Abstract

Objectivo

À tela e caracterizar as variantes da linha germinativa para E-caderina

(CDH1)

em pacientes com câncer gástrico não-hereditária (GC) e em indivíduos em risco de GC.

Métodos

59 GCs, 59 parentes de primeiro grau (FDRs) de GC, 20 auto-imunes metaplásico gastrite atrófica (AMAGS) e 52 doadores de sangue (BDS) foram analisadas para

CDH1

por sequenciação directa, modelagem estrutural e bioinformática. impacto funcional no splicing foi avaliada a presença de mutações intrônicas. Foram realizados E-caderina /coloração imuno-histoquímica β-catenina e E-caderina quantificação de ARNm utilizando RT-PCR

Resultados

Em GCs, 4 variantes missense (p.G274S;. p.A298T; p.T470I; p.A592T), uma mutação na 5 ‘UTR (-71C G) e uma mutação no IVS12 intrónica (c.1937-13T C) região foram encontrados. Primeiro efeito patogênico da mutação p.A298T foi previsto por modelagem proteína 3D. A nova mutação p.G274S mostrou nenhum significado funcional clara. Além disso, em primeiro lugar, IVS12 intrónica (c.1937-13T C) mutação foi demonstrado para levar a uma aberrante

CDH1

transcrição com exão 11 eliminação. Esta mutação foi encontrada em 2 GCs e 1 BD. Em FDRs, foram identificados 4 variantes: a polimórfica (p.A592T) e 3 mutações em regiões não traduzidas com papel funcional não identificado, excepto para a UTR 5 ‘(-54G C), que tinha sido encontrado para diminuir

CDH1

transcrição. Em AMAGS, detectamos 2 alterações: 1 missense (p.A592T) e 1 nova variante (mutação IVS1 (C.48 + 7C T)) sem efeito no

CDH1

splicing. Várias substituições silenciosas e polimórficos foram encontrados em todos os grupos estudados.

Conclusões

No geral nosso estudo melhora a caracterização atual de

CDH1

mutações e seu papel funcional no GC e em indivíduos em risco de GC. Mutações encontradas em regiões não traduzidas e dados sobre os efeitos de emenda merece uma atenção particular, como associado com uma quantidade de E-caderina reduzida. O utilitário de

CDH1

rastreio, para além da identificação de outros factores de risco, podem ser úteis para a detecção precoce de GC em indivíduos em risco (isto é, FDRs e AMAGS), e garante um estudo mais aprofundado.

Citation: Garziera M, Canzonieri V, Cannizzaro R, S Geremia, Caggiari L, De Zorzi M, et al. (2013) Identificação e Caracterização de

CDH1

da linhagem germinativa Variantes em esporádicos pacientes com câncer gástrico e em indivíduos em risco de câncer gástrico. PLoS ONE 8 (10): e77035. doi: 10.1371 /journal.pone.0077035

editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 29 Abril, 2013; Aceito: 05 de setembro de 2013; Publicação: 29 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Garziera et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC De Re N. 10266 e AIRC Cannizzaro Programa especial Molecular Oncologia Clínica 5×1000 N. 12214) e Direzione Centrale del Lavoro, Formazione, Università e Ricerca Della Regione Autonoma Friuli Venezia Giulia, Codice Progetto 200502027001. Os financiadores não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO dE iNTERESSES:. Dr. Valli de Re declara que ele é um co-autor e membro do Conselho Editorial da PLOS UM. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer gástrico (GC) continua a ser a quarta neoplasia maligna mais comum em todo o mundo, embora sua incidência e as taxas de mortalidade associadas diminuíram nas últimas décadas. prognóstico GC está intimamente relacionado com o estádio da doença no diagnóstico [1]. câncer gástrico início precoce (EOGC) é definida como GC apresentando com a idade de 45 ou mais jovens [2] e tem uma sobrevida global pobres [3], [4]. A maioria dos GCs são esporádicos e muitas vezes desenvolvem seguinte

Helicobacter pylori

(HP) -associated gastrite [5], [6]. No entanto, estudos de agregação familiar também salientar a importância de uma predisposição genética no desenvolvimento esporádico de GC. Frequência de agregação gástrico familial é de cerca de 10%

O GC classificação histopatológica mais amplamente aceite (classificação de Lauren) [7] distingue dois tipos de GC:. Tipo intestinal e tipo difuso. Difuso de GC apresenta uma maior base hereditária e geralmente um prognóstico pior em comparação com o subtipo intestinal [8].

