Abstract

receptor do fator de crescimento de fibroblastos 4 (FGFR4) é vital para o desenvolvimento precoce e reparação de tecidos. Os níveis de expressão FGFR4 são muito restrito em tecidos adultos, exceto em vários tumores sólidos, incluindo câncer colorretal, que mostrou superexpressão de FGFR4. Aqui, a análise de mutações FGFR4 descartada a presença de mutações de activação, com excepção Arg

388, em diferentes linhas celulares de cancro colo-rectal e amostras tumorais. Estável shRNA FGFR4-silenciamento em linhas celulares SW480 e SW48 resultou numa diminuição significativa na proliferação celular, adesão, migração e invasão celular. Esta redução nas capacidades tumorigénicas e invasivos de células de cancro colorrectal foi acompanhada por uma diminuição de Snail, torção e os níveis de expressão do gene de TGF-p e um aumento de E-caderina, causando uma reversão para um fenótipo mais epitelial, em três linhas de células diferentes. Além disso, FGFR4 de sinalização ativado o SRC oncogênico, ERK1 /2 e vias AKT em células de câncer de cólon e promoveu um aumento da sobrevivência celular. A relevância do FGFR4 no crescimento do tumor foi apoiado por duas estratégias diferentes. inibidores de quinase abolida crescimento celular relacionados com FGFR4 e vias de sinalização na mesma extensão do que as células silenciados-FGFR4. Os anticorpos específicos para FGFR4 segmentação usando provocou uma redução semelhante no crescimento celular. Além disso, FGFR4 células knock-down exibida uma capacidade reduzida para

in vivo

formação de tumor e angiogênese em camundongos nus. Coletivamente, os nossos dados suportam um papel crucial para FGFR4 na tumorigênese, invasão e sobrevivência no cancro colorectal. Além disso, FGFR4 segmentação demonstraram sua aplicabilidade para a terapia do cancro colorectal

Citation:. Peláez-García A, Barderas R, Torres S, Hernández-Varas P, Teixidó J, Bonilla F, et al. (2013) Papel FGFR4 em epitelial-mesenquimal Transição e seu valor terapêutico no cancro colorectal. PLoS ONE 8 (5): e63695. doi: 10.1371 /journal.pone.0063695

editor: Qian Tao, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 09 de novembro de 2012; Aceito: 06 de abril de 2013; Publicado em: 16 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Peláez-García et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pela subvenção BIO2009-08818 do Ministério da Ciência e Inovação espanhol, conceder a grupos de pesquisa estabelecidos (AECC) e conceder-S2011 /BMD-2344 /Colomics2 da Comunidad de Madrid. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O fibroblastos (FGFs factores de crescimento) foram implicados em vários processos biológicos durante o desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas, a hematopoiese e a angiogénese [1]. Eles ligam-se a quatro receptores de FGF (FGFR) designados FGFR1-4 [2]. A estrutura FGFR inclui um domínio de ligação ao ligando que contém três domínios do tipo imunoglobulina diferentes (chamado Ig I, II Ig e Ig III). O domínio ligante é seguido por um domínio de transmembrana único e um domínio intracelular tirosina-quinase citoplasmática. FGFR4 exibe o padrão mais restrito de expressão para o desenvolvimento embrionário e reparação de tecidos [3], [4], quando comparado com os outros três FGFR, e os seus níveis de expressão pós-natal declinar. Em adultos, FGFR4 é expresso em miofibroblastos musculares durante a regeneração após a lesão, mas não em músculo esquelético madura [5]. receptores de FGF desregulação tem mostrado desempenhar um papel importante no desenvolvimento e progressão do cancro. Estas alterações têm sido propostos para ocorrer por meio de sobre-expressão, amplificação do gene ou mutação [6].

