Abstract

canais iônicos e fluxos de iões controlar muitos aspectos da homeostase do tecido. Durante a transformação oncogénica, funções críticas de canais de íons pode ser perturbada, mas tumores conservada fluxos de iões específicos continuam a ser definido. Aqui, utilizamos o ALDEOLA complexo proteína-lípido tumoricida como uma sonda para identificar os fluxos iónicos envolvidos na morte das células tumorais. Mostramos que HAMLET ativa uma corrente de cátions não selectivo, que atingiu uma magnitude de 2,74 ± 0,88 nA dentro de 1,43 ± 0,13 min da aplicação HAMLET. fluxos de iões rápidos foram essenciais para a morte de células de carcinoma induzido por HAMLET como inibidores (amiloride, BaCl

2), evitando as mudanças na livre Na celular

+ e K

+ concentrações também impediu passos essenciais que acompanham a morte de células de carcinoma , incluindo alterações na morfologia, a absorção, a transcrição global e activação da MAP quinase. Através de matrizes globais de análise de transcrição e de fosforilação, uma resposta p38 MAPK dependente forte fluxo de iões foi detectado e inibição da sinalização de p38 atrasou a morte induzida por HAMLET. As células saudáveis ​​e diferenciados eram resistentes ao desafio HAMLET, que foi acompanhado por imunidade inata em vez de p38-ativação. Os resultados sugerem, pela primeira vez, um mecanismo unificador para a iniciação do efeito letal ampla e rápida de ALDEOLA em células tumorais. Estes resultados são particularmente sensíveis tendo em vista a eficácia terapêutica documentada de Hamlet em estudos humanos e em modelos animais. Os resultados também sugerem que HAMLET oferece uma abordagem terapêutica em dois níveis, matando as células cancerosas enquanto estimula uma resposta imune inata em torno tecidos saudáveis ​​

Citation:. Tempestade P, Kjaer Klausen T, Trulsson M, Ho CS J, Dosnon H, Westergren T, et al. (2013) um mecanismo unificador para cancro morte celular através Ion Canal de ativação por HAMLET. PLoS ONE 8 (3): e58578. doi: 10.1371 /journal.pone.0058578

editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América

Recebido: 14 Agosto, 2012; Aceito: 06 de fevereiro de 2013; Publicação: 07 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tempestade et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela concessão da fundação Sharon D. Lund e da Sociedade americana de Câncer, Cancer Society sueco, da Faculdade de Medicina (Universidade de Lund), a Fundação Söderberg, a Fundação Segerfalk, a Anna-Lisa e Sven-Erik Lundgren Fundação de Pesquisa médica , a Fundação Wallenberg Knut e Alice, o Lund Cidade Jubileumsfond, o John e Augusta Persson Fundação para Pesquisa médica, o Stephens Fundação Maggie, a Fundação do Câncer Gunnar Nilsson, o Inga-Britt e Arne Lundberg Foundation, a Fundação HJ Forssman de Investigação médica e da Royal Society fisiográfica. O suporte também foi obtido a partir do Conselho Dinamarquês para Pesquisa Independente (ciências médicas). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: patentes HAMLET são detidos por HAMLET Pharma – uma empresa comercialmente inativo.. Os estudos descritos neste manuscrito não foram apoiadas por fontes comerciais /parcerias. Os autores registrou uma patente que contém informações relevantes para este papel. O número do pedido é WO 2012/069836. Os autores Confirmo que esta patente não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

Os canais iônicos são um pré-requisito para a função celular normal. Eles são altamente conservadas através da evolução, e são activados por uma grande variedade de sinais incluindo forças mecânicas, tensão, pH, interagir com a matriz e a actividade do receptor do factor de crescimento [1], [2], [3], [4], [5] , [6]. Como resultado, os canais iónicos celulares facilitar a adaptação a diferentes ambientes físicos, ajustando a proliferação e apoptose, o desenvolvimento de órgãos e homeostase. a activação dos canais de iões tem sido proposta para regular a actividade de cascatas de sinalização celulares essenciais, incluindo cinases p38 mitogen-activated proteína (MAPKs), hidrolases pequena guanina trifosfato (GTPases), o fosfatidil-inositol-3-quinase (PI3K) -Akt, NFκB- e Ca

2 + dependentes de vias de sinalização [7], [8]. Recentemente, a desregulação de canal iónico tem sido proposto para promover a transformação maligna também, tumorigénese e metástase, sugerindo um papel central dos canais de iões para o desenvolvimento do cancro. Na verdade, uma grande variedade de canais iônicos, incluindo Ca

2 +, K

+, Na

+ e Cl

– canais e canais de cátions não seletivos, têm sido implicados em vários aspectos de desenvolvimento de câncer (para revisões, ver [1], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]).

