Abstract
Fundo
Uma pesquisa abrangente de DNA metilado genes genes supressores de tumor candidato identificados que foram provados para ser envolvido no processo de apoptose do
p53
pathway . Neste estudo, nós investigamos
p53
mutação em relação a essa alteração epigenética no cancro gástrico primário
Métodos
Os perfis de metilação dos genes 3:.
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
, e
CCNA1
, que estão envolvidos na via supressora de tumores p53 em combinação com
p53
mutação eram examinado em 163 cancros gástricos primários. O efeito de reversão epigenética em combinação com medicamentos quimioterápicos em apoptose também foi avaliada de acordo com o tumor
status de p53
mutação.
Resultados
p53
gene mutações foram encontradas em 44 tumores gástricos primários (27%), e super-alta metilação de qualquer um dos 3 genes foi encontrada apenas nos casos com tipo selvagem
p53
. Superior
p53
via aberração foi encontrada em casos ao sexo masculino (p = 0,003), do tipo intestinal (p = 0,005), e do tipo não infiltrante (p = 0,001). O
p53
grupo via aberração apresentaram menos recorrência nos gânglios linfáticos, órgãos distantes, e do peritoneu do que o
p53
grupo não-aberração. Na linha de células de câncer gástrico NUGC4 (
p53
tipo selvagem), o tratamento epigenética aumentada apoptose por drogas quimioterápicas, parcialmente através de
actividade de transcrição p53
. Por outro lado, na linha KATO III célula cancerosa (
p53 mutante
), o tratamento epigenética sozinho induziu apoptose robusta, sem trans-ativação de
p53
.
conclusão
No cancro gástrico,
p53
existem vias relevantes e não relevantes, e tumores com um ou outro tipo via exibiu características clínicas únicas. tratamentos epigenéticas podem induzir apoptose parcialmente através
p53
activação, no entanto os seus efeitos apoptóticos pode ser explicada em grande parte pelo mecanismo que não seja através
p53
vias
Citation:. Waraya M, Yamashita K, Ema a, Katada N, Kikuchi S, Watanabe M (2015) Associação exclusiva de
p53
Mutation com Super-alta metilação de Genes supressores de tumor no
p53
Caminho em um único gástrica Fenótipo do cancro. PLoS ONE 10 (10): e0139902. doi: 10.1371 /journal.pone.0139902
editor: Qian Tao, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 31 de março de 2015; Aceito: 18 de setembro de 2015; Publicação: 08 de outubro de 2015
Direitos de autor: © 2015 Waraya et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela Grant-in Aid para Pesquisa do Câncer do Ministério da Saúde, trabalho e Bem-estar do Japão e pela Fundação japonesa para multidisciplinar Tratamento do Câncer. As agências de financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados ou análise; na interpretação dos resultados; na preparação do manuscrito; ou na decisão de enviar o manuscrito para publicação
CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
metilação do DNA desempenha um papel central na. silenciamento de gene de genes supressores de tumores em cancro humano. Um gene de metilação específico do cancro é uma entidade rara, e aberração frequente de metilação em tecidos tumorais primárias é ainda mais raro [1, 2]. Foram identificados genes metilados específicos do cancro em cada órgão utilizando um microarray farmacológico desmascaramento (PUM) [1, 2] e uma PUM modificado [3-5]. Foram identificados vários genes supressores de tumor candidato (ETG), tais como
PGP9
.
5
na cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) [2], esôfago SCC (ESCC) [6] , câncer gástrico [4], e outros tipos de câncer [7],
NMDAR2B
em ESCC [3] e câncer gástrico [8], e
CCNA1
em HNSCC [2]. Os perfis de metilação desses genes foram validados por outros grupos e /ou mesmo em outros tipos de câncer [9-14]. Os genes que mostraram mais de 60% de metilação em tecidos tumorais foram designados como genes altamente relevantes metilados (HRMGs) [15]. Além disso, em comparação ainda mais a frequência de tais metilação aberrante de HRMGs candidatos com outros relatos de câncer gástrico [16], e genes candidatos foram reduzidas a genes específicos.
Mais importante ainda, esses genes supressores de tumor candidato tinha sido relatado para ser
p53 supressor de tumores via
(Fig 1). Por exemplo,
PGP9
.
5
interage diretamente com
p53
e estabiliza
p53
inibindo sua degradação através da via ubiquitination em hepatocelular [17] , mama [18], e câncer de nasofaringe [19].