CDH1

gene que codifica para a E-caderina foi identificada a ter um papel causal em cerca de 30% -50% dos difuso hereditário GC (HDGC), uma síndrome de GC e susceptibilidade cancro da mama lobular autossômica dominante constitui 1-3% do agrupamento familiar de GCs [9], [10] e no subtipo GC difusa [11] .

CDH1

mutações da linha germinativa (tal mutação é passado em todas as células no corpo do descendentes) são especificamente associadas com HDGC (cerca de 30% -40% de casos); grande

CDH1

eliminações foram encontrados em cerca de 6,5% dos casos [12]. Câncer familiar intestinal gástrica (FIGC), com uma história familiar positiva também têm sido descritos, mas até agora, nenhuma linha germinal

CDH1

defeitos têm sido associados com FIGC ou GCs intestinais. Esta falta de provas de

CDH1

mutações no subtipo intestinal levou à hipótese de que o agrupamento familiar, nestes casos, é determinada por factores ambientais comuns, como oposto a uma predisposição genética herdada. No entanto, dados recentes demonstram que

CDH1

alterações somáticas (tais alterações se acumulam nas células cancerosas do corpo ao longo do tempo de vida de uma pessoa) são tão freqüentes na intestinal como no GC difusa [13], o que sugere um importante papel da

CDH1

em ambos os histotipos. No entanto, a prevalência exata da

CDH1

alterações germinativas em GCs intestinal ainda é desconhecida.

CDH1

hipermetilação do promotor é o segundo hit genética mais comum no processo cancerígeno GC [14], [15].

CDH1

mutações também estão associadas com um aumento da susceptibilidade para invasivo e metastático [16], [17] do cólon, da bexiga, da próstata, da mama e os cancros ginecológicos [18] – [20]. E-caderina é uma glicoproteína transmembranar que desempenha um papel na manutenção da arquitectura do tecido epitelial, envolvendo Ca

2+ interacções célula-célula dependente [21], [22]. E-caderina compreende um domínio citoplasmático, um domínio transmembranar curto e cinco domínios extracelulares de repetição de caderina-like (EC1-5) que abrangem exões 4-13 e contêm regiões de ligação de cálcio altamente conservadas [23], [24] e conservadas cisteínas prováveis para formar pontes dissulfeto [25]

neste estudo, foram analisados ​​

CDH1

mutações germinativas em uma série de casos e indivíduos em risco de GC consecutivos GC aleatória.; principalmente de primeiro grau GC-parentes (FDRs) e pacientes auto-imunes metaplásicas gastrite atrófica (AMAG) dirigidos para o nosso instituto de sintomas gastrointestinais e avaliação endoscópica. Para explorar o papel da expressão de E-caderina, análises estruturais, funcionais e de imunohistoquímica foram realizadas em amostras com um

CDH1

mutação germinativa. O objetivo do presente estudo foi avaliar a prevalência e caracterizar

CDH1

mutações germinativas em uma série de pacientes CG esporádicos consecutivos faltam os critérios de classificação HDGC, e em uma população selecionada em risco de desenvolvimento de GC, para testar a sua utilidade como um marcador de tumor para melhorar a detecção precoce. Os dados obtidos podem ser usados ​​para desenvolver uma ferramenta que rapidamente e barata detecta

CDH1

mutações presentes principalmente em nossa população.

