Abstract

Fundo

Os trabalhos anteriores mostraram níveis de expressão reduzidos de let -7 em tumores pulmonares. Mas pouco se sabe sobre a expressão ou mecanismos de deixá-7a no câncer de próstata. Neste estudo, foram utilizados in vitro e in vivo abordagens para investigar se E2F2 e CCND2 são alvos diretos de deixá-7a, e se deixe-7A atua como um supressor tumoral no câncer de próstata por E2F2-down regulação e CCND2.

Metodologia /Principais

Os resultados em tempo real RT-PCR demonstraram que a diminuição dos níveis de deixá-7a estão presentes em amostras de câncer de próstata ressecados e linhas celulares de cancro da próstata. A proliferação celular foi inibida em células PC3 e células LNCaP após transfecção com let-7a. Análise do ciclo celular mostraram que let-7a induziu a paragem do ciclo celular na fase G1 /S. Um ensaio de repórter dual-luciferase demonstrou que a 3’UTR de E2F2 e CCND2 estavam diretamente ligados a deixar-7a e análise western blot indicou ainda que deixá-7a-regulada a expressão de E2F2 e CCND2. Os nossos modelos de xenotransplante de cancro da próstata confirmou a capacidade de deixá-7a para inibir o desenvolvimento do tumor da próstata in vivo.

Conclusões /Significado

Estas descobertas ajudam a desvendar os mecanismos anti-proliferativa de deixá-7a no câncer de próstata. Deixe-7a pode também ser novo candidato terapêutico para o cancro da próstata devido à sua capacidade para induzir a paragem do ciclo celular e inibir o crescimento celular, especialmente em cancro da próstata refractário a hormonas

citação:. Dong Q, P Meng, Wang T , Qin W, W Qin, Wang M, et al. (2010) MicroRNA Deixe-7a inibe a proliferação de células cancerosas humanas da próstata

In Vitro

e

In Vivo

por Segmentação E2F2 e CCND2. PLoS ONE 5 (4): e10147. doi: 10.1371 /journal.pone.0010147

editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Canadá |

Recebido: 09 de março de 2010; Aceito: 23 de março de 2010; Publicação: 14 de abril de 2010

Direitos de autor: © 2010 Dong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do Programa Nacional de Pesquisa básica da China, 2009CB521705; ea Nature Science Foundation da China, 30672097. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os microRNAs (miRNAs) são endógenas, não codificante pequenos RNAs de 20-25 nucleótidos de comprimento [1], que desempenham um importante papel regulador através de ligação gratuita de regiões não traduzidas a 3 ‘(UTRs) do alvo genes. resultados de ligação na degradação do mRNA alvo e inibição da tradução [2]. Muitos miARNs estão associados com o cancro, e estão envolvidos no desenvolvimento de células, diferenciação, proliferação e morte das células [3]. Muitos relatórios têm indicado que miARN pode ser útil para o diagnóstico e terapia de [4] cancro. let-7 foi identificado pela primeira vez em

Caenorhabditis elegans

[5]. É quase indetectável no estádio embrionário de desenvolvimento, mas torna-se mais abundante em fases posteriores do desenvolvimento [6]. Trabalho anterior mostrou níveis de expressão reduzida de let-7 em comparação com os tumores de pulmão tecido pulmonar normal. deixar-7 diminui a proliferação celular pela regulação negativa dos oncogenes RAS /c-myc e HMGA-2 ao nível da tradução [7], [8]. As funções supressoras tumorais mesma também foram relatados para deixá-7 no câncer de cólon [9].

In silico

análises de potenciais alvos deixá-7A (www.targetscan.org andwww.microrna .org) revelam que tanto E2F2 e CCND2 são possíveis alvos de deixá-7a. E2F2 e CCND2 são reguladores do ciclo celular e a expressão aberrante de eles podem levar a uma proliferação celular anormal. Nossos experimentos preliminares indicam que os níveis de proteína de ambos E2F2 e CCND2 está regulado para cima na linha de células de câncer de próstata PC3. Pouco se sabe sobre a expressão ou mecanismos de deixá-7a no câncer de próstata. Neste estudo, foram utilizados

in vitro

e

in vivo

abordagens para investigar se E2F2 e CCND2 são alvos diretos de deixá-7a, e se deixe-7A atua como um supressor tumoral em próstata cancro por E2F2-regulação para baixo e CCND2.