NMDAR2B
induz a apoptose através da sua interacção directa com
DAPK
[20], que, por sua vez, tem sido demonstrado para neutralizar a transformação induzida por activação de um oncogene por
p19ARF
/
p53
dependente checkpoint apoptose [21].
CCNA1
é um
p53
gene induzida que medeia a apoptose, G2 /M detenção, ea catástrofe mitótica no renal humana, ovário e cancro do pulmão células [22]. Assim, o
p53
via é ablated em tecidos tumorais de cânceres primários de forma epigenética juntamente com tipo selvagem
p53
, no entanto não houve nenhum relatório sobre a associação de
p53
mutação e epigenéticos alterações em tecidos tumorais primárias.
neste estudo, nós investigamos o estado de metilação de DNA de genes no
p53
via que são anormalmente regulado de forma epigenética no cancro gástrico primário, e comparado o seu padrão de metilação com o
p53
estado de mutação, a fim de determinar o significado clínico da
p53
aberração fenótipos.
Métodos
as linhas celulares e amostras de tecido
as linhas celulares de cancro gástrico, KatoIII, NUGC4, AZ521, e SH10 foram adquiridos a partir do RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japão). E a linha celular de carcinoma hepatocelular HepG2 foi adquirido a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Estas linhas de células, excepto AZ521 e HepG2 foram crescidas em meio RPMI 1640 (GIBCO, Carlsbad, CA) suplementado com soro bovino fetal a 10%. AZ521 e HepG2 foram crescidas em meio DMEM (GIBCO), suplementado com 10% de FBS
.
pares (n = 163) de, (FFPE) tecido de tumor fixado com formalina embebido em parafina e as correspondentes amostras de mucosas normais obtidos em pelo menos 5 cm da borda do tumor foram obtidas de pacientes submetidos a cirurgia entre 1 de Janeiro de 2000 e 31 de dezembro de 2010. Todos os pacientes com a fase II /III GC tinham sido submetidos a uma ressecção potencialmente curativa para o GC primário, e foi submetido adjuvante S -1 quimioterapia após a cirurgia (S-1 de tratamento padrão). terapia neo-adjuvante não foi realizada neste grupo de pacientes. Os tumores foram classificados utilizando a classificação TNM de acordo com o 7
th edição do União de Controle do Câncer Internacional (UICC) ea 14
th edição da Classificação japonesa de carcinoma gástrico (JCGC). As características dos pacientes são apresentados na Tabela 1. Todas as amostras de tecido foram coletadas no Hospital Universitário de Kitasato, e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes e doadores saudáveis antes da coleta da amostra. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Kitasato de Ética.
Análise do
genes p53
mutantes usando polimorfismo de cadeia simples conformação (SSCP)
As mutações no exons 5, 6, 7 e 8 do
p53
gene foram testados por análise não-radioativo polimorfismo de conformação de cadeia simples (SSCP), que foi realizada utilizando os nossos métodos previamente estabelecidos [23]. amostras de produtos de PCR de 10 ul foram diluídas três vezes com tampão de gel de carga (95% de formamida desionizada, 20 mmol /L de EDTA, 0,01% de azul de bromofenol, e 0,01% de cianol de xileno) e aqueceu-se a 95 ° C durante 10 min, seguido de paragem no gelo. Alíquotas de 3 mL foram aplicados em géis de poliacrilamida modificados (PAFG: 18% de poliacrilamida-Bis (49: 1), TBE 0,5x, 10% de glicerol, 10% de formamida, 0,05% de persulfato de amónio e 30 ml de TEMED) de dimensões 120 mm x 150 mm x 0,35 milímetros. A electroforese foi realizada com 1,5 x TBE tampão de corrida a 500 V e 30 mA durante 1 hora à temperatura ambiente. As bandas foram detectadas por coloração utilizando géis de uma mancha de prata mais Kit (Bio-Rad, Hercules, CA), seguindo-se a fixação, a lavagem, o desenvolvimento, e a paragem da reacção. bandas mutantes detectados por PCR-SSCP foram evidentes na diluição 1:64 de alelos mutantes.