Resultados

caracterização dos doentes e

CDH1

germinal rastreio genético

as características clínicas e histopatológicas de assuntos GC, FDR e AMAG estão resumidas nas Tabelas 1 e 2. Entre os 59 pacientes do GC, 2 (3,4%) têm uma história familiar de GC (S15 é a irmão de S16) sem cumprir os critérios para a GC difuso hereditário, como definido pela International Câncer gástrico Linkage Consortium (IGCLC) no momento da coleta da amostra. Em nossa série GC, 5 pacientes no início da CG esporádicos (≤45 anos) estavam presentes, mas nenhum

CDH1

foram encontradas alterações nestes doentes. A idade mediana dos FDRs foi de 49 anos (variação, 28-78 anos) e para AMAGS 56 anos (variação, 31-72 anos). Entre os 59 pacientes do GC, 16 indivíduos tinham um parente de primeiro grau incluídos no estudo (16/59 FDRs). FDRs e AMAGS veio para nossa instituição para uma visita de gastroenterologia e exame de endoscopia digestiva, que se manifesta vários sintomas, mas nem câncer nem intestinal metaplasia /displasia estava presente nestes indivíduos.

CDH1

rastreio resultados genéticos são listadas na Tabela 3 com

novos

mutações: 1 intrônica (ID 5), 1 missense (ID 10) e 2 silenciosa (ID 13 e ID18). No geral, achamos 4 variantes, que código para um aminoácido (AA) de substituição (1 novel (ID10) e 3 anteriormente relatados em outras populações (ID 11, ID 12, ID 15), 1 em cada região do gene 5’near e 2 mutações no não traduzida (UTR) elemento regulador (ID 1, ID 3, já relatado) e 6 substituições em regiões intrônicas (três mutações: ID 5, ID 9, ID 17, três variantes polimórficas intr�icas: ID 4, ID 6, ID 8, provavelmente, com nenhum efeito sobre cancerogenesis GC). Sem deleções ou inserções foram encontrados nas fronteiras exão.

Outras alterações resultou polimorfismos comuns (frequência de pelo menos 1% da população) ou mutações silenciosas que codificam o mesmo aminoácido do que a cadeia original. observou Nenhum associação estatística entre os quatro grupos de pacientes testados para ID 4, ID 6 ou ID 19 variantes.

RefSNP (rs) números para identificar variantes genéticas publicado anteriormente, bem como as suas frequências indicadas (NIEHS Projeto Genoma Ambiental, Seattle, WA (URL: https://evs.gs.washington.edu/niehsExome/acessado em agosto de 2013); ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp/phase1/analysis_results/paper/Acessado Dezembro de 2012) são apresentados na Tabela 3.

Todos os

CDH1

variantes foram no estado heterozigoto, exceto para o ID 4 e ID 19 no qual também foi detectado um estado homozigoto.

frequência de mutações e variantes foram calculados em indivíduos sem GC ou doença AMAG (52BDs + 59FDRs, n = 111). FDRs dezesseis eram parentes de primeiro grau de nossa série GC; quando um de a variante estava presente em GC e seu caso FDR relacionada, excluímos o indivíduo FDR do cálculo de frequência. ID4 por exemplo, estava presente em 5 FDRs relacionados com a nossa GC da nossa série; portanto, a frequência população de controle mudou de total de 111 a 106 indivíduos (7FDRs + 8BDs /106; 14,5%). A figura 1 ilustra cromatogramas sequenciamento do novas mutações que temos encontrado. Temos relatado anteriormente o cromatograma ID 10 em outro artigo [26]

(A) ID 5, nova mutação intrônica perto de exão 1 (mutação IVS1 C.48 + 7C T). Encontrado em um paciente afetado pela AMAG (S121). (B) ID 13, mutação silenciosa (c.1416C T) com resíduo conservado Ala na posição 472 em

CDH1

exão 10 (p.T472T) encontrado em um GC (S4). (C) ID 18, a mutação silenciosa (c.2073C T) com o resíduo Ala conservada na posição 691 em

CDH1

exão 13 (p.A691A) encontrado em um GC (S48)