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

Todas as amostras foram obtidas de pacientes que assinaram o consentimento informado, que aprova o uso de seus tecidos para a investigação efeitos após a operação. Os fatores patológicos clínica dos 26 pacientes foram apresentados na Tabela S1. O uso de tecidos humanos neste estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board da Quarta Universidade Médica Militar e estava de acordo com as suas orientações (Sem 2008039085). Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a Lei de Bem-Estar Animal e aprovado pelo Animal Care e Use Committee da Quarta Universidade Médica Militar. (Número de aprovação 200.804.052.353).

cultura de células e tecidos coleção

linhas de células cancerosas humanas da próstata LNCap, DU145, PC3, e PREC (próstata células epiteliais) e as células embrionárias do rim HEK293A foram obtidos a partir Colecção americana de Culturas Tipo (ATCC, Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado com 10% de vitelo-fetal de soro e penicilina (100 U /ml). As culturas foram mantidas sob uma atmosfera contendo 5% de CO

2 (Forma Scientific). Vinte e seis amostras de cancro da próstata recém-ressecados e suas amostras não-tumorais adjacentes foram coletados do Departamento de Urologia no Hospital Xi’jing. As amostras foram imediatamente congeladas em azoto líquido e mantido ali até à sua utilização.

construção do plasmídeo e a transfecção de células

Deixe-7a foi amplificado e purificado por meio de kit de isolamento de miARN (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo o protocolo do fabricante. iniciadores de PCR para deixá-7a foram:

5′-GAATTCTCACACAGGAAACCAGGA-3 ‘

(avançar) e

5′-CTGCAGTCAGGCATTTAAGTGACCG-3′

(reverso). Deixe-7A produtos de PCR foram clonados no

Eco

RI /

Pst

Eu sítio de clonagem de um plasmídeo pcDNA3 contendo a proteína fluorescente verde (GFP) para formar o plasmídeo pcDNA3-deixou-7a-GFP . transfecção de células foi feita com lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células PC3 foram plaqueadas em placas de seis poços e cultivados sem antibióticos para 70-90% de confluência. Cada poço recebeu 6 ul de reagente lipofectamina contendo 3 ug de ADN de plasmídeo. Três poços recebeu plasmídeo pcDNA3-deixou-7a-GFP enquanto os outros poços recebeu o vector vazio, pcDNA3-GFP. G418 (400 ug /ml) foi adicionado às células 24 h após a transfecção. Os clones foram rastreados misturadas e cultivadas durante um adicional de 4 semanas. células PC3 transfectadas com let-7a foram designados como PC3-let-7a-GFP, o controlo negativo (células transf ectadas com o vector vazio) foi designado como PC3-GFP. células PC3 também foram transfectadas com 30 nM de sintético let-7a (imita), e controlo negativo miARNs sintéticos (NC). Por último, um sintético deixá-7a-inibidor sequência e controle negativo 7a-inibidor deixá-sintético (inibidor NC). Sequências de HSA-deixou-7a sintética, controle negativo, inibidor da HSA-deixou-7a e inibidor de controlo negativo foram apresentados no Texto S1.

extração de RNA total e em tempo real RT-PCR

para let-7a, o RNA total foi extraído a partir de amostras utilizando um miRNeasy Mini Kit (Qiagen). O ADNc foi sintetizado utilizando TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems). Em tempo real de RT-PCR foi realizada com o kit TaqMan MicroRNA Ensaio (Applied Biosystems). O iniciador para let-7a era

5′-GAGGTAGTAGGTTGTATA-3 ‘. Compra de E2F2 e CCND2, extração de RNA total e em tempo real de RT-PCR foram realizadas utilizando o kit de SYBR® Greener ™ em dois passos (Invitrogen, Carlsbad, CA). iniciadores de PCR para E2F2 foram:

5′-GAGCTCACTCAGACCCCAAG-3 ‘

(avançar) e

5′-AACAGGCTGAAGCCAAAAGA-3′

(reverso). iniciadores de PCR para CCND2 foram:

5′-AAGAATTCCTCCTCAATAGCCTGCAGCAGTA-3 ‘

(avançar) e

5′-GCGGGATATCGACCTGTGAGAATTCGAT-3′

(reverso). Todos os protocolos foram realizadas de acordo com os protocolos do fabricante. O nível de let7a expressão foi normalizada para RNU6B. O nível de E2F2 e CCND2 expressão foram normalizados para GAPDH. Em tempo real de RT-PCR foi realizada usando-7500 em tempo real de RT-PCR System (Applied Biosystems). A PCR foi realizada sob as seguintes condições: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, seguido de 50 ciclos a 95 ° C durante 15 s, e 60 ° C durante 1 min. Cada amostra foi executado em triplicado.

MTT Assay

células PC3 e células LNCaP transfectadas com NC ou deixe-7A (imita), ou inibidor e deixe-7a inibidor NC foram semeadas em 96 placas bem em 1 × 10

4 células /poço. As células viáveis ​​foram medidos 1, 2, 3, 4 e 5 dias após o plaqueamento. Após incubação com cloreto de 3- (4, 5-dimetiltiazolil-2) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT), as células foram lisadas em 150 ul de 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) e a absorvância de UV-visível foi lida a 490 nm usando o leitor de placas de 96 poços. Cada amostra foi corrida em triplicado.

agar mole ensaio

Resumidamente, 2 ml de 0,5% de agar foi adicionada a cada poço de uma placa de 12 poços. Destacada PC3-let-7a-GFP e células PC3-GFP foram misturados com a suspensão topagarose (concentração final 0,3%), e, em seguida, as células foram em camadas sobre o forro de agarose a 0,5%. O número de focos 100? M foram contadas após 18 dias. Cada experimento foi realizado em triplicado.

análise do ciclo celular

células PC3 e células LNCaP transfectadas com NC ou deixe-7a (imita), ou inibidor da NC ou deixá-7a inibidor foram colhidas 72 h após a transfecção, lavou-se com solução salina de fosfato tamponada fria (PBS), e fixadas em 1 ml de etanol a 70%. Após incubação durante a noite a 4 ° C em etanol, as células foram lavadas em PBS e suspensas em 500 ul de iodeto de propidine (IP) 30 minutos antes da citometria de fluxo. Populações em G0-G1, S e fase G2-M foram medidos por citometria de fluxo (EPICS XL, Coulter, Miami, FL) e os dados foram analisados ​​usando Multicycle-DNA Cell Cycle Software analisado. A medição foi realizada em triplicado.

Dual-luciferase ensaio de repórter

Para investigar se a expressão E2F2 e CCND2 foram regulados por deixá-7a, foi realizado um ensaio de dual-luciferase repórter. A 3’UTR do CCND2 e E2F2 foram amplificados por PCR, respectivamente. A amplificação de CCND2 utilizados os seguintes iniciadores:

5′-GAATTCATGAGTTCTTCGTACTGG-3 ‘

(avançar) e

5′-GATATCCCATCATGAT GAGGATAC-3′

(reverso). Os produtos de PCR foram 398 pb e continha dois sítios de ligação para Deixe-7a. O mutante 3’UTR do CCND2 foi sintetizada a partir de mutações pontuais foram feitas em várias bases dentro dos locais de ligação destes produtos de PCR. Amplificação do 3′-UTR de E2F2 utilizadas as seguintes sequências iniciadoras:

5′-GAATTCCTCTTCGACTCCTACGAC-3 ‘

(avançar) e 5

‘ –

GATATCTGTGCTTCTT GGTACGTCG-3 ‘(reverso). Os produtos de PCR foram 415 pb e continha dois sítios de ligação para deixá-7a. Mutada 3’-UTR de E2F2 foram sintetizados depois de várias mutações pontuais foram feitas nos locais de ligação de produtos de PCR. Após digestão de restrição, os genes amplificados foram clonados nos locais correspondentes de um vector de expressão pGL3 reconstruída. O vector de controlo de pRL-TK que expressa luciferase de Renilla (Promega) foi usado para a normalização do número de células e a eficiência de transfecção. Co-transfecções de deixar sintética-7a sequência (imita) e CN, ou deixá-7a inibidor e inibidor NC também foram realizadas em células de rim embrionário humano HEK293A utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen). atividade Firefly e Renilla luciferase foi determinada por Pikkagene dupla Luciferase Assay System (Toyo-B-Net)

análise de Western blot

Os anticorpos seguintes foram utilizados para transferência de western:. rato anti-E2F2 ( 1:200 diluição, Santa Cruz Biotech); de ratinho anti-CDK4 e anti-rato D2 ciclina (1:300 diluição; BD Biosciences, San Jose, CA); de ratinho anti-K-ras (1:300 diluição; Cell Signaling Technology, Beverly, MA); de coelho anti-β-actina (diluição 1:4000, Sigma). Vinte e cinco microgramas de espécimes de cancro da próstata e de proteínas dos seus espécimes adjacentes não-tumoral, bem como PC3-let-7a-GFP e a proteína PC3-GFP foram sujeitos a electroforese em 10% de minigéis SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose Hybond-C (Amersham Ciências da vida, Buckinghamshire, Reino Unido). Após incubação com os anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite, as membranas de nitrocelulose foram lavadas três vezes com Solução Salina Tamponada com Tris-Tween-20 (TBST) e depois incubou-se com isotiocianato de fluorecein (FITC) -conjugated, de cabra anti-rato ou de cabra anti-coelho IgG (1:500 diluição, Sigma) durante 1 h à temperatura ambiente. Depois de se lavar com TBST, as manchas foram visualizadas usando o sistema de infravermelho Odyssey tratamento de imagens (LI-COR Bioscience, Lincoln, Nebraska EUA). Cada ensaio foi repetido três vezes.

tumorigenicidade

Cinco ratinhos nus foram injectados subcutaneamente com 10 ~ 1 ×

6 PC3-let-7a-GFP células PC3-GFP ou em uma única local da parte de trás. O peso do tumor e o peso do rato foram medidos na altura do sacrifício (4 semanas após a injecção). Western blot foi realizada para investigar se E2F2 e CCND2 foram regulados negativamente no modelo de xenotransplante nude-mouse. suspensões tumorais foram tratadas com tampão de lise e Western blotting foi realizado de acordo com os procedimentos descritos acima.

A análise estatística

diferenças entre cada grupo foi determinada pelo teste t de Mann-Whitney ou

U

teste usando pacote de software estatístico SPSS (SPSS Inc, Chicago) (

p Art 0,05 foi considerado como significativo).

resultados

Deixe-7a é regulado para baixo em amostras de cancro da próstata ressecados e em células de cancro da próstata

em tempo real de RT-PCR revelou que os níveis de let-7a expressão foram diminuiu ~43% em amostras de cancro da próstata humana ressecados em comparação com o não adjacente amostras -cancerous. As linhas celulares de cancro da próstata LNCap expresso apenas ~ 70% como let-7a do que as células normais epiteliais da próstata PrEC. Além disso, a quantidade de expressão let-7a em células PC3 e DU-145 foram cerca de 50% do observado em PrEC. Estes resultados indicam que let-7a é reduzida em cancro da próstata, incluindo a cancros PC3 independente de androgénios (Fig. 1, *

P

0,05; **

P

0,01) .

em tempo real de RT-PCR indicam que a expressão relativa da let-7a em vinte e seis amostras de cancro da próstata, e em linhas celulares de cancro da próstata LNCap, PC3, DU-145 é mais elevada do que na sua adjacente espécimes não-cancerosas e células normais da próstata PrEC epitelial. Os dados são apresentados como percentagem de sinais médios em tecidos e células de três medidas independentes. RNU6B foi medida em paralelo e usadas para normalizar os níveis de expressão de let-7a em cada experiência. Os valores representam meios e barras de erro representam o SEM. (*

p

0,01, **

p

0,01; Mann-Whitney-U test).