Anteriormente, o nosso grupo identificado FGFR4 como um auto-anticorpo alvo no cancro colo-rectal (CRC) utilizando microarrays de proteínas [7]. Além disso, observou-se uma sobre-expressão clara de FGFR4 em linhas celulares de cancro colorrectal (particularmente em 2 de 4 linhas celulares de cancro colorrectal altamente metastáticas) com uma potencial associação de FGFR4-expressão para estágios finais de câncer colorretal [8]. FGFR4 tem sido relatada a ser sobre-expresso em mama, próstata, cólon, rabdomiossarcoma, gástricos, pancreáticos, hepatocelular e pituitária adenocarcinomas humanos [4], [9], [10], [11], [12], [13] , [14], [15], onde ela pode contribuir para a progressão do tumor por mecanismos múltiplos [4], [9]. Além disso, os níveis de expressão foram FGFR4 associada com doença metastática e baixa sobrevivência em gástrico, do pulmão, adenocarcinoma da mama e rabdomiossarcoma [16], [17], [18]. FGFR4 mutações somáticas são pouco frequentes no câncer [11], [19], [20], [21]; Arg

388 é o único polimorfismo de nucleótidos mais comum (SNP) em FGFR4, o que provoca um aumento da estabilidade prolongada e a activação do receptor. Tem sido associada com mau prognóstico para o câncer de nódulo positivo de mama, sarcoma de tecido mole de alta qualidade, cabeça e pescoço e carcinoma de células escamosas do pulmão [9], [16], [18], [22], [23].

18 Entre os ligandos de FGF, FGF19 se liga preferencialmente FGFR4 [24], embora também se liga FGFR1. A ligação ocorre em um complexo que compreende heparina, FGFR4 e duas moléculas de FGF, o que desencadeia a dimerização de FGFR, levando a autofosforilação de múltiplos resíduos de tirosina no domínio intracelular da tirosina-quinase [3], [25]. FGF19-FGFR4 tem sido proposto para desempenhar um papel na indução da proliferação de hepatócitos e carcinogénese [26]. Os anticorpos dirigidos contra FGF19 mostraram promessa terapêutico em xenoenxertos de tumor diferentes [27]. No entanto, o bloqueio de FGF19 pode agir sobre os receptores FGF diferentes [28].

Temos utilizado diferentes amostras de câncer de cólon e linhas celulares (SW480, SW620, SW48, KM12C e KM12SM) [29], [30], [31] para investigar a presença de SNPs ou mutações ativadoras em FGFR4 e caracterizar a sua relevância biológica como oncogene e alvo terapêutico no cancro colorectal. KM12C e KM12SM células epiteliais possuem fundo genético similar, diferindo nos seus propriedades metastáticas [31]. SW480 e SW620 são duas linhas celulares de cancro colorrectal isogênicos. SW480 foi isolado a partir do tumor primário do B um Duque de cancro colo-rectal, enquanto linha celular SW620 foi isolado a partir de um nó de linfa metastático do mesmo paciente [30]. células de cancro colo-rectal SW48 foi derivada de um tumor na fase C de Duke [30]. Estes cinco linhas de células diferem também nos níveis de expressão de proteína FGFR4 [8]. Em nosso estudo, não houve novos SNPs ou mutações ativadoras foram encontrados em FGFR4. No entanto, as experiências de perda de função revelou um papel importante de FGFR4 nas propriedades tumorigénicas de células de câncer colorretal, uma vez que seu esgotamento revogada proliferação, adesão, migração e invasão. FGFR4-silenciamento causou um aumento da regulação da expressão de E-caderina e para baixo-regulação do Caracol e outras transição mediadores (EMT) epiteliais-mesenquimais. Finalmente, demonstramos que FGFR4 segmentação foi capaz de bloquear o crescimento do tumor

in vitro

e

in vivo

.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

o Comitê de Ética da Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Madrid, Espanha) aprovou os protocolos usados ​​para o trabalho experimental com ratos.

linhas celulares, RNA Extração, anticorpos e inibidores

linhas celulares de cancro colorrectal KM12C e KM12SM [31], [32] foram obtidas do Dr. I. Fidler (MD Anderson). SW480, SW48 e linhas de células HEK293 que foram a partir de ATCC. As células foram cultivadas de acordo com protocolos estabelecidos [7]. O ARN foi extraído a partir de linhas de células e tecido normal emparelhado 20 /tumoral de doentes de cancro com o RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc.) de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA extraído foi quantificada com um espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies Inc.).

Um total de 15 anticorpos diferentes foram usadas, incluindo as proteínas relacionadas com a FGFR4 proteínas de sinalização e de controlo da via. Fonte, clonalidade e condições de utilização para todos os casos e técnica são especificados na Tabela S1. -FGFR4 anticorpo policlonal específico (sc-124, Santa Cruz Biotechnology) e controlo de anticorpo policlonal específico de GST-GE Healthcare foram usadas para experiências de direccionamento FGFR4. inibidores de FGFR foram PD173074 (Sigma) e TKI-258 (Novartis). PD173074 é um inibidor da pan-FGFR que induz a apoptose [33]. TKI-258 é, um inibidor de multi-quinase clinicamente relevantes, incluindo VEGFR e quinases PDGFR entre outros [34]. Outros inibidores foram: PP2 (Sigma) para SRC, JNK Inhibitor II e UO126 (Calbiochem) para a MEK1 /2. Eles foram usados ​​em 3 mM e 15 mM conforme relatado anteriormente [35].