Bioinformatic papel preditivo e modelagem estrutural resultados de variantes missense encontradas

os missense mutação resíduos que encontramos estão todos localizados ao domínio extracelular da caderina-e. A posição do codão no imatura e madura (após a clivagem N-terminal) e proteínas de dados do PolyPhen-2 e peneirar

in silico

análises são apresentados na Tabela 4. Todos os quatro variantes missense são potencialmente prejudiciais por PolyPhen -2, mas apenas o p.A298T (ID 11) e p.A592T (ID 15) substituições podem afectar a função da proteína por análise de SIFT (Tabela 4). Os p.G274S (ID 10) que, recentemente descritos [26], no entanto, não perturbar o ambiente local, mas introduz um resíduo potencial de fosforilação e glicosilação que pode ter possíveis efeitos sobre a estabilidade ea integridade da caderina-E como nós hipótese [26]. O efeito patogênico de ID 11 substituição foi estabelecido anteriormente [27], mas foi aqui primeiro demonstrada por análise estrutural. Tal como ilustrado na Figura 2A, a alteração no exão 7 AA da p.A298T (ID 11) é posicionado perto da região interactiva entre prot�meros EC1 e EC2. Assim, a substituição de resíduo polar alanina-treonina pode conduzir a formação de ligação-H através do seu grupo oxydrilic e este pode interferir com a estrutura local da proteína numa região que é fundamental para o Ca

2+ interacções. Treonina na posição 144 é estericamente demonstrado intrusivos porque interage com dois resíduos de ácido aspártico (Asp136 e Asp 138) que estão diretamente envolvidos na Ca

2 + vinculativo. Além disso, os comprimentos de ligação são particularmente estressado, sendo menos de 3 Å (Figura 2B)

A-B PyMOL e Coot softwares representações de prot�meros EC1-EC2 com base na sequência humana. (PDB código: 2O72); no C-F, EC3 e EC4 prot�meros com base em murino E-caderina (código PDB: 3Q2W) pelo software Coot. (A) destaques de representação dos desenhos animados A144 (

amarelo

) Posição: A144 está próximo aos locais de cálcio (

roxo

) e na proximidade da interface de dimerização entre EC1 (

azul e ) -EC2 (

verde

) domínios. (B) a representação estrutural de substituição A144T no domínio EC2. Posição do AT144 spotlighted em amarelo. Treonina na posição 144 é bastante dramático para estrutura local porque interage com dois resíduos de ácido aspártico (

verde

) diretamente envolvidos nos locais de cálcio, e estes comprimentos de ligação são particularmente estressado sendo menos de 3 Å. (C) A T316 (

amarelo) é

O

-glycosilated (

azul e) e presente na superfície do domínio EC3. (D) A cadeia de lateral hidrofóbica de I316 (

amarelo

) não pode ser

O

-glycosilated e promove interações proteína-proteína. (E) A cadeia lateral metilénico de A438 (

amarelo) permite a liberdade conformacional na superfície do domínio CE4. (F) T438 (

amarelo

) a substituição não é dramática para a estrutura local, mas poderia representar um local potencial para modificações pós-traducionais. íons de cálcio são destacadas (

verde).

No que diz respeito às restantes duas mutações missense, eles têm um efeito menos claro funcional como também apresentados na Tabela 4. p .T470I (ID 12) substituição de [28] torna a superfície de AA EC3 extradomain na proteína madura (Figura 2C). Em ambos os murina E-caderina e N-caderina de sequência (código PDB: 3Q2W) treonina é normalmente encontrado

O

-glycosylated sugerindo um papel importante para este resíduo na estrutura da proteína. No entanto, como mostrado na Figura 2D, a mudança de isoleucina, uma AA não-polar, com uma cadeia lateral hidrofóbica que não pode sofrer modificação pós-translacional, sugere que não há tensão intermolecular particular. Nós supomos que, no meio extracelular, a presença de um resíduo de isoleucina na mesma posição do que a treonina podem favorecer as interacções proteína-proteína, e esta mutação pode, assim, assumir um significado de protecção. A última mutação relatado, p.A592T (ID 15), foi encontrado em todos os grupos testados (ver Tabela 3), o que sugere um efeito sobre a patogénese improvável GC. Neste caso, alanina na EC4 extradomain do maduro E-caderina (Figura 2E) oferece liberdade conformacional, mesmo quando em proximidade dos Ca

2 + sítios de ligação. Uma substituição de treonina aqui tem um efeito limitado sobre a estrutura e torção ângulos locais da proteína. No entanto, não podemos excluir que a cadeia lateral, oxydrilic poderia ser modificado pós-tradução em particular situação e, assim, influenciar a estrutura e função do