tratamento com bissulfito de ADN extraído
O ADN genómico a partir de tecidos FFPE e linhas celulares foi extraído utilizando o QIAamp DNA FFPE Tissue kit (QIAGEN Ciências, Maryland, MD) e o kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN) de acordo com os protocolos do fabricante. Para a desnaturação do ADN, 2 ug de ADN genómico foi incubada com 5 pg de ADN de esperma de salmão em 0,3 mol /l de NaOH, durante 20 minutos a 50 ° C. A amostra de ADN foi então diluída com 500 ul de uma solução contendo 2,5 mol /l de metabissulfito de sódio (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmole /L de hidroquinona (Sigma) //l de solução de hidróxido de sódio a 0,4 mol, e foi incubada a 70 ° C durante 1,5 horas. A amostra foi então aplicada a uma coluna (Assistente DNA Clean-Up System Inc. Promega, Madison, WI), incubou-se com 0,3 mol /l de NaOH, durante 10 minutos, e subsequentemente tratado com 3 mol /L-acetato de amónio durante 5 minutos. A amostra foi precipitada em etanol a 100%, e o ADN foi ressuspenso em 50 ul de lote contendo 10 uM de Tris-HCl, pH 8 e 2,5 mM de etileno-diamina-tetra acético (EDTA), pH 8, e foi subsequentemente amplificado por uma cadeia de polimerase reacção (PCR). tratamento com bissulfito resulta na modificação química de não metilados, mas não metilados, citosinas a uracilos, permitindo a distinção entre o ADN metilado e não metilado genómico.
-quantitativa-metilação de PCR específica (Q-MSP)
Para a análise de metilação quantitativa, PCR específica para a metilação do TaqMan (Q-MSP) foi levada a cabo usando o iQ ™ Multiplex Powermix (Bio-Rad) em triplicado no iCycler iQ ™ real Time PCR Detection-sistema (Bio-Rad). As condições de PCR e sequências são fornecidos na Tabela S1. As diluições em série de bissulfito modificado CpGenome ADN metilado universal (Chemicon International, Temecula, CA) foram utilizados para construir a curva de calibração em cada placa como controlo positivo e metilação de ADN não metilado universal CpGenome (Chemicon International) foi utilizado como controlo negativo. O valor metilação (valor TaqMeth) foi definida como a proporção de metilado
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
,
CCNA1
, ou
DAPK
normalizado para metilado
β-actina
, que foi então multiplicado por 100.
coloração imuno-histoquímica de PGP9.5, NMDAR2B e CCNA1
para imunocoloração, desmascaramento antigénio foi realizada com imersão em autoclave, a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação em 3% H
2O
2 /metanol durante 5 minutos, e a ligação do anticorpo não específica foi bloqueada por incubação com 1% de soro normal de cavalo diluído para 30 minutos. As secções foram então incubadas a 4 ° C durante a noite com os anticorpos seguintes: anticorpo policlonal de coelho PGP9.5 (diluição de 1:. 200, Nonus Biogenesis), anticorpo de coelho policlonal NMDAR2B (diluição de 1: 100, Millipore), ou o rato Ciclina A anticorpo monoclonal (6E6, diluição de 1:50, Leica Biosystems Newcastle. Ltd). Os complexos imunitários foram detectados com o kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Estes complexos imunitários foram detectados utilizando o substrato de 3,3′-diaminobenzidina (Vector) como um cromogénio (PGP9.5 1,5 minutos, 6 minutos, NMDAR2B CCNA1 10 minutos). As secções foram contrastadas com hematoxilina.
tratamento epigenética com 5-Aza-DC e TSA, e o tratamento quimioterápico com CDDP
As células foram divididas e semeadas a uma densidade baixa (1×10
6 /T-75 balão) 24 horas antes do tratamento. As células foram, em seguida, tratada a cada 24 horas durante 4 dias com 1 ou 5? M de 5-aza-2′-desoxicitidina (5-Aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) dissolvido em ácido acético a 50% foram tratados ou simulada com PBS incluindo a mesma quantidade de ácido acético. Tal como indicado, 100 nM de trichostatinA (TSA; Sigma-Aldrich). E /ou 12,5 uM de cis-diaminodicloroplatina (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japão) foi adicionado para as 24 horas finais
Western blotting
a proteína total foi extraído a partir de linhas celulares que foram tratadas com epigeneticamente /sem tratamento quimioterapêutico, e foi submetido a análise de transferência de Western utilizando os anticorpos seguintes: anticorpo monoclonal anti-p53 de ratinho (1C12, diluição de 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) ou
2a anticorpo monoclonal de ratinho anti-IgG-β actina (diluição de 1: 10000, Sigma-Aldrich)
ensaio de repórter de p53
As células (2 x 10
4 células /placa de 96 poços) que foram epigenetically tratados com /sem tratamento quimioterápico foram transfectadas com um
vector p53
repórter (QIAGEN) utilizando kits reporter Signal ™ Pathway ( Qiagen) e o reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Após 24 horas de incubação, a actividade repórter foi medida utilizando o Sistema de Ensaio Repórter Dual-luciferase (Promega). As transfecções foram efectuadas em triplicado e analisados utilizando o software SoftMax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Ensaio de Apoptose
As células tratadas (1x 10
5 células /amostra) foram coradas com anexina V e 7-AAD (reagente Goiaba nexina, Guava Technologies, Hayward, CA) para a discriminação de células em apoptose precoce e tardia, respectivamente. O experimento foi realizado utilizando o PCA Sistema de goiaba, realizada em triplicado e analisados utilizando CytoSoft 2.1.5 software (Guava Technologies).