Deixe-7a inibe o crescimento de células

in vitro

e induz a paragem do ciclo celular na fase G0-G1

Depois de transfecção, o nível de expressão de deixá-7a no PC3-deixou-7a-GFP foi -300% superior ao PC3-GFP por em tempo real de RT-PCR; Um aumento de dez vezes na expressão de let-7a foi observada em células PC3 transfectadas com let-7a (imita) versus as transfectadas com NC (Fig 2A,

P

. 0,01). Isto indicou que a transfecção foi realizada de forma adequada. Análise de formação de colónias indicaram que a capacidade de formação de colónias de células PC3-let-7a-GFP é ~ 40% menos do que a de células de controlo (Fig 2B,

p .

0,01). As curvas de crescimento de MTT indicaram que a partir do segundo dia, a sobrevivência de let-7a transfectadas células PC3 e células LNCaP são significativamente menos do que a do controlo negativo, e a sobrevivência de let-7a inibidor transfectadas células PC3 e células LNCaP são significativamente mais do que isso da NC inibidor células transfectadas (Fig 2C,

p .

0,05). A citometria de fluxo mostrou que a percentagem de let-7a transfectadas células PC3 e LNCaP de células na fase G0-G1 foi ~ 30% (PC3) e 16% (LNCaP) mais elevada do que a do controlo negativo, o que em paralelo com um ~ 50% ( PC3) e 20% (LNCaP) diminuição da fase S. a percentagem de let-7a inibidor transfectadas células PC3 e LNCaP de células na fase G0-G1 foi ~ 23% (PC3) e 19% (LNCaP) menor do que a de células transfectadas NC inibidor, que em paralelo com um ~33% (PC3 ) e 25%) aumento (LNCaP em fase S (Figura 2D, *

P

. 0,05; **

P

0,01). Estes dados indicam que let-7a PC3 inibe a proliferação induzindo a paragem do ciclo celular na fase G1 /S.

(A) Expressão relativa de let-7a em células PC3 transfectadas com pcDNA3-GFP, pcDNA3-let- 7a-GFP, NC, e deixe-7a (imita). RNU6B foi medida em paralelo e usadas para normalizar os níveis de expressão de let-7a em cada experiência. Os valores representam as médias de três experiências separadas e as barras de erro representam o SEM. (**

p Art 0,01; Mann-Whitney-

U

teste). (B) PC3-let-7a-GFP e células PC3-GFP foram cultivadas em meio contendo agar mole e incubou-se durante 18 d. O número de focos 100 mm foram contados. Os valores representam as médias de três experiências separadas e as barras de erro representam o SEM. (*

p Art 0,01; Mann-Whitney-

U

teste). (C) Viabilidade de células PC3 e células LNCaP, que transfectadas com deixá-7a, NC ou inibidor deixe-7a, inibidor de NC foi medida por ensaios de MTT, respectivamente. absorvância no UV-visível foi medida a 490 nm. Os valores representam as médias de três experiências separadas e as barras de erro representam o SEM. (*

p Art 0,05, teste t de amostras pareadas). (D) Análise do ciclo celular em células PC3 depois transfectadas com NC e deixá-7a (imita) ou inibidor da NC e deixá-7a inibidor, bem como a análise do ciclo celular em células LNCaP depois transfectadas com NC e deixá-7a (imita ) ou inibidor da NC e inibidor deixe-7a. Os valores representam as médias de três experiências separadas e as barras de erro representam o SEM. (*

p Art 0,05, **

p Art 0,01; Mann-Whitney-

U

teste).