Vectors, shRNAs, siRNAs e transfecções

PRS vetores contendo específica shRNAs (TI378641, TI378642, TI378643 e TI378644) para FGFR4 (NM_022963) e um shRNA controle não-eficaz contra qualquer sequência humana (TR30003) eram de Origene. As células estavelmente transf ectadas foram obtidas por infecção retroviral. Resumidamente, as células HEK293FT foram transfectadas com vectores PRS e pNGVL-gag-pol e vetores de embalagem pNGVL-VSVG usando jetPRIME Transfection Reagent (Polyplus). Após incubação das células durante 12-15 horas em meio isento de soro, o meio foi substituído com DMEM contendo FBS a 10% e penicilina /estreptomicina. No dia seguinte, meios contendo partículas lentivirais foi centrifugada, diluída 1:02 – 1:10 em meio DMEM contendo 10% de FBS e antibióticos e adicionado directamente às células de cancro colo-rectal SW480 e SW48. Após três dias de incubação, as células infectadas com cancro colorectal SW480 e SW48 foram seleccionados usando 1 ug /ml de puromicina (Sigma), durante 2-3 semanas. Em seguida, as células foram cultivadas com 0,5 ug /ml de puromicina.

FGFR4 siRNAs e controlos foram adquiridos da Sigma. Para as transfecções de ARNip, 5 × 10

5 as células foram semeadas em placas de cultura e mantidas em DMEM com 10% de soro fetal de vitelo a 37 ° C em 5% de CO

2 durante 24 h. As células foram transfectadas com 55 pmol siRNA usando 2 l de reagente de transfecção JetPrime em 200 ul de tampão JetPrime. Em seguida, 48 horas após a transfecção, as células foram analisadas por western blot e semi-quantitativa PCR [35].

Análise de Sequência, semi-quantitativa e quantitativa em tempo real PCR

cDNA foi sintetizado usando o kit Superscript III First Strand Synthesis (Invitrogen). Os iniciadores utilizados para obter a sequência FGFR4 foram previamente descrito [36]. Resumidamente, quatro pares de iniciadores (A, B, C e D) foram utilizados para obter toda a molécula por PCR em fragmentos de aproximadamente 1000 pb usando a polimerase Advantage 2 (Clontech). Exonuclease I (USB) e fosfatase alcalina de camarão (USB) foram adicionados aos produtos de PCR. Eles foram directamente sequenciados num sequenciador ABI7002 (Applied Biosystems).

O ADNc foi sintetizado como anteriormente e utilizado directamente para análise PCR semi-quantitativa de níveis de TGF-p 1 e ARNm de GAPDH em linhas celulares de cancro colorrectal. As reacções de PCR foram realizadas usando os seguintes iniciadores; humana TGF-β1, sentido 5′-ACCGGCCTTTCCTGCTTCTCA-3 ‘, anti-sentido 5′-CGCCCGGGTTATGCTGGTTGT-3′; GAPDH humano, sentido, 5’-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3 ‘, anti-sentido 5′-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3’. iniciadores específicos para FGFR1-3 utilizado para testar a especificidade de shRNAs e ARNsi dirigido contra FGFR4 foram: FGFR1, sentido 5′-CACAAGCCACGGCGGACT-3 ‘, anti-sentido 5′-TGATGCTCCAGGTGGCAT-3′; FGFR2, sentido 5’-CGTTGCCATTCAAGTGACTG-3 ‘, anti-sentido 5′-GACAAAATCTTCCGCACCATC-3′; e FGFR3, sentido 5’-CAGTTGGTCTTCGGCAGC-3 ‘, anti-sentido 5′-TGCTGCCAAACTTGTTCT-3’.

