-7) e sensível (uM-UC6). Crescimento (ensaios MTT) após o tratamento 48 horas. Gefitinib: 2 uM. DIM-C:. 2? M

C /EBP Expressão Após Gefitinib expressão induzida por PPAR

Evidências consideráveis ​​indica que CCAAT /beta proteína de ligação potenciador (C /EBP) atua como um activador transcricional de genes de PPARy [23], [24]. Esta crença é suportada pelo facto de que as extremidades proximal dos seus promotores possuem elementos reguladores C /EBP que são essenciais para a transactivação do promotor de PPARy transgenes-repórter. Aqui relatamos provas convincentes de que a indução sequencial de expressão de PPARy por inibição de EGFR é mediada por C /EBP p (Figura 9). Quando as células foram pré-tratadas com gefitinib nas mesmas concentrações utilizadas para induzir a expressão de PPARy, um aumento na C /EBP também foi observada sugerindo gefitinib induzida por PPARy expressão pode ser mediada por C /EBP p.

(A ) RT-PCR de células tratadas com gefitinib (B) Western blot da expressão CEBPβ ​​em KU-7 e as linhas celulares de UM-UC-13 em resposta a diferentes concentrações de gefitinib.

Discussão

Os resultados de um grande corpo de estudos pré-clínicos e clínicos sugerem que a segmentação EGFR representa uma contribuição significativa para a terapia do cancro. No entanto, a questão da resistência constitutiva em um grande número de pacientes e o desenvolvimento de resistência adquirida nos respondedores continua a ser um assunto de investigação inexplorado. a resistência da célula cancerosa a antagonistas de EGFR pode ser devido a várias razões, tais como alterações genéticas, que lhes permitam ter uma resistência intrínseca a drogas anticâncer. Além disso, várias alterações moleculares diferentes importantes nas vias de sinalização celular dependentes ou independentes de EGFR poderia ser responsável pelo desenvolvimento de resistência a esses inibidores. Por exemplo, temos mostrado anteriormente desacoplamento do EGFR com vias mitogénicas podem causar resistência a antagonistas de EGFR [7]. Atualmente, a terapia combinada se tornou um grande avanço no tratamento do câncer. Em uma gama de entidades tumorais, tal abordagem tem produzido resultados impressionantes. A terapia combinada de agonistas de PPARy e outros agentes tem sido demonstrado ser mais eficaz do que usar qualquer um dos agentes sozinho. [25], [26]. Em bexiga células cancerosas

in vitro Comprar e no tumor de bexiga

in vivo

, demonstramos que PPAR ativa DIM-Cs mostrou actividade anti-tumorigénica significativa e foram inibidores mais potentes do crescimento do câncer de bexiga quando comparado com rosiglitazona, o agonista de PPARy sintéticos actualmente utilizados [16]. Tomados em conjunto, combinado alvo de ambos EGFR e eixos PPAR pode revelar moléculas promissoras para atingir no cancro da bexiga. No entanto, os nossos resultados demonstraram que as linhas celulares de cancro urotelial humano exibir heterogeneidade acentuada para a sensibilidade a inibidores de EGFR. De grande interesse, os níveis de expressão do EGFR e PPARy variaram significativamente entre as diferentes linhas de células, mas não se correlacionou com a fase da doença (gama de papilar superficial para invasivo para tumores metastáticos). Além disso, esta correlação não foi perfeito, assim como para a sensibilidade, quer ao inibidor de EGFR ou agonista de PPARy com a excepção de UM-UC5 que mostra niveis elevados de expressão de EGFR e apresentam elevada sensibilidade aos inibidores de EGFR. Esses achados corroboram os resultados de outros grupos que relataram, em um painel de 17 linhas celulares de cancro da bexiga humanos, que, apesar da forte correlação entre gefitinib-responsividade, expressão de superfície EGFR e expressão da proteína p27Kip1 nas linhas mais responsivos, gefitinib-resposta não era tão firmemente ligada à superfície expressão do EGFR dentro do painel de linhas celulares como um todo [27]. Estes resultados são notáveis, mas permanecem claro se a expressão de linha de base poderia prever crescimento dependente de EGFR no cancro da bexiga. Por outro lado, quando duas linhas de células resistentes (KU-7 e de UM-UC13) foram tratados com proporção fixa de diferentes fracções de GI50 de cada fármaco isoladamente (gefitinib ou DIM-C), a terapia de combinação potencialmente exerce inibição aditiva da proliferação de células UC. Estes resultados forneceram uma visão mais aprofundada do potencial da terapia combinada para superar a resistência a uma ou outra droga sozinho, particularmente para inibidor EGFR. Com efeito, os nossos