Let 7.º-alvos 3’UTR de E2F2 e CCND2

Figura 3A mostra as sequências dos “UTRs 3 de E2F2 e CCND2 que representam os sítios de ligação para deixá-7a. As sequências correspondentes das UTRs 3 ‘mutados de E2F2 e CCND2 também são mostrados. Não foi observada redução da actividade da luciferase em células HEK293A transfectadas com deixá-7A (imita) e mutante CCND2 ou E2F2. Mas foi observada uma redução superior a 30% da actividade da luciferase com Observou-CCND2 tipo selvagem e redução ~ 50% da actividade da luciferase com o tipo selvagem E2F2 (Fig 3B, **

P

. 0,01). Em comparação com inibidor da NF, não há diferença significativa na actividade de luciferase quando as células foram transfectadas com HEK293A o inibidor let-7a e de tipo selvagem ou CCND2 E2F2 (Fig. 3C). Estes dados suportam que E2F2 e CCND2 são alvos diretos de deixá-7a e endógena deixe-7a em HEK293A tem nenhuma interferência com a nossa experiência.

(a) ligação sites na E2F2 e CCND2 para deixá-7a com a correspondente sequências e E2F2 CCND2 mutado. (B) actividade de luciferase relativa de células renais embrionárias humanas HEK293A após transfecção com NC ou let-7a (imita) e, em seguida, também co-transfectadas com vector de controlo pRL-TK, ou vector de expressão contendo ambos os pGL3-WT ou CCND2-3’UTR MUT-CCND2-3’UTR ou WT-E2F2-3’UTR ou MUT-E2F2-3’UTR. (C) a actividade de luciferase relativa de células renais embrionárias humanas HEK293A após a transfecção com o inibidor de NF ou let-7a inibidor e também co-transfectadas com o vector de controlo de pRL-TK, ou o vector de expressão contendo ambos os pGL3-WT ou CCND2-3’UTR WT-E2F2-3’UTR. Os valores representam as médias de três experiências separadas e as barras de erro representam o SEM. (**

p Art 0,01; Mann-Whitney-

U

teste).

Deixe-7a inibe a expressão de E2F2, CCND2

em tempo real de RT-PCR demonstra que a expressão relativa de ARNm de E2F2 e CCND2 em tecidos de cancro da próstata e em LNCaP, PC3, e células DU-145 são regulados positivamente em comparação com os espécimes não-cancerosas adjacentes e células PrEC (fig. 4A, B, *

p Art 0,05; **

p Art 0,01). Mas em comparação com PrEC, expressão de mRNA de E2F2 e CCND2 são down-regulamentado após transfectadas com deixá-7a no PC3 e células LNCaP (Fig 4C, D, *

p

. 0,05; **

p

0,01). resultados de transferência de Western mostrou nenhuma alteração da expressão da proteína CDK4 entre tecidos de cancro da próstata e dos seus tecidos adjacentes não-tumorais ou entre PC3-let-7a-GFP e células PC3-GFP, os níveis de E2F2 expressão, CCND2 aumentada em tecidos de cancro da próstata em comparação com os seus tecidos adjacentes não-tumoral, mas os níveis de E2F2, CCND2 expressão, e K-ras diminuíram drasticamente em células PC3-let-7a-GFP em comparação com o que, em células PC3-GFP (Fig. 4E). , um alvo molecular previamente definida de let-7a-ras k [7] foi utilizado como um controlo positivo para estas experiências. Estes dados sustentam que 7a de descida-regulação da expressão de ARNm de E2F2 e CCND2 e reprimir a tradução da proteína deles.