Para qRT-PCR, as reacções foram realizadas utilizando os iniciadores anteriormente descritos EMT marcadoras [37] e SYBR-Green PCR Master mix (Applied Biosystems), em triplicado. PCR e coleta de dados foram realizados em IQ5 (BioRad). Todos os quantitations foram normalizados utilizando GAPDH humano. Para a PCR com iniciadores semi-quantitativa, o par de iniciadores de D foi utilizado para determinar a quantidade de ADNc FGFR4, usando a amplificação com iniciadores específicos de GAPDH como controlo [36].

Análise Western Blot

Proteína os extractos de células de cancro colorrectal foram preparados e quantificadas com o kit de 2D-Quant (GE Healthcare) de acordo com protocolos anteriormente publicados [7]. Em seguida, 25? G de cada extracto de proteína foram corridos em paralelo utilizando 10% de SDS-PAGE. Para imunotransferência, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (Hybond-C Extra) utilizando equipamento semi-seco (Bio-Rad). Após o bloqueio, as membranas foram incubadas com anticorpos mono- ou policlonais específicos contra as proteínas seleccionadas. As membranas foram incubadas com diluições optimizadas com anticorpos primários seguido de incubação quer com HRP-anti-IgG de ratinho (Pierce) em 1:5000 diluição ou HRP-anti-IgG de coelho (Sigma) a 1:5000 diluição. proteínas reactivas específicas foram visualizados com SuperSignal West Pico máximo de sensibilidade do substrato (Pierce). A abundância das proteínas em ensaios de Western blot foi determinada por densitometria usando v4.6 Quantity One Software de Análise de 1D (Bio-Rad Laboratories).

A adesão celular, invasão, detecção de apoptose, proliferação, e cura de feridas Ensaios

Para os ensaios de adesão celular, placas de 96 poços foram revestidas com Matrigel (0,4 ug /mm

2) (BD Biosciences) em tampão de revestimento (0,1 M NaHCO

3 pH: 8,8) durante a noite a 4 ° C e, em seguida, incubadas com meio de aderência (0,5% de albumina de soro bovino em DMEM isento de soro) durante 2 h a 37 ° C para bloquear a ligação inespecífica. As células foram privadas sem soro, durante 5 h e marcadas com BCECF-AM (Molecular Probes) durante 30 min a 37 ° C, isolada com 2 mM de EDTA em PBS e ressuspensas em meio de adesão. Em seguida, 10

5 células foram adicionadas em triplicado a placas e incubadas durante 30 min. Para remover as células não aderentes, as placas foram lavadas duas vezes com DMEM. As células ligadas foram lisadas usando 1% de SDS em PBS e a fluorescência quantificadas por Varioskan flash multimodo Reader (Thermo Scientific). Para ensaios de invasão de Matrigel, 8 × 10

5 SW480 ou SW48 células foram re-suspensas em meio de invasão de filtros de poro de tamanho e carregou-se 8 um (DMEM contendo 0,5% de BSA livre de soro) revestido com 35-50 ul de 1 :3 diluição de Matrigel (BD Biosciences) em Transwells (Costar). Os compartimentos mais baixos de invasão câmaras foram cheias com meio contendo 10% de FBS (Gibco). Após 22 h de incubação a 37 ° C, as células não invasoras foram removidos a partir da superfície superior do filtro, e as células que migraram através do filtro foram fixadas com paraformaldeído a 4% (Sigma), coradas com violeta de cristal e as células invasoras contadas sob um microscópio. Para a cicatrização de feridas, as células SW480 e SW48 foram semeadas em triplicado a uma densidade de 10

6 células por poço em placas de 24 poços. Após a fixação, de 1 mm de largura da ferida foi produzido na monocamada de células, o meio de crescimento foi substituído e uma fotografia foi tirada (dia 0) em um microscópio Olympus equipado com CK40 uma câmara Olympus DP12 em 40 × ampliação. Imagens do mesmo campo, foram tomadas todas as 24 h.

Para os ensaios de detecção de apoptose, as células foram incubadas com mM H 1

2O

2 durante 16 horas sem soro. Em seguida, as células foram destacadas e incubado com FITC-anexina V (Miltenyi Biotec Inc.) e iodeto de propidio de acordo com as instruções do fabricante, e analisadas por citofluorometria (Coulter Epics XL). Para os ensaios de proliferação celular, foram realizados experimentos seguintes procedimentos estabelecidos [38], [39]. Resumidamente, o meio de crescimento foi mudado 24 horas após a sementeira (dia 0) e as células foram adicionalmente incubadas durante três dias. Em seguida, o meio foi removido e as células foram coradas com 100 ul de corante cromogénico 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (Sigma) a uma concentração final de 1 mg /ml em DMEM . As células foram ainda incubadas durante 1 hora a 37 ° C e 5% de CO

2. Em seguida, o meio foi cuidadosamente aspirado e 100 ul de DMSO (Sigma) foram adicionados a cada poço para romper as células. A absorvância foi lida a 570 nm. Todas as experiências foram realizadas três vezes em duplicado. Para a redução da proliferação, a viabilidade celular foi representada comparar o efeito da anti-FGFR4 ou anti-GST (como controlo) anticorpos ou inibidores específicos em comparação com células não tratadas (100% da proliferação) incubadas nas mesmas condições [39].