CDH1

(Figura 2F).

análise Transcrição mutações germinativas intr�icas

Para explorar se as mutações intrônicas detectadas em nossa série GC (Tabela 3) pode potencialmente induzir um efeito sobre a emenda, foi realizada

CDH1

análise da transcrição. variantes polimórficas e silenciosos foram excluídos dessa análise, uma vez que eles provavelmente não têm nenhum papel patogênico. ADNc produzido a partir de sangue periférico de indivíduos GC seleccionados albergando ID intrónico 5, 9 de ID ou ID 17 mutações (Tabela 3) foram comparados com os que a partir de dois dadores de sangue saudáveis, uma única que tem o mesmo ID de 17 mutação como pacientes GC (código BD S190 ), e outra (código BD S189) sem

CDH1

mutação.

para os ID 5 e ID 7 mutações intrônicas, que amplificou a região que abrange parte do exão 1 a parte do exão 5, para mutação ID 17, exão 10 a 13 (Figura 3). A RT-PCR o exão 1 a 5 fragmentos não mostraram diferenças quando executado em 4% de gel de agarose (Figura 3A), nem após sequenciação bidireccional (dados não mostrados); por converse ID 17 variante intrônica poderia afetar splicing levando a uma menor

CDH1

transcrição anormal (Figura 3B). Após o isolamento e a sequenciação, verificou-se que a banda mais pequena resultou num transcrito ignorado falta o exão 11, 10 com o exão directamente juntou-se ao exão 12. Esta transcrição aberrante também foi detectado no BD S190 transportando a mesma substituição de linha germinal (Figura 3B).

ARNm total foi extraído a partir de PBMC de cada amostra representada e retrotrascribed em ADNc de cadeia simples para amplificar: (a) Os exões 1-5 de cerca de 768 pb. No paciente segunda pista AMAG (S121) portador da mutação ID 5 (mutação IVS1 C.48 + 7C T); na terceira faixa FDR (S97) que transporta a mutação 9 de ID (IVS4 c.532-18C t); (B) Os exons 10-13 de cerca de 686 pb. GC (S10), GC (S46) e BD (S190) portador da mutação ID 17 (IVS12 c.1937-13T C). Setas amarelas evidenciar uma banda menor correspondendo a transcritos aberrantes sem o exon 11; (C) β-actina foi utilizada como controlo interno de amplificação. MW: uma escada de DNA Kb. Os produtos de PCR foram executados em um de agarose a 4% e gel corado com SYBR Green dyef

Análise do

CDH1

nível de abundância de proteínas e expressão de mRNA em indivíduos mostrando

CDH1

mutações intrónicas

Uma comparação do nível de expressão de ARNm da e-caderina foi realizada a partir de linfócitos EBV imortalizadas obtidas a partir do sangue periférico de S10 e S190 (ID mutação 17), S97 (ID 9) e S189 (sem

CDH1

mutações) assuntos. Assunto S10 foi afetado por um câncer gástrico, sujeita S97 é parente de primeiro grau de um paciente com um câncer gástrico (FDR), enquanto S189 e S190 foram ambos doadores de sangue. Observou-se entre o doador de sangue de controlo (S189) não tendo nenhuma

CDH1

mutação e os pacientes, uma forte diminuição relativa na expressão da caderina-E (cerca de 60%, a Figura 4) em paciente S10 tendo ambos ID 17 mutação e uma GC, enquanto a redução de apenas cerca de 2% no doador de sangue S190 tendo a mesma mutação ID 17 (

P

0,05, em relação a GC S10). Para S97 (ID mutação 9, FDR assunto), observou-se uma expressão de E-caderina semelhante ao que no controle S189.