(A) em tempo real de RT-PCR indicam que o nível de expressão relativa de E2F2 em tecidos de cancro da próstata e em LNCaP, PC3, e células DU-145 é muito mais elevada do que nas suas amostras não-cancerosas e células adjacentes PrEC (*

P

0,05, **

P

0,01 ; Mann-Whitney-

U

teste). (B) em tempo real de RT-PCR indicam que o nível de expressão relativa de CCND2 em tecidos de cancro da próstata e LNCaP, PC3, e células DU-145 é muito mais elevada do que nas suas amostras não-cancerosas adjacentes e células PrEC (*

P Art 0,05; Mann-Whitney-

U

teste). (C) em tempo real de RT-PCR indicam que o nível de expressão relativa de E2F2 em células LNCaP e PC3 é menor do que nas células transfectadas com PrEC depois deixou-7a (*

P

0,05, **

p Art 0,01; Mann-Whitney-

U

teste). (D) em tempo real de RT-PCR indicam que o nível de expressão relativa CCND2 em células LNCaP e PC3 é menor do que nas células transfectadas com PrEC depois deixou-7a (*

P

0,05, teste de Mann-Whitney-

U

teste). Todos os valores representam médias de três experiências separadas e as barras de erro representam o SEM. GAPDH foi medida em paralelo e usado para normalizar os níveis de E2F2 e CCND2 de expressão em cada experiência. (E) mostram Western blot que as células e células PC3-GFP nenhuma mudança de expressão CDK4 entre os tecidos de câncer de próstata e suas amostras não-cancerosas adjacentes, ou entre 7a-GFP PC3-decepção. Os níveis de E2F2 e CCND2 de expressão é superior em tecidos de cancro da próstata do que nas suas amostras não-cancerosas adjacentes. Depois deixou-transfectadas com 7a, os níveis de E2F2, CCND2, e K-ras expressão diminuíram drasticamente em células PC3-let-7a-GFP em comparação com o que, em células PC3-GFP. β-actina foi utilizado o controlo de carga.

Deixe-7a inibe o crescimento do tumor no modelo de xenotransplante ratinhos nus

ratinhos nus portadores de xenotransplantes PC3-GFP PC3-deixou-7a-GFP ou foram sacrificados 4 semanas após a inoculação. Os tumores foram excisados ​​e medida (Fig. 5A). Western blotting mostrou que os níveis de expressão CCND2 E2F2 e diminuiu dramaticamente em tumores PC3-let-7a-GFP em comparação com tumores PC3-GFP (Fig. 5B). O peso dos tumores PC3-deixou-7a-GFP foi ~ 80% mais leve do que os tumores PC3-GFP (Fig 5C,

p

. 0,01). Além disso, a razão entre o peso do tumor /peso corporal em ratinhos portadores de tumores PC3-let-7a-GFP foi apenas ~ 6% do rácio de ratinhos portadores de tumores PC3-GFP (Figura 5D,

P 0,01), que fornece fortes evidências de que deixe-7a pode inibir o crescimento tumoral

in vivo

.

(a) Fotografia de tumores extirpados 4 semanas após a implantação. A linha superior mostra tumores excisados ​​de ratinhos injectados com células PC3-GFP. Quanto menor são tumores excisados ​​de ratinhos injectados com células PC3-deixou-7a-GFP. De camundongos injetados com células PC3-deixou-7a-GFP, nenhum tumor foi detectado em um rato e um rato morreu 2 dias após a injeção. (B) Western blot mostrou que a expressão de E2F2 e CCND2 diminuiu dramaticamente em tumores excisados ​​de ratinhos PC3-let-7a-GFP-tumoral-Bearin em comparação com aqueles com tumores PC3-GFP. β-actina foi utilizado como um controlo interno. (C) Peso do tumor e (D) razão entre o peso do tumor /corpo foi determinado quando os ratinhos foram sacrificados. Os valores representam meios e barras de erro representam o SEM. (**

p Art 0,01; Mann-Whitney-

U

teste).