HAMLET (humana alfa-lactalbumina feita letal para as células de tumor) é o primeiro membro de uma nova família de moléculas tumoricidas com propriedades notáveis. Formado a partir parcialmente desdobrado α-lactalbumina e com ácido oleico como um componente integrante [16], [17], foi descoberto por ALDEOLA serendipismo quando se estuda a capacidade de leite humano para impedir as bactérias de se ligar a células hospedeiras. Cedo

in vitro

experiências mostraram que ALDEOLA exibe actividade anti-tumoral larga com um elevado grau de selectividade para o tumor [16], [17]. estudos terapêuticos posteriores em pacientes e em modelos animais confirmam HAMLET’s actividade tumoricida e seletividade relativa para tecido tumoral

in vivo

. tratamento ALDEOLA retardada e a progressão do tumor levou a um aumento de sobrevivência num modelo de xenoenxerto de glioblastoma rato sem evidência da morte celular no tecido saudável do cérebro [18]. ALDEOLA administração tópica removido ou reduzido o tamanho de papilomas da pele, como demonstrado utilizando um protocolo controlado por placebo com um dois anos de seguimento [19]. instilação local de Hamlet em pacientes com câncer de bexiga rapidamente matou as células tumorais sem efeitos tóxicos sobre os tecidos saudáveis ​​que cercam o tumor [20] e eficácia terapêutica de HAMLET foi demonstrada num modelo de cancro da bexiga de murino [21]. Recentemente, a administração HAMLET peroral mostrou terapêutica, bem como eficácia profilática contra o câncer de cólon em ratos mínimo de APC (GUT, no prelo).

A sensibilidade para HAMLET, pelo menos em parte, reflete o aumento da expressão do oncogene c-Myc e desregulado glicólise em células tumorais [22], mas as interacções de membrana específicos que iniciam o processo de morte celular induzida por ALDEOLA não foram definidos. As respostas celulares ao ALDEOLA são bastante rápida em comparação com os indutores de morte celular, como o ligando FAS ou TNF-α [23], o que implica um mecanismo mais imediata e geral para ALDEOLA detecção na membrana celular do que através da indução de apoptose extrínseca tradicional. Em estudos iniciais, foram detectados rápida Ca

2 + fluxos após a exposição de células tumorais para HAMLET [17], sugerindo que canais iônicos e /ou transportadores pode ser ativado. Recentemente, mudanças dramáticas na estrutura das membranas artificiais, livre de receptores e vesículas da membrana plasmática de células cancerosas têm sido observadas após HAMLET desafio [24]. Arredondado, vesículas definidos morfologia alterada de formas amorfas, reflectindo a formação de distensões de membrana longos com maior fluidez. Uma resposta similar a ALDEOLA foi observada em vesículas de membrana de plasma a partir de células de carcinoma, o que sugere que os efeitos directos da membrana pode contribuir para o efeito tumoricida de ALDEOLA. células diferenciadas normais não mostraram nenhuma evidência de perturbação da membrana [24], sugerindo que as perturbações de membrana pode caracterizar células tumorais HAMLET sensíveis.

Este estudo caracteriza-se fluxos de iões desencadeadas por HAMLET e examinadas seu papel na morte de células tumorais. Mostramos que HAMLET ativa uma corrente de cátions não-seletivo de células inteiras, o que caracterizamos eletrofisiologicamente. É importante notar, que mostram que os fluxos de iões são essenciais para iniciar a morte de células tumorais induzida por ALDEOLA e para distinguir as células tumorais de células normais, neste contexto. Os efeitos de ALDEOLA sobre a viabilidade celular de cancro foram revertidas por amilorida ou BaCl

2, inibidores não-específicos de vários canais de iões e transportadores. Em paralelo, alterações na morfologia, fluxos de iões, a transcrição global, MAPK sinalização e p38 morte de células tumorais dependentes de MAPK também foram revogadas. Além disso, a resposta do normal, as células diferenciadas para ALDEOLA mostraram diferenças marcadas a partir de que as células cancerosas, definidas pelo padrão de alterações na transcrição global, a activação da via de sinalização e sobrevivência. O estabelecimento de um canal de cátions sensíveis ao amiloride não seletivo como essencial para a morte de células cancerígenas induzida por HAMLET descreve um mecanismo até agora não resolvido e pode representar uma nova opção terapêutica.