A quantificação relativa dos níveis de E caderina-mRNA em linfócitos EBV imortalizado (LCL). LCLS foram gerados a partir da sementeira de 2,5 × 10

6 PBMC imortalizadas por EBV B.95.8 e cultivadas em suspensão. Cerca de 8 milhões de células foram colhidas para cada amostra após a imortalização. Os pacientes testados foram: GC S10 abrigar a variante ID 17 (IVS12 c.1937-13T C), FDR S97 carregando o ID 9 (IVS4 c.532-18C T), BD S190 com ID 17 e BD S189 sem qualquer

CDH1

mutação. S189 foi considerada como a referência (valor de 1) Os resultados são representativos de três experiências independentes. nível de expressão de E-caderina foi normalizada normalizados de dados para p-actina estão representados como médias ± DP. *, P 0,05, **, p . 0,01

A análise imunohistoquímica no tecido gástrico tumor de intrônica ID 17 caso (código paciente S10, Figura 5E) mostrou uma redução da expressão de membrana-bound e-caderina nas células tumorais em anel de sinete (setas pretas), enquanto que tanto membrana e coloração citoplasmática estavam presentes no epitélio normal. O mesmo paciente mostrou reduzida coloração β-catenina em células em anel de sinete, em comparação com a forte expressão desta proteína nas células adjacentes normais (Figura 5H). A perda de tanto de E-caderina e β-catenina coloração também foi notada para as segundas pacientes (S46) que tem a mesma intrónica ID 17 mutação e afectada por GC também (Figura 5F e 5I, respectivamente para a E-caderina e β-catenina) .

(a) hematoxilina e eosina no tecido gástrico normal. (B) de Hematoxilina-eosina no tecido tumoral de GC S10 com carcinoma de células anel de sinete: células em anel de sinete são realçados por setas pretas. (C) hematoxilina e eosina provas do histotipo difusa de GC S46. (D) a coloração de E-caderina em tecido gástrico normal. (E) Redução de coloração de E-caderina nas células em anel de sinete de GC S10 relação a células normais adjacentes; células em anel de sinete são realçados por setas pretas. (F) perda da expressão de E-caderina nas células tumorais difusas de GC S46 em comparação com o tecido normal (no lado direito da f otomicrograf ia). (L) coloração β-catenina em tecido gástrico normal. (H) Fracamente coloração β-catenina em células em anel de sinete (setas pretas) de GC S10. (I) a perda de coloração β-catenina no tecido tumoral de GC S46 em comparação com o tecido normal (no lado direito da f otomicrograf ia). Todas as fotomicrografias foram feitas em 400 × ampliação.

Discussão

pacientes GC normalmente têm um prognóstico pobre [29]. Identificação de pacientes com um risco aumentado de desenvolvimento de GC e a detecção precoce do GC são abordagens promissoras para reduzir a morbidade e mortalidade da GC. FDR dos pacientes do GC são conhecidos por terem um risco 2-3 vezes maior de GC, provavelmente devido à exposição aos mesmos fatores de risco ambiental e /ou a susceptibilidade hereditária ao câncer [30].

A destruição de células parietais encontrado em AMAG combinado com o importante papel da e-caderina em polaridade epitelial e arquitetura glandular gástrica, sugere que as alterações da linha germinativa de

CDH1

poderia ser um fator de risco adicional para o desenvolvimento GC na AMAG paciente [31].

Em 1998, Guilford e colegas descreveram para as primeiras mutações germinativas tempo do

CDH1

[28]. Subsequentemente, diferentes tipos de mutações têm sido relatados em famílias de diferentes etnias com GC difusa [32], [33]. A primeira

CDH1

mutação germinativa foi descrita em uma família italiana em 2006, em um paciente que preencheram os critérios de IGCLC para HDGC [34]. No entanto, poucos estudos relatam

CDH1

mutações germinativas em casos esporádicos GC sem agregação familiar ou em indivíduos em risco de desenvolver GC [35], [36]. Além disso, nestes estudos os efeitos funcionais do

CDH1

variantes muitas vezes não são investigados.

A força do nosso estudo é a coleção de 59 pacientes caucasianos com CG esporádicos, 59 FDRs e 20 AMAGS que participaram do nosso serviço de gastroenterologia nos últimos anos para sintomas gástricos e um diagnóstico ou exclusão de um GC após endoscópica e avaliação tecido histológico.