Discussão

A incapacidade de uma célula para regular o seu crescimento e proliferação é uma característica distintiva do câncer. Como moléculas crítico na regulação do ciclo celular, as proteínas E2F estão a jusante da cascatas de sinalização de fator de crescimento. Eles influenciam o crescimento e proliferação celular através da sua capacidade para regular os genes envolvidos na progressão do ciclo celular [10], [11]. E2F2 é um membro da família E2F de factores de transcrição, e tem sido bem caracterizada como um regulador da transição de fase G1 para S [12]. Relatórios anteriores indicam que E2F2 tem forte capacidade oncogénica e pode promover a progressão do ciclo celular. As linhas celulares transfectadas com E2F2 proliferam em duas vezes a taxa de células de controlo [13]. Por progressão apropriada através do ciclo celular, actividade de fosforilação da cinase dependente da ciclina (CDK) é essencial. CCNDs são expressos na fase G1 precoce e ligar CDK4 e CDK6 [14]. A activação destas quinases resulta na fosforilação de outros reguladores do ciclo celular crítico, tais como a pRb. pRb, em seguida, activa a E2F e permite a entrada em fase S. Por conseguinte, a expressão aberrante de CCND2 e E2F2 conduzirá a uma proliferação celular anormal. Superexpressão de CCND2 foi relatada em tumores ovarianos da granulosa células, cancro gástrico e cancro do cólon [15] – [17]. De modo semelhante, a regulação positiva de E2F2 foi encontrado em astrocitomas de graus diferentes [18].

miARNs pós-transcricionalmente regular a expressão do gene através da ligação à 3’UTR do ARNm alvo. A ligação leva à degradação do ARNm alvo e a tradução reduzida de proteínas alvo. actividade miARN também afecta a expressão de genes que estão a jusante dos alvos directos e podem levar a alterações nos perfis de expressão de proteínas globais. Portanto, miARNs potencialmente desempenhar um papel fundamental na progressão do cancro humano. Uma grande quantidade de evidências suporta que a expressão aberrante de miRNAs ocorre em diversos tipos de câncer humano, e em diferentes fases de progressão do cancro [19], [20]. deixar-7 foi avaliado para actuar como um supressor do tumor em alguns tipos de cancro, tais como cancro do pulmão e cólon [9], [21] – [23], e que os níveis reduzidos de deixá-7 de expressão está correlacionada com um mau prognóstico clínico [ ,,,0],24].

Embora essa correlação entre let-7 expressão e doença é mais forte no tecido pulmonar, onde deixá-7 expressão é alta, o nosso estudo constata que let-7 provoca defeitos do ciclo celular na linha de células de câncer de próstata como bem. Verificou-se que o nível de expressão let-7a é regulada negativamente de forma dramática em tecido de cancro da próstata e células de linhas. Os níveis de proteína e de expressão de mRNA de E2F2 e CCND2 são regulados negativamente em células PC3 e LNCaP após transfecção com deixá-7a. Os nossos modelos de xenotransplante de cancro da próstata também confirmam nossos

in vitro

resultados e mostrar que deixá-7a tem a capacidade de inibir o desenvolvimento do tumor de próstata

in vivo

. Nosso ensaio de repórter duplo de luciferase verificamos que E2F2 e CCND2 são alvos diretos de deixá-7a. Além disso, outros genes associados com a regulação do ciclo celular têm sido relatados para ser reprimido, directa ou indirectamente por deixar-7. Estes incluem CDC34, que promove a degradação de ciclina dependente da cinase (CDK) e 1B inibidor CCNA2, que promove a transições de fase G2-M [25] G1-S e. Nossa fundação expande a família de let-7 metas, ea identificação das vias moleculares afetadas em câncer poderia revelar ainda mais os mecanismos pelos quais deixe-7a inibe a divisão celular. Embora muito ainda está para ser aprendido sobre o papel de deixá-7a na tumorigênese do câncer de próstata, deixe-7a nos proporciona uma nova forma de tratamento do câncer de próstata através da sua capacidade de induzir a paragem do ciclo celular e inibir o crescimento celular.

Informações de Apoio

Tabela S1.

Clínica fatores patológicos de 26 pacientes utilizados atualmente

doi:. 10.1371 /journal.pone.0010147.s001

(0.08 MB DOC)

texto S1.

Sequências de HSA-deixá-7a sintética, controle negativo, HSA-deixá-7a inibidor e controle Inhibitor negativo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0010147.s002

(0,02 MB DOC)

Reconhecimentos

gostaríamos de reconhecer Lijie Ele para excelente assistência editorial e sugestões perspicazes.