A análise estatística
O teste exato de Fisher ou de Mann-Whitney teste foi utilizado para variáveis categóricas, e estudante de
t
-test foi utilizado para variáveis contínuas. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (SD). O método de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar as taxas de sobrevivência cumulativos, e as diferenças nas taxas de sobrevivência foram avaliados através do teste log-rank. sobrevida livre de recidiva (RFS) e sobrevida global (OS) foram medidos a partir da data da operação para a data de recorrência e morte, ou o último acompanhamento. No que respeita à RFS ou OS, os pacientes que sobreviveram por mais de 60 meses (5 anos) foram analisados como sobreviventes. P 0,05 foi considerado como indicativo de significância estatística. Todas as análises estatísticas foram realizadas com pacotes de software SAS (SAS Institute, Cary, NC).
Resultados
p53
gene de estado e de metilação perfis de
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
,
CCNA1
, e
DAPK
em pStage II-III câncer gástrico
p53
mutações foram identificadas em 44 de 163 pacientes primários gástricos câncer (27%) por análise SSPC.
mutação p53
gene não têm relevância prognóstica (Fig 2A). Em seguida, analisamos os perfis de metilação de
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
,
CCNA1
, e
DAPK
nestes tecidos usando Q-MSP. O valor TaqMeth de todos os genes foi maior em tumores primários de câncer gástrico com tipo selvagem
p53
do que naqueles com
p53
(ordem de metilação do gene mutante:.
PGP9
5 Restaurant
NMDAR2B Art
CCNA1 Art
DAPK
) (Fig 3A e S1 e S2 Figs). A metilação do promotor DNA foi significativamente maior para
CCNA1
(p 0,0001) e
PGP9
5
(p = 0,03), e marginalmente significativamente maior para
NMDAR2B
(p = 0,10) e
DAPK
(p = 0,05) no cancro gástrico primário em comparação com a mucosa normal correspondente. Importante, um nível super-alta metilação do
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
, e
CCNA1
foi encontrada exclusivamente em tumores primários sem
p53
mutação, os valores TaqMeth de corte foram de 50, 163 e 133, respectivamente (Fig 3A). Tal super-alta metilação do
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
e
CCNA1
foi encontrado em 14, 19 e 8 amostras respectivamente, e algumas destas amostras foram sobrepostos (Figura 3B).
DAPK
não exibir esta tendência, porque o
DAPK
nível de metilação foi bastante elevada nos correspondentes tecidos normais da mucosa de uma parte considerável dos casos (S2 FIG).
(a) de acordo com o
p53
estado de mutação do gene e (B) de acordo com o
p53
grupo aberração.
(a) a metilação dos genes indicados foi analisada utilizando valores de Q-MSP e TAqMeth em tumores com
p53
tipo selvagem foram comparados com aqueles com
p53
mutação. O valor limite para determinação de que um gene foi metilado foi determinado como sendo o valor máximo de TaqMeth
p53
tipo selvagem. (B) tumores com
p53
tipo selvagem ou
p53
mutação foram comparados em termos da presença de super-alta metilação dos genes indicados. Super-alta metilação foi definido que pelo menos um gene mostrou maior valor TaqMeth de cada limiares entre os três genes.