In vivo

constatações, demonstrou positivamente os efeitos de inibidores de EGFR combinadas e agonistas PPARy sobre o crescimento de tumores uroteliais humanos. Na verdade, xenoenxertos de ratinhos nus com as células cancerosas da bexiga relativamente resistentes (células KU-7) mostrou um peso do tumor marcadamente reduzido no grupo combinado, em contraste com cada tratamento sozinho quando comparado com o controlo. Estes resultados indicam que as células ainda relativamente resistentes,

in vitro

, demonstrou sensibilidade

in vivo

no tratamento combinado, sugerindo agonista PPAR poderia potencialmente ser usado para sensibilizar linhas celulares de cancro da bexiga que eram resistentes ao inibição de EGFR.

recentemente, a curcumina foi mostrado para induzir a expressão de PPARy em células estreladas hepáticas e inibir a proliferação de células potencialmente

EGFR através

activação inibindo [28]. Neste estudo, Zhou et ai, relataram que a interrupção do PDGF e EGF vias de sinalização por curcumina, estimula a expressão do gene de PPARy em células hepáticas estreladas activadas (HSC), que conduz à redução no crescimento celular, incluindo a indução da paragem celular e apoptose . Da mesma forma, observou-se uma indução da expressão de PPAR mediante inibição da EGFR nas células resistentes KU-7 e UM-UC13. Este foi um resultado atraente, uma vez que a indução da expressão de PPARy foi observada de um modo dependente da dose, e foi seguido por uma acumulação nuclear de PPARy, que é, de facto, a forma funcional do receptor. Nosso romance observação reflete que a eficácia da terapia de combinação também pode ser significativamente afetada e melhorado pela administração sequencial de gefitinib e agonista PPAR. Na realidade, PPARy agonista marcadamente sensibilizados linhas celulares de cancro da bexiga, particularmente aqueles que eram resistentes à inibição de EGFR, de uma forma específica com o programado, sugerindo que pode ser uma excelente alternativa, quando as células são resistentes aos monoterapias acima mencionados. O mecanismo da indução da expressão do gene PPARy por gefitinib ainda não é clara. Durante a adipogénese, evidências consideráveis ​​indicam que CEBP /β actuar como um activador transcricional de genes de PPARy [23]. Esta crença é apoiada pelo facto de que os promotores proximais de PPARy possuem elementos reguladores C /EBP essenciais para a transactivação. Além disso, tem sido mostrado que CEBP /β é expressa, numa fase precoce, subsequentemente ao tratamento com indutores de diferenciação [29] seguido de expressão de PPARy. Com efeito, os nossos resultados mostram a inibição de EGFR expressão induzida CEBP /β e curiosamente, a sua regulação positiva também foi observada no estádio mais cedo após o tratamento com gefitinib, um processo muito semelhante à activação de genes adipog�icas durante a diferenciação, e que precede a indução da expressão do gene PPARy. No entanto, são necessários estudos futuros, a fim de determinar o papel directo de C /EBP na indução da expressão de PPARy mediada por gefitinib. Ao interpretar os resultados, é importante reconhecer as limitações dos estudos pré-clínicos.