Microscopia confocal

as células foram fixadas com 1% de paraformaldeído e permeabilizadas com PBS-0,5% de Triton X-100 antes da incubação com o anticorpo específico FGFR4 ou TRITC-faloidina durante 1 h a 37 ° C . FGFR4 ou anticorpos de caderina-E foram detectados com o anticorpo anti-IgG de coelho marcado com AlexaFluor 488. As células foram observados com um microscópio confocal (TCS-SP5-AOBS-UV, Leica-Microsystems) após núcleo contracoloração com DAPI. As imagens foram adquiridas com uma objectiva de imersão em óleo 63 × usando o confocal Software Leica. imagens exibidas foram capturados nas mesmas seções nas diferentes amostras.

In vivo

xenoenxertos de tumores

ratinhos nus suíços (Charles River) foram utilizados para estudos de xenoenxerto de metástases e tumores . A Comissão de Ética do Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Madrid, Espanha) aprovou os protocolos utilizados para o trabalho experimental com ratos.

Para xenotransplantes de tumor, os ratos foram injectados por via subcutânea no flanco direito com 1 × 10

7 SW48 células de câncer colorretal estavelmente transfectadas em 0,2 mL PBS em Matrigel diluída 1:03. Os tamanhos dos tumores foram monitorizados pelo menos duas vezes por semana e cada animal foi sacrificado usando um

2 câmara de CO de acordo com as Diretrizes para Endpoints Humanos para Uso de Animais em Investigação Biomédica.

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas, excepto onde indicado, foram realizados com o Microsoft Excel. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Para a avaliação da significância estatística comparados entre os grupos todos os

p valores

foram derivadas de um teste estatístico bilateral com intervalo de confiança de 95%.

p

valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

FGFR4 mutacional de status em linhas celulares de cancro colorrectal e do Tecido Amostras

investigadas mutações FGFR4. em linhas celulares de cancro colorrectal e amostras de câncer que poderiam contribuir para o anticorpo reconhecimento por parte superexpressão ou ativação. O ARN total foi isolado e o cDNA sintetizado por retrotranscrição. ADNc foi utilizado como molde para determinar a presença de mutações.

No total, verificou-se 3 SNPs no ADNc FGFR4 em linhas celulares de cancro colo-rectal e 4 20 amostras de cancro (Tabela 1 e Figura S1). Observou-se três mutações no domínio extracelular e transmembranar de FGFR4 em amostras de doentes. Além Arg bem caracterizada

388 SNP [9], [15], que encontramos V10L localizada no péptido sinal e domínios de imunoglobulina P136L entre 1 e 2 (Figura S1). Estes dois SNPs foram previamente relatado, sem correlação com manifestações patológicas [40], [41]. Em KM12C e células de câncer colorretal KM12SM, observou-se a presença do Arg

388 SNP, enquanto SW480 e SW48 não continha este SNP. Em 20 amostras com câncer colorretal, 60% dos pacientes apresentaram o polimorfismo Arg

388, enquanto que a prevalência das outras duas mutações foi de 55% para P136L e 15% para V10L. Estes dados estão de acordo com dados publicados anteriormente, em que 50% dos tumores apresentam o Arg

388 SNP, 53% do P136L polimorfismo e 30% dos tumores contêm V10L [9].

Nós não encontramos nenhuma mutação ativadora na FGFR4 ou qualquer mudança de nucleotídeos de anteriormente para FGFR4. Em seguida, estes dados sugerem que o aumento da expressão de FGFR4 poderia ser responsável pela indução de auto-anticorpos em pacientes com CCR e maior invasão e metástase no câncer de cólon.