análise imuno-histoquímica de PGP9.5, NMDAR2N e expressão da proteína CCNA1 no cancro gástrico primário
coloração imuno-histoquímica para PGP9.5, NAMDR2B e expressão da proteína CCNA1 foi então levada a cabo tanto em casos de super-alta metilação e aqueles com baixa metilação desses genes. Observou-se uma forte redução na expressão de PGP9.5, NMDAR2B e CCNA1 em tecidos de cancro gástrico primárias quando a metilação do DNA promotor foi super-alta (Figura 3). Por outro lado, há uma diminuição na expressão da proteína de PGP9.5, NMDAR2B, ou CCNA1 foi encontrado quando a metilação do DNA promotor foi baixa (Figura 4).
coloração imuno-histoquímica de PGP9.5, NMADR2B, e CCNA1 no tumor primário com ou sem hipermetilação da região promotora do gene correspondente (ampliação original, X100, barras de escala, de 100 m).
análise clínico-patológica em câncer gástrico primário com estágio patológico II /III câncer gástrico com o tratamento padrão
características clínicas e prognóstico (RFS 5 anos e OS) foram então analisados de forma univariada no câncer gástrico em estágio patológico II /III câncer gástrico com o tratamento padrão (cirurgia mais S- pós-operatória 1 administração) (Tabela 1). Nós classificamos os pacientes com câncer gástrico em 3 categorias com base no
p53 estado de mutação
, bem como o estado de metilação do DNA de
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
e
CCNA1
, que designamos como categorias genômicas e epigenéticos, respectivamente (GEC). Estas três categorias foram
p53 mutante
,
p53
tipo selvagem com super-alta metilação (SHM) dos 3
genes p53
pathway acima (
p53
WT /SHM), e
p53
tipo selvagem sem (w /o) SHM (
p53
WT w /o SHM).
Curiosamente, os grupos de pacientes classificados com base em GECS foram significativamente correlacionados com sexo (p = 0,0003), idade (p = 0,08), histologia de Lauren (p = 0,005) e padrão de infiltração (p = 0,001), mas não com fatores prognósticos, tais como fatores de estadiamento. Os grupos de pacientes classificados com base em GECS também mostrou que
p53 mutante
e
p53
grupos WT /SHM foram semelhantes em termos do número de pacientes para cada característica clínica, mas diferiu a este respeito quando comparado com o
p53
WT w /o grupo SHM. Assim, designado recentemente os antigos grupos (o
p53 mutante
mais os
p53
WT /grupos SHM) como o
p53 grupo
aberração, eo último grupo (
p53
WT w /o SHM) foi designado como o
p53
grupo não-aberração.
Embora o prognóstico não foi significativamente diferente entre os grupos categorizados de acordo com a GEC (Fig 2B ), mais recorrências foram encontrados no
p53
grupo aberração em relação ao
p53
grupo não-aberração (Tabela 1, não houve diferença estatisticamente significativa). Esta tendência foi preservada em termos do padrão de repetição de cada um dos nódulos linfáticos, peritoneu, e órgãos distantes (Tabela 2), sugerindo que o
p53 grupo
aberração é provável que exibem um fenótipo clinicamente único, mesmo a partir de um ponto de vista do prognóstico. Quando apenas os casos com recorrências foram analisados, o
grupo p53
aberração foi novamente significativamente associada com histologia de Lauren (Tabela 2, P = 0,01), porém não houve padrões de recorrência que eram exclusivos para
p53
aberração.
por outro lado, o tipo difuso de câncer gástrico mostrou significativamente melhor prognóstico do que o tipo intestinal de câncer gástrico no
grupo p53
aberração (Fig 5A). Uma vez que esses pacientes tendem a ser distribuído a um estágio mais avançado, esses dados de sobrevivência sugeriu que S1 adjuvante pós-operatório quimioterapia é mais eficaz para o cancro gástrico tipo difuso do que para câncer gástrico tipo intestinal em casos com
p53
via aberração (Fig 5B).
(curvas A) de sobrevivência de tipo intestinal foram comparados com os de cancro gástrico tipo difuso com pStage II /III. (B) a distribuição de estágio do câncer de acordo com as conclusões
grupo p53
aberração e histológicas.
Finalmente, como dados de referência (Tabela 1), análise de prognóstico univariável para RFS e OS de todos pacientes identificados os possíveis fatores prognósticos clinicamente significativas, que representam a sobrevivência pobre como o sexo (P = 0,03, P = 0,1), idade ≥67 anos (P = 0,009, P = 0,001), localização do tumor superior (P = 0,06, P = 0,1), 14
th JGCA /7
th UICC pT (P = 0,08, P = 0,4), a 14
th JGCA pN (P = 