Como resumido na Tabela 3, vários germinativas diferente

CDH1

variantes têm foi detectado. Na série de 59 GC, excluindo as mudanças polimórficas e silenciosas que provavelmente não tem nenhum papel patogênico, encontramos 6 substituições diferentes em 9 pacientes (9/59 GCs = 15,2%): 4 do tipo missense (ID 10, ID 11, ID 12, ID 15) em 4 pacientes distintos (6,8%) e 2 do tipo não-missense (ID 2 e ID 17) em 5 GCs distintos (3,4%).

O ID 10 (p.G274S) é uma nova mutação missense que encontramos em um homem velho com uma histotipo mista GC. Esta variante não foi detectada em 187 indivíduos sem câncer (108BDs + 59FDRs + 20AMAGs), excluindo, assim, um polimorfismo. Um efeito patogênico da ID 10 mutação não foi apoiado após funcional (agregação e invasão)

in vitro

ensaios como nos informou recentemente [26], não obstante os dados do

in silico

caracterização da mutação e uma redução na expressão β-catenina encontradas no tecido do tumor não pode excluir completamente o significado desta mutação no desenvolvimento de GC. Assim, no hoje ID 10 permanece um romance

CDH1

mutação com uma patogênese de um significado indeterminado.

O ID 11 (p.A298T) a substituição no exão 7 de

CDH1

já foi descrito em um homem caucasiano jovem de 36 anos de idade, em uma família HDGC [27]. Em nossa série, esta variante foi detectada apenas em 1 masculino (S47) de 74-year-old com um histotipo mista. O efeito potencial patogênico desta mutação foi confirmada através de

in vitro

estudos funcionais em laboratórios diferentes [27], [37], [38]. Aqui primeiros resultados de modelos (Figura 2A-B) através da análise de proteínas de ligação ao ligando 3D, apoiam fortemente o potencial para a função da proteína alterada e levar ao possível mecanismo molecular que sustentam este processo. A função da proteína alterada potencial foi apoiada também da análise SIFT (Tabela 4) com uma boa pontuação. Além disso, um estudo recente, utilizando o

in silico

projeto proteína FoldX abordagem algorítmica [39], reafirma o papel patogênico do 11 (p.A298T) a substituição ID, com base em um cálculo das alterações de estabilidade no estado nativo (ΔΔG 0,08 kcal /mol) [40]. Autores caracterizado pacientes portadores desta mutação missense como tendo uma idade mais jovem no momento do diagnóstico e uma histotipo difusa. Nosso caso destacou que ID 11 também pode ser detectado em um paciente idoso com GC mista.

O ID 12 (p.T470I) foi encontrado em um homem de 57 anos de idade (S39) com diagnóstico de GC . Esta mudança foi descrita pela primeira vez em uma família de etnia maori com EOGC, mas o assunto mostrando esta mutação não foi afetada pela GC no momento do estudo [28]. Aqui, verificou-se que a mudança p.T470I AA é tolerado pelo SIFT e também por análise de modelação. Infelizmente, o tumor espécime de tecido bioptic era insuficiente para executar a E-caderina IHC coloração.

O ID 15 substituição (p.A592T) foi detectada em cada grupo clínico testados, sugerindo uma difusão polimórfica provável. No entanto, esta variante foi relatada anteriormente associado com tumores de tireóide e câncer de mama lobular [41] – [43]. Nossa análise estrutural e

in vitro

[35] e

in silico

estudos [38], [40] não suportam um papel patogênico para esta variante no GC.

Conforme recomendado pelo orientações de gestão clínica recentes [44], a vigilância endoscopia deve ser realizada anualmente em indivíduos com mutações de significado indeterminado (por exemplo, missense). Em nossa opinião, os indivíduos portadores ID 15 e também ID 10, devem ser acompanhados por até 10 anos antes de se excluir um papel embora fraca para esta alteração na patogênese da GC.