Materiais e Métodos

ALDEOLA Produção

α-lactalbumina foi purificado a partir de leite humano desengordurado por precipitação com sulfato de amónio e cromatografia de interacção hidrófoba e convertido para ALDEOLA por desdobramento parcial e de ligação a ácido oleico, tal como previamente descrito [16]. Resumidamente, lactalbumina α nativa foi dissolvido em tampão Tris (Tris 10 mM /HCl pH 8,5) e Ca

2+ foi removido pela adição de EDTA a 3,5 mM. A proteína parcialmente desdobrado foi aplicado a uma matriz de DEAE-Trisacryl M pré-condicionada com ácido oleico, a pH 8,5 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). O complexo ALDEOLA foi eluída com um gradiente de NaCl. A diálise foi usada para remover o excesso de sal e ALDEOLA foi liofilizado e armazenado a -20 ° C. A pureza de cada lote ALDEOLA foi confirmada por SDS-PAGE (NuPAGE, Invitrogen) e a actividade por quantificação da morte celular, como descrito abaixo.

leite humano foi obtido a partir de dadores individuais, após consentimento informado assinado. Cada doador estava ciente de que as amostras podem ser usados ​​em pesquisas científicas. As amostras foram de-identificados e foram tomadas medidas para proteger as identidades dos participantes. O procedimento foi aprovado pela comissão de ética humana da Faculdade de Medicina da Universidade de Lund, Lund, Suécia.

Células

Para identificar vias de resposta conservadas explicando as grandes efeitos tumoricidas de Hamlet [25] tumor foram utilizadas células que diferem em tecido de origem, o repertório oncogene, a composição da membrana celular, expressão do canal de íons e capacidade de crescimento. células de linfoma de células T (Jurkat), carcinoma do pulmão (A549), carcinoma dos ovários (HeLa) e células de carcinoma (A498) nos rins (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas em meio RPMI-1640 com aminoácidos não-essenciais (1:100 ), piruvato de sódio 1 mM, gentamicina (50 ug /mL, Gibco, Paisley, Reino Unido), e 5% (A549 e Jurkat) ou 10% (HeLa e A498) de soro fetal de vitelo (FCS, Gibco), respectivamente. , células saudáveis ​​diferenciadas humanos renais epiteliais (HRTEC) em cultura primária foram gentilmente cedidas pelo Professor D. Karpman (Universidade de Lund, Lund, Suécia) após a aprovação ética da Comissão de Ética Médica da Universidade de Lund Faculdade de Medicina (número decisão LU 456- 96). Estas células foram previamente mostrado ser resistentes aos efeitos letais da ALDEOLA [16]. HRTECs foram cultivadas em DMEM /F12 com 15% de FCS (como em [26]) células RPTEC primários (túbulo proximal células epiteliais renais humanas) foram adquiridos a partir de Lonza (Basileia, Suíça) e cultivadas em DMEM-F12 suplementado com NEAA, piruvato de sódio , gentamicina, Glutamax e 15% FBS (Gibco).

Cell Death Assays

As células de carcinoma foram destacadas dos frascos de cultura celular com Versen (0,2 g EDTA em 200 ml H

2O e 800 ml de PBS), lavada com PBS e foram ressuspensas em soro isento de meio RPMI-1640. As células foram semeadas a uma densidade de 50.000 /poço numa placa de 24 poços e deixou-se aderir durante a noite em meio de crescimento. ALDEOLA dissolvido em PBS foi incubado com as células em meio isento de soro FCS e adicionou-se depois de 1 hora. As células de Jurkat em suspensão ( 80% viável) foram misturados com ALDEOLA a 37 ° C a uma densidade de 10

6 /ml em meio isento de soro. Todas as medições de morte celular foram realizadas três horas após ALDEOLA disso, a menos que indicado de outra forma. A morte celular foi quantificada por azul de tripano exclusão (Chroma Gesellschaft Schmid Co) através da contagem de pelo menos 300 células /amostra ou medindo os níveis de ATP (ATPLite Kit, PerkinElmer, Infinito F200, Tecan). imagens de luz foram capturados usando o HoloMonitor ™ M2 microscópio holográfico digitais (Fase holográfica de imagens AB, Lund, Suécia). Azul de tripano é um corante vital clássica, o que reflecte a perda da integridade da membrana, em células a morrer. ATP é amplamente usado como um marcador bioquímico para a viabilidade substituto, com base na suposição de que as células vivas produzem ATP e é indispensável para a vida celular [27]. HAMLET células tratadas foram previamente examinados para a evidência da morte celular programada, incluindo a apoptose e autofagia [28], [29]. Embora as caspases e autofagia são activados nas células HAMLET tratada, a inibição destas vias não salva as células de morte induzida por ALDEOLA. Portanto parâmetros apoptóticos e autofágicos não são susceptíveis de explicar os efeitos induzidos por Hamlet e não foram examinadas neste estudo.

intracelulares do íon concentrações e Ion fundentes

O parente, livre concentrações intracelulares de Ca

2+ ([Ca

2 +]

i) e na

+ ([na

+]

i) foram estimadas usando o indicador de cálcio Fluo-4 NW e o fluoróforo de sódio Corona verde, respectivamente (Invitrogen). Para Ca

2+ medições, as células A549 foram dadas meio fresco com Fluo-4 NW (5 uM) e incubou-se a 37 ° C durante 30 min, e posteriormente tratada como se indica. Fluo-4 fluorescência foi medida a 535 nm após excitação a 485 nm, utilizando um leitor de fluorescência de placas (TECAN F200 infinito, Tecan Group, Suíça). O Ca

2+ ionóforo A23187 (1 uM, Invitrogen) foi utilizado como um controlo positivo. Relativa [Na

+]

I foi medida em células Jurkat por carregar as células com o indicador verde de sódio Corona (Invitrogen) a 10 ^ M durante 30 min. Para a estimativa da K

+ fluxos, o ensaio de canal iónico de potássio FluxOR ™ (Invitrogen) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram incubadas com FluxOR ™, que é uma Tl

+ indicador. Um aumento em sinal de fluorescência corresponde a um influxo de Tl

+, indicando abertura dos canais de potássio, que foi medida a 535 nm após excitação a 485 nm no leitor de placas infinito TECAN. K

+ fluxos e [Ca

2 +]

i foram adicionalmente analisados ​​por imagem confocal. As imagens foram capturadas a cada 10 s por 5 min em um microscópio confocal LSM510 META (520 nm de emissão após excitação a 488 nm).

Medidas Grampo patch

Solutions.

A solução padrão extracelular continha (em mM): 150 NaCl, 6 de CsCl, MgCl 2

2, 1 CaCl

2, 10 HEPES, 10 glucose e o pH foi ajustado para 7,4 utilizando NaOH. A solução pipeta de medição padrão continha (em mM): CsCl 20, 100 Cs-aspartato, MgCl 1

2, CaCl 0,08

2, 10 HEPES, 10 1,2-bis (2-aminof enoxi) etano- N, N, N ‘, N’-tetra-acetato (BAPTA), 4 NA

2-ATP e o pH foi ajustado para 7,2 usando CsOH. A concentração de cálcio livre desta solução é de aproximadamente 200 nM. Para a estimativa da permeabilidade relativa de catiões monovalentes a solução extracelular continha: (em mM) 20 de CsCl, 130 XCL, HEPES 10 e glucose 10, onde X representa o respectivo catião monovalente (Na

+, K

+, ou Cs

+). Todas as soluções foram ajustadas para um pH de 7,4 utilizando Tris. A solução pipeta para medições de seletividade foi: (em mM) 100 Cs-aspartato, 20 XCL, 10 HEPES e 10 glucose, com X = Na

+, K

+ ou Cs

4 Na

2-ATP e 5 de etileno glicol tetra-acético (EGTA) com X = Na

+, K

+ ou Cs

+. O pH foi ajustado para 7,2 utilizando Tris. Para manter a composição iônica, Hamlet, α-lactoalbumina e oleato foram directamente dissolvido em soluções de gravação.

gravação eletrofisiológico.

Para medições patch clamp, células A549, onde semeadas em lamelas redondos 24-48 h antes da medição. Todas as medições foram realizadas à temperatura ambiente com perfusão constante. correntes de células inteiras foram medidos usando um amplificador EPC10-USB (HEKA Elektronik, Lambrect, Alemanha), empregando manchas rompidos. Pipeta resistência foi de 6,5 ± 0,4 mohms em soluções assimétricas. Capacitância e resistência em série foram registados continuamente e 65% da resistência em série foi electronicamente compensada para reduzir os erros de tensão. Como eléctrodo de referência, um eléctrodo de Ag-AgCl foi utilizado sob condições padrão, enquanto uma ponte de agar a 3 M KCl foi utilizado para medições de selectividade. Todas as medições onde executadas usando uma rampa de tensão 400 ms linear de -100 mV a +100 mV. O protocolo foi iniciada por um pré-pulso de 50 ms a -100 mV e seguido de 1550 ms a -30 mV. Todos os dados foram filtrados 2,9 kHz e amostrada a 1 kHz.

Cálculo da permeabilidade relativa.

Devido à janela relativamente estreita de tempo de estimulação ALDEOLA para selar ruptura (presumivelmente reflectindo perturbação da membrana por ALDEOLA , ver resultados), as proporções de permeabilidade relativas foram calculadas a partir dos potenciais de inversão absolutos (V

rev) utilizando a equação [30]: em que P

X representa dá a permeabilidade do ião dado [X

+]

i, [X

+]

e representa o intracelular e concentrações extracelulares, e F, T, R tem os seus valores normais. O Ca relativa

2 + permeabilidade foi calculada como [30]:.

em que a = P

Na /P

Cs

Antes de cálculos, V

rev foi corrigido para potenciais de junção líquidos [31] (V

LJ) como:.

V

LJ foi calculado usando o built-in software JPCalcW em Clampex7 (Axon Instruments, EUA)

microscopia confocal

Para a microscopia confocal, as células foram cultivadas durante a noite em lâminas de 8 poços câmara (Nalge Nunc a /S, Roskilde, Dinamarca). Após os respectivos procedimentos experimentais, as células foram fixadas em 3,7% de paraformaldeído, núcleos e de membrana de plasma foram coradas com DRAQ5 (eBiosciences) e Alexa-Fluor 488 marcado com germe de trigo aglutinina (Invitrogen) e examinadas num microscópio confocal LSM510 DUO usando um 63 × objectiva de imersão em óleo (Carl Zeiss, Jena, Alemanha). O árgon linha de laser 488 nm foi utilizado para excitar Alexa-Fluor 488 fluorescência, que foi detectada utilizando um filtro passa-banda de 505-530 nm. Alexa-Fluor 568 foi excitada usando o laser nm HeNe543, e a fluorescência foi detectada utilizando um filtro passa-banda de 560-615 nm. O laser de HeNe 633 nm foi utilizado para excitar o DRAQ5, e a fluorescência foi medida utilizando um filtro de passagem longa de 650. Para a inibição de canal iónico, as células foram pré-incubadas com inibidores de meio contendo durante 30 minutos e tratou-se com 35 uM ALDEOLA (3,5 uM de Alexa-Fluor ALDEOLA 568-rotulado (Invitrogen, Carlsbad, CA) e ALDEOLA 31,5 uM não marcado) em soro-livre médio. Para imagem de células vivas, células foram mantidas a 37 ° C, os núcleos foram corados com Hoechst 33342 (Invitrogen) e Alexa-Fluor 568 marcado com ALDEOLA adicionou-se em meio isento de soro. As células foram mantidas a 37 ° C, 5% de CO

2 e as imagens foram recolhidas regularmente por microscopia confocal, utilizando uma LSM510 META (Carl Zeiss, Jena, Alemanha).

Análise Transcriptoma

para a análise de microarray, 200.000 células A549 /poço foram deixadas a aderir durante a noite em uma placa de 6 poços. Após 1 h de tratamento ALDEOLA (21 uM), em anexo, bem como as células flutuantes foram lisadas e o ARN foi extraído utilizando o Kit RNeasy Mini (Qiagen). As amostras foram enviadas para AROS Applied Biotechnology (Århus, Dinamarca) para análise e executado em Human Genome U219 arranjo de placas de acordo com protocolos Affymetrix padrão. A análise dos dados foi realizada utilizando-R e Bioconductor (https://www.r-project.org). Os dados em bruto foram normalizados utilizando RMA (Irizarry et al., 2003) no qual intensidades de matérias são corrigidos-fundo, e em seguida, transformado log2 normalizados utilizando quantis. Um modelo linear é ajustado aos dados para se obter o valor de expressão para cada conjunto de sonda. Os dados normalizada foi encontrado para ser de excelente qualidade com alta correlação replicar ( 0,99) e nuse (erros fora de escala normalizados) valores próximos a 1 (intervalo 0,994-1,008). Para derivar genes diferencialmente expressos um modelo linear foi ajustada utilizando o pacote limma Bioconductor e genes com p-valores ajustados Bayes empíricos 0,05 e log2 dobrar alterações 1 foram considerados diferencialmente expressos e foram caracterizados funcionalmente utilizando o banco de dados para anotação, visualização e Descoberta integrado (David;.. (Dennis et ai, 2003) e engenho Pathway Analysis Para a análise de microarray estendida, a expressão do gene foi avaliada pela totalidade do seu genoma microarrays Illumina (HumanHT-12 expressão BeadChip) os dados foram normalizados utilizando a correlação cruzada [32. ] Genes com um Benjamini-Hochberg ajustado valor de p .. 0,05 e mudança vezes log2 ≥1.2 nas células tumorais e ≥2.0 em normal, células diferenciadas em qualquer ponto do tempo foram considerados como diferencialmente expressos Todos os dados de microarranjos foram registrados em Gene do NCBI Expression Omnibus (GEO) do banco de dados (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo) com o número de acesso GSE23772.

Western Blot e citocinas Quantificação

Por Western blot , 200.000 células foram deixadas a aderir durante a noite numa placa de 6 poços, expostas a diferentes condições experimentais e lisadas em M-PER de tampão de lise (Pierce, Rockford, IL) contendo completa cocktail de inibidor de Protease e PhosSTOP cocktail de inibidores de fosfatase (ambos a partir de Roche, Mannheim, Alemanha). Os lisados ​​foram limpos por centrifugação e as concentrações de proteínas foram medidas utilizando o Protein Assay DC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) num leitor de placas Tecan infinito. Quantidades iguais de proteína foram separadas por SDS-PAGE em geles de 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) e transferidas para membranas de PVDF (GE Healthcare). As membranas foram saturados com BSA (GAPDH), leite desnatado seco (MAPK fosfo-p38, p38 MAPK, fosfo-ERK1 /2, ERK1 /2, ATF6, fosfo-eIF2α) ou Sat-1 e Sat-2 (α-lactalbumina) e incubou-se com α-lactalbumina anti-bovino (1:500, Bethyl Laboratories, Montgomery, Texas), anti-MAPK p38, anti-fosfo- (Thr180 /Tyr182) MAPK p38, anti-ERK1 /2, anti-fosfo- ( Thr202 /Tyr204) -ERK, anti-fosfo-eIF2α (Ser51) (todos 1:500-1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-ATF6 (1:1000, IMG-273, Imgenex) ou anti-GAPDH (1:3000-5000, Novus Biologicals) seguido de anticorpos de peroxidase de rábano conjugado com anti-coelho (1:1000, DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), anti-cabra (1:1000, Sigma Aldrich) ou anti-ratinho (1: 40,000-50,000, Novus Biologicals) anticorpos secundários para coloração. Os anticorpos ligados foram detectados com ECL Western Blotting Além disso Reagente (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido) e equipamentos GelDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Para controlar o carregamento igual, as membranas foram retirados com Restaurar Ocidental Tampão Stripping Blot (Pierce), bloqueado e sondado com novos anticorpos. Para as experiências de ARNip, volumes iguais de lisados ​​foram separados por SDS-PAGE em geles de 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) e transferidas para membranas de PVDF.

fosforilação da MAPK foi analisada numa matriz humano Phospho-MAPK ( proteoma Profiler matriz, R D Systems, Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do fabricante. Band e local intensidades foram quantificados utilizando ImageJ [33]. quantificação de citocinas (IL-6, IL-8, TNF-α) foi realizada num sistema de imunoensaio 1000 IMMULITE (Siemens Diagnostics, Deerfield, IL).

inibidores e RNAi

canal iónico farmacológico inibidores são amplamente utilizados como ferramentas para definir a função de classes de canais iónicos específicos. Amiloride inibe várias

+ NA – canais e transportadores que, incl. Tipo de ENaC Na

+ canais, Na

+ /H

+ trocadores, e Na

+ /Ca

2 + trocadores. Cloreto de bário (BaCl

2) blocos de muitos tipos de canais de potássio. cloreto de gadolínio (GdCl

3) é um inibidor geral de canais mechanosensitive e tetrandrina inibe os canais de potássio grande condutância Ca

2 + ativadas. Rutênio Vermelho é uma ampla inibidor de muitos canais de cátions incluindo intracelulares Ca

2 + canais de libertação. Amiloride (1 mM), BaCl

2, (1 mM), ruténio vermelho (30 uM), tetrandrina (10 uM) e GdCl

3 eram da Sigma Aldrich. Para a inibição p38 MAPK, SB202190 (20? M, Sigma Aldrich) ou BIRB796 (10 mM, Axon medchem) foram utilizados.

Para interferência RNA, FlexiTube siRNA Premixos contra MAPK11 (SI00606053), MAPK14 (SI00300769) e todos negativo star ARNsi de controlo (SI03650318) da Qiagen (Hilden, Alemanha) foram usadas. As células A549 foram transfectadas utilizando a frente uma concentração final de 25 nM de ARNsi em placas de 24 poços. Para p38 MAPK, knockdown foi examinado por Western blot e RT-PCR 48 h após a transfecção.

Análise Estatística

ANOVA de medidas repetidas ou dois lados Estudantes

t

-test foram aplicadas como relevante e foram realizadas com o software Instat (versão 3.06, GraphPad, San Diego, CA). Teste para a normalidade foi feito usando InStat, utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov. Para todas as experiências, um valor de p 0,05 foi considerado significativo. As barras de erro em todos os gráficos representam SEMs de pelo menos três réplicas biológicas independentes.

Resultados

Na

+, K

+ e Ca

2 + Fluxos Induzidas por As células tumorais em HAMLET

As alterações nas concentrações de iões intracelulares induzidos por ALDEOLA (35 fiM) em células de tumores foram caracterizados por fluorometria (Figura 1A) e de imagem confocal tempo real (Figura 1B). HAMLET provocou um rápido aumento na [Na

+]

i em células Jurkat pré-carregados com o Na

+ fluoróforo Corona Verde. Abertura de uma membrana plasmática K

+ via de transporte em resposta a ALDEOLA foi gravado em células de carcinoma de pulmão A549, utilizando o ensaio FluxOR ™, que monitora o fluxo de tálio como um marcador substituto para K

+ [34]. Dada a força motriz para K

+ fluxo através da membrana do plasma isto corresponde a K

+ efluxo, assumindo que a via de transporte é um canal (ver discussão). HAMLET também provocou um aumento rápido e sustentado da [Ca

2 +]

i em Fluo-04:00 pré-carregado células de carcinoma de pulmão (Figura 1A). Em contraste, α-lactalbumina nativa ou ácido oleico não induziu Na

+, K

+ ou Ca

2 + fluxos (Figura 1A).

(A) As estimativas da relação livres, as concentrações intracelulares de Na

+, K

+ e Ca

2 + ([Na

+]

i, [K

+]

i, e [Ca

2 +]

I, respectivamente) foram obtidos em células A549 (K

+ e Ca

2 +) e células Jurkat (na

+) por espectrometria de fluorescência usando Corona verde , FluxOR e Fluo-4. fluxos de iões rápidos foram detectados e estes efeitos foram ALDEOLA específica, como α-lactalbumina, ácido oleico ou PBS não teve nenhum efeito. (Meio de quatro experimentos, p . 0,05 (teste t de Student em t = 2 minutos) (B) Diferença de fluxos de iões induzidas HAMLET entre as células tumorais e células saudáveis ​​Ca

2 + e K

+ fluxos são visualizadas por tempo real de imagem confocal de células de carcinoma do pulmão A549 e HRTEC saudável, as células renais diferenciadas, carregado com o Ca

2 + e K

+ fluoróforos e tratou-se com ALDEOLA (35 uM) durante até 290 segundos. valores representativos de três experiências são mostrados. (C), ionóforo de cálcio (A23187, 1 uM) resposta em células de carcinoma A549 pulmonares carregadas com Fluo-4. figura representativa de três experiências. (D) a inibição da libertação de cálcio intracelular a partir de ER reduz Ca

2+ fluxos. As células A549 foram pré-tratadas com um PLC-inibidor (10 ^ M, U73122), o seu análogo inactivo (10 uM, U73343) ou EDTA (1 mM) durante 30 minutos e tratou-se com ALDEOLA como indicado. Meios de três experimentos. (e) Amiloride (Amil, 1 mM) inibiu na

+ e Ca

2 + fluxos em células A549 (Ca

2 +) e células Jurkat (na

+) induzida por HAMLET (marcada como na Figura H). BaCl

2 (1 mM) inibiu o Na

+, K

+ e Ca

2 + fluxos. As células foram pré-carregadas com os respectivos fluoróforos, pré-tratados com inibidores (30 minutos) e desafiados com ALDEOLA (35 uM) durante até 5 minutos. Efeitos da amilorida em K

+ fluxos não pode ser determinada devido à auto fluorescência. Vermelho de rutênio (RR, 30? M) reduziu Ca

2 + fluxos enquanto tetranidrine (Tet, 10 mM) não teve efeito significativo.

O [Ca

2 +]

I e K

+ ião de fluxos também foram visualizados utilizando microscopia confocal e demonstrado que ocorrem em quase todas as células (Figura 1B). Estes fluxos de iões rápidos não foram observados por microscopia confocal em células saudáveis ​​e diferenciados em cultura primária (HRTEC). de imagem confocal de Fluo-4 células carregadas revelou uma diferença na cinética e a magnitude entre as respostas de ALDEOLA ou o Ca

2+ ionóforo A23187 (Figura 1C), o que sugere que elas funcionam por mecanismos distintos. Ca

2 + -chelation com EGTA teve pouco efeito sobre o aumento da [Ca

2 +]

i, sugerindo que o envolvimento de Ca extracelular

2 + foi mínima (Figura 1D). No entanto, a inibição da InsP3-fechado ER Ca

2 + canais com U73122 essencialmente aboliu o aumento na [Ca

2 +]

i, o que implica que ela se originou principalmente de lojas intracelulares (Figura 1D, [35] ).

induzidas HAMLET Ion fundentes são alteráveis ​​para Ion Canal inibidores

Um painel de inibidores do canal de íon bem caracterizados foi usada para investigar mais profundamente os HAMLET induzida fluxos de iões. A mudança em [Na

+]

i em células Jurkat foi inibido por amilorida e BaCl

2, o K

+ fluxo em células de carcinoma de pulmão de BaCl

2 e de Ca

2 + fluxo de amiloride e BaCl

2 (Figura 1E). O efeito da amilorida em K

+ fluxo não poderia ser testada, devido a autofluorescência. A natureza molecular da corrente HAMLET-activado foi investigado usando o amplo espectro Ca

2 + inibidores do canal, o ruténio vermelho e tetrandrina, nenhum dos quais afetou significativamente a atual (Figura 1E).

HAMLET ativa uma corrente da célula de cátions não seletivos inteiro em células de carcinoma

As alterações observadas nas concentrações de iões intracelulares eram indicativos de que HAMLET ativado um canal iónico não selectivo. Esta hipótese foi confirmada por experiências de mancha de células inteiras de fixação (Figura 2). HAMLET (35 M) activada uma corrente de células inteiras, que atingiu uma magnitude de 2,74 ± 0,88 nA dentro de 1,43 ± 0,13 min. A corrente exibiu uma corrente-tensão, em vez relação linear (Figura 2A, B) e uma inactivação dependente do tempo clara em potenciais despolarizadas (Figura 2C). ativação atual inicial exibiu um atraso de 0,88 ± 0,13 min da aplicação HAMLET. Em contraste, α-lactalbumina ou oleato, eram inactivos, enfatizando a necessidade para o complexo ALDEOLA para activar a célula corrente (Figura 2A-B). O potencial de reversão (V

rev) em soluções baseadas em Cs foi -5.1 ± 0,99 mV, correspondente ao calculado Nernst potencial de 4,85 mV, enquanto V

rev foi -8,3 ± 1,3 mV e 2,4 ± 2 mV em Na

+ e K

+ baseados, respectivamente, dando uma proporção de permeabilidade do P

Cs (1) P

K (0,88 ± 0,1) P

Na (0,48 ± 0,03 ) (Figura 2D). GAPDH foi usada como um controlo de carga.