FGFR4 Knockdown reduzida adesão, migração e invasão de Colorectal Cancer Cells

Para estudar o papel da FGFR4 superexpressão na tumorigênese e metástase, estudamos o efeito da expressão FGFR4 em SW48, SW480 e linhas celulares de cancro colorectal SW620, que não continha o Arg

388 polimorfismo. células SW480 e SW48 foram estavelmente transfectadas com quatro shRNAs segmentação FGFR4 além de um controlo scrambled shRNA. células SW620 foram transitoriamente silenciados com siRNA. shRNA # 41 apresentaram a maior diminuição na expressão de proteína FGFR4 (Figura 1A) e os níveis de ARNm (Figura 1B) em ambos os tipos de células. shRNA # 44 foi também eficaz na redução da expressão da proteína, em particular em células SW48. níveis de redução semelhantes foram obtidos com silenciamento de ARNsi transiente em células SW620. Para estudar o efeito da FGFR4 silenciar sobre outros membros da família, realizou-se RT-PCR. níveis de mRNA para FGFR1, FGFR2 e FGFR3 permaneceu inalterada após FGFR4- silenciamento, confirmando a especificidade para FGFR4 (Fig. 1B). Análise por imunofluorescência mostrou que a expressão foi significativamente reduzida FGFR4 em SW480 e SW48 após a transfecção com vectores de shRNA 41, embora alguma coloração residual foi observado no núcleo das células SW48 (Figura S2).

Quatro shRNAs dirigidos contra diferentes exões de e FGFR4 um shRNA mexidos foram utilizados para obter células de cancro colorrectal transfectadas de forma estável após selecção com puromicina. Além disso, transiente siARN FGFR4-silenciamento foi levada a cabo em células de cancro colo-rectal SW620. A. Análise Western blot da expressão FGFR4 em linhas celulares SW480 e SW48 transfectadas estavelmente e transientemente transfectadas células SW620. Tubulina foi utilizada como controlo de carga. B. A análise de PCR semi-quantitativa de FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4 expressão e utilizando iniciadores específicos em três linhas de células diferentes. GAPDH foi usada como controlo. C. A proliferação foi determinada por ensaios de MTT depois de 24 h de cultura. A densidade óptica foi significativamente diminuído por FGFR4 knockdown (*, P 0,01; **, p 0,001). D. mexidos e silenciados células foram cultivadas até confluência e as suas capacidades migratórias foram analisados ​​num ensaio de cicatrização a cada 24 h até confluência. Imagens representativas de o ensaio de cicatrização da ferida são mostrados. velocidade de migração (mm /h) de células mexidos e FGFR4-silenciados foi calculada como a distância percorrida em 96 horas. E. celular adesão ao Matrigel de células FGFR4-silenciados ou mexidos, depois que as células fome durante 5 h em meio sozinho. F. SW480 e SW48 mexidos células mostraram aproximadamente 2 vezes maior do que a invasão shRNA # 41 FGFR4 células estavelmente transfectadas. Os dados para todas as experiências representam a média ± desvio padrão de 3 experiências independentes.

valores p

de todos os experimentos são mostrados.

Para avaliar as propriedades tumorigénicas, determinou-se o crescimento celular, adesão, migração e invasão de células silenciou-FGFR4. Utilizando ensaios MTT, FGFR4-silenciados SW480 ou células SW48 mostrou uma taxa de proliferação celular reduzida quando comparada com células mexidos (Figura 1C). Para investigar o efeito sobre a migração de FGFR4, FGFR4-silenciados linhas celulares SW480 e SW48 foram semeadas em placas de 24 poços e analisados ​​por ensaios de cura de feridas. células silenciados-FGFR4 não foram capazes de fechar a ferida, mesmo depois de 96 h (Figura 1D). A migração retardada era mais importante para SW48 (3 vezes) do que as células SW480 (2 vezes). Estes resultados são semelhantes aos relatados anteriormente usando duas linhas diferentes de células CRC, HCT116 e HT29 e ensaios diferentes [15].

Além disso, usando ensaios de Matrigel, houve uma diminuição importante na capacidade de adesão e invasão de células silenciados-FGFR4 em ambas as linhas celulares. células SW480 diminuiu sua capacidade de adesão em 2,5 vezes, enquanto que as células SW48 mostrou respeito redução de quase 4 vezes a células mexidos (Figura 1E). Invasão foi aproximadamente 2 vezes reduzida por FGFR4 knockdown em ambas as linhas celulares (Figura 1F). Colectivamente, estes dados suportam um papel importante de FGFR4 na tumorigênese e invasão de cancro colo-rectal, sendo mais relevante para as células SW48 metastáticos.

FGFR4 silenciamento reduziu a expressão de indutores do mesenquimais Fenótipo

Desde adesão celular, migração e capacidade invasiva de células epiteliais estão associados à transição epitelial-mesenquimal (EMT), decidimos investigar alterações nos indutores EMT. Após FGFR4 silenciamento, estudamos as alterações nos níveis de Snail1 (SNA1), TWIST1, ZEB1, e E-caderina (CDH1) expressão de mRNA por PCR em tempo real ou PCR semi-quantitativo (TGF-p1). Em SW480 e SW620, FGFR4 knockdown causou uma diminuição significativa na EMT indutores TGF-p1, SNA1 e torcer acompanhada por um grande aumento no marcador epitelial CDH1 (Figura 2A, B). células SW48 apresentaram uma redução maior em SNA1, TGF-p1 e TWIST1and um menor aumento CDH1. ZEB1 diminuição foi mais significativa em SW480 do que nas linhas de células metastáticas SW620 e SW48. marcadores epiteliais e mesenquimais foram analisados ​​ao nível da proteína por western blot. Caracol e E-caderina confirmou os resultados de mRNA. Vimentina, um marcador mesenquimais, foi reduzida após FGFR4 silenciamento nas três linhas celulares (Figura 2C). Apenas pequenas alterações na expressão de MT1-MMP foram detectados em células SW480 e SW48 após FGFR4-silenciamento. No entanto, observou-se um grande aumento da expressão de MT1-MMP em células SW620, que é paralelo aos níveis de E-caderina indicativo de uma redução do fenótipo mesenquimal de expressão.

A. ADNc sintetizado a partir de ARN total de células estavelmente e transientemente-silenciadas e de controlo foi sujeito a qRT-PCR utilizando iniciadores específicos para os indutores EMT SNAI1, TWIST1, ZEB1 e CDH1, utilizando GAPDH para normalização. Os dados representam a média ± DP de duas experiências. B. O mesmo ADNc foi submetido a análise semi-quantitativa por RT-PCR para amplificar o TGF-p1, utilizando GAPDH como controlo. C. SW480 e SW48 mexidos e células silenciados-FGFR4 foram lisadas e sujeitas a análise de WB utilizando anticorpos específicos contra as proteínas e marcadores indicados EMT. A abundância de cada proteína foi quantificada por densitometria. Tubulina foi utilizada como controlo de carga. D. Análise de imunofluorescência de E-caderina nas células SW480 e SW48 mexidos e silenciadas. DAPI foi utilizado para contracoloração do núcleo em azul. E-caderina coloração foi em verde.

O aumento na expressão da caderina-E, depois de FGFR4 knockdown, em junções aderentes e contatos célula-célula foi confirmada por imunofluorescência (Figura 2D). As diferenças na expressão de E-caderina eram mais evidentes na membrana celular, o que sugere que FGFR4 silenciamento facilitado a expressão de E-caderina funcional na superfície das células e reversão para um fenótipo epitelial. Colectivamente, estes dados utilizando três linhas celulares de cancro colorrectal diferentes confirmar que FGFR4 é um efetor importante na EMT. FGFR4 knock-down provoca uma redução do caracol e um aumento da caderina-E com o consequente efeito na adesão, migração e invasão.

Análise sinalização em células silenciou-FGFR4. Papel do FGFR4 na célula de sobrevivência

Para determinar o efeito da actividade de sinalização a jusante FGFR4, analisamos o efeito de silenciamento-FGFR4 nas vias de sinalização após activação com FGF19 ± heparina em comparação com meio isento de soro. Após FGFR4 knockdown, activação de phosphoSRC, phosphoERK1 /2 e phosphoAKT foram significativamente menores no SW480 e SW48 (Figura 3A). ERK1, em particular, mostraram uma redução quase completa. No que diz respeito AKT, este efeito sugere um efeito mediado por FGFR4 através de AKT em EMT e sobrevivência celular. Para testar o efeito sobre a sobrevivência de FGFR4, as células foram submetidas a apoptose induzida por peróxido de hidrogénio. células silenciados-FGFR4 mostraram uma diminuição significativa de 20-30% em comparação com a sobrevivência em células mexidos após tratamento com peróxido de hidrogénio (Figura 3B). Sem tratamento, ovos mexidos e células de câncer colorretal FGFR4-silenciados SW480 e SW48 apresentaram níveis similares de apoptose. Este efeito FGFR4 na apoptose celular em resposta ao stress oxidativo pode desempenhar um papel no cancro colo-rectal avançado, facilitando a sobrevivência de células de cancro colorrectal metastático.

. Mexidos e células SW480 e SW48 silenciados-FGFR4 foram deixados em jejum, e incubadas com FGF19, heparina, ou FGF19 mais heparina durante 30 minutos em meio DMEM. Em seguida, as células foram lisadas e sujeitas a análise de WB utilizando anticorpos específicos contra AKT fosforilado e total, a ERK1 /2 e SRC. Tubulina foi utilizada como controlo de carga. B. As células foram incubadas em DMEM suplementado com FBS a 10% e antibióticos na presença ou ausência de H

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2 durante 16 horas, e submetida a ensaios de detecção de apoptose. Unt., Células não tratadas. Os dados mostraram os resultados de uma experiência representativa de três. C. invasão Matrigel de células através mexidos e silenciados tratados com inibidores de MEK1 /2 (UO126), JNK, e SRC (PP2), como indicado. Os dados representam a média ± desvio padrão de 3 experiências independentes.

Para estudar um efeito sinergético para aumentar a inibição FGFR4 nas vias de sinalização na invasão celular, utilizou-se inibidores específicos em células alvo e mexidos. UO126 (um MEK1 /2 a montante inibidor de ERK1 /2) e PP2 (inibidor SRC) reduziu a capacidade de invasão de células SW480 e SW48. Esta redução foi muito mais pronunciado na mexidos do que em células silenciados (Figura 3C). O inibidor de JNK causou apenas um pequeno efeito sobre a capacidade de invasão das células SW480 e SW48 mexidos e silenciadas. Colectivamente, estes resultados indicam que FGFR4-knockdown causou uma redução significativa de SRC e MEK1 /2-ERK1 /invasão de células SW480 e SW48, semelhante à causada por inibidores específicos em células mexidos 2-mediada.

FGFR4 como terapêutica alvo no cancro colorectal

seguido duas estratégias diferentes para provar o valor terapêutico da FGFR4 no cancro colorectal. Primeiro, testamos duas quinase inibidores PD173074 e TKI-258. Em seguida, utilizou-se células silenciados-FGFR4 para estudar a dependência do FGFR4 para o crescimento de tumores em xenoenxertos de ratinho. linhas de células metastáticas (SW48 e KM12SM), que expressam mais FGFR4, foram mais sensíveis a inibidores químicos do que as linhas fracamente ou não metastáticos de células (KM12C, SW480) (Figura 4A). Multi-quinase TKI de inibidor foi mais eficaz do que o inibidor da DP pan-FGFR para reduzir a proliferação do cancro colo-rectal de um modo dependente da dose (

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valor 0,001), em particular em linhas de células metastáticas. A 80 concentração nM, a inibição foi mais elevada em linhas celulares de cancro colorrectal metastático (20% em SW48 e 60% em KM12SM) do que em células não metastáticas ou células de controlo. Em células KM12, a inibição TKI foi eficaz até 1 concentração nM. A linha celular de referência HEK293, que expressa níveis baixos de FGFR4, foi inibida numa extensão menor. A inibição do crescimento celular foi associada à inibição de mesmos reguladores a jusante afectadas por vias de sinalização FGFR4 (Figura 4B). Os efeitos mais significativos foram obtidos com TKI-258. Observou-se uma grande redução ( 90%) na activação de SRC, uma diminuição significativa (50-80%) em phosphoERK1 /2 e uma redução no fraco phosphoAKT em ambas as linhas celulares (Figura 4B). A diminuição na activação de vias de sinalização FGFR4 foi semelhante à observada após FGFR4-silenciamento, confirmando a implicação de FGFR4. Para confirmar a especificidade FGFR4, foram utilizados anticorpos anti-FGFR4 comerciais em células cancerosas colorectal SW480 e SW48. Observou-se uma inibição significativa da proliferação, dependente da dose, em comparação com células de controlo (

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valor 0,01) (Figura S3). linhas celulares de cancro colo-rectal SW480 e SW48 mostraram a inibição do crescimento após tratamento com anticorpo, até 75% e de 60% a 400 nm e 40% e de 55% a 100 nM, respectivamente.