No ID 2 foi identificado um C mudança -para-G antes do códon de iniciação (-71C G,

CDH1

5’UTR região), que representava a variante mais comum associado ao GC em nossa série, ocorrendo em três dos 59 pacientes do GC ( 5,1%). Esta variante também foi relatado em um estudo finlandês [45] em 1 de 13 (7,7%) pacientes do GC e, em 2 de 51 controles (3,9%), e também em dois pacientes EOGC de origem americana do Norte (3,4%) [46] . Os dados gerais destes estudos sugerem que ID 2 é uma mutação muito comum, mas os autores não relataram dados sobre variante ID 2 em relação ao estado de expressão da caderina-E. ID 2 foi encontrada em nossa série em um intestinal, uma mista e uma histotipos GC difusas. Todos estes pacientes tinham mais de 50 anos no momento do diagnóstico e foram negativos para infecção pelo HP. Nenhum dos indivíduos do grupo controle (n = 111) testadas, sem GC, mostrou esta mutação (Tabela 3). Um

in situ

avaliação ou uma correlação entre ID 2 e expressão da caderina-E foi incapaz de ser realizada devido à falta de material de tumor. O efeito potencial patogênico dessa variante promotor em nível de expressão da caderina-E merece mais estudos

Intronic variantes ID 17 (IVS12 c.1937-13T C). Foi encontrado em 2 fêmeas com GC (2/59 GCs = 3,4%) tanto positiva para a infecção por HP, e verificou-se também em um BD (1/52 = 1,9%, Quadro 3). A mesma alteração foi previamente relatado no cancro da mama lobular com alta frequência (12/53 = 23%) [47], nas famílias hdgc (2/27 = 7,4%) [48] e em pacientes EOGC (7/79 = 8,9% ) [46], mas também numa população de controlo relativo [46]. De nota, demonstramos pela primeira vez que esta substituição conduz a uma aberrante

CDH1

transcrição abrigar uma deleção do

CDH1

exão 11. Exon 11, juntamente com sequências parciais dos exons flanqueando , codifica para o domínio EC4 da proteína madura [25]; ID 17 é uma supressão para fora de grelha e leva à formação de um codão de paragem prematuro na posio 384 do promotor CE4. Por conseguinte, a proteína traduzida a partir de

CDH1

ID 17 Strand poderia falta o domínio transmembranar e a cauda citoplasmática que está envolvido na ligação β-catenina. Ambos os pacientes GC S10 e S46, possuindo a mutação ID 17, mostrou uma redução na expressão de E-caderina e β-catenina por IHC análises (Figura 5); o paciente GC S10, com um carcinoma de células anel de sinete, foi diagnosticado com a idade de 61 anos, e o paciente GC S46, com um adenocarcinoma difusa, foi diagnosticado com a idade de 58 anos. Além disso, a avaliação da expressão de E-caderina do EBV imortalizadas B-linfócitos mostrou uma redução forte (60%) em GC S10 abrigando ID 17 mutação, em comparação com o controlo BD (S189) sem>

alterações, mas também, em comparação com um único dador de sangue (S190) transportando a mesma variante de ID 17. Uma vez que todos os indivíduos que transportam a mutação ID 17 são heterozigóticos para o gene da

CDH1

, os nossos dados indicam que o indivíduo S190, mas não de células tumorais de pacientes S10 e S46, podem explorar um mecanismo compensatório que neutraliza a E-caderina infra-regulação. Em tumores, E-caderina sob-expressão está ligada à actividade de transcrição reforçada β-catenina, um efector principal da via Wnt [49]. A expressão de um grande número de genes relacionados com a progressão do tumor, incluindo aqueles para ciclina D1, c-

myc

, factor de crescimento endotelial vascular, e survivina é controlada através da via Wnt /β-catenina [50]. ligação a p-catenina impede a sua translocação para o núcleo de E-caderina; Por conseguinte, uma redução da expressão de E-caderina pode favorecer GC patogénese através de um aumento da acumulação β-catenina nuclear. Como os pacientes S10 e S46 com variante ID17 são tanto as mulheres mostrando um helicobacter pylori infecção (HP), assumimos que ID 17 pode ser associado a um fator prognóstico sexo-específicos (é sabido que a incidência de GC é maior para homens do que para as mulheres) e /ou uma infecção HP. A deleção do exon 11 no

gene CDH1

também foi descrita em um paciente HDGC, mas neste último caso splicing aberrante foi associada a uma mutação intrônica diferente (IVS11 c.1711 + 5G A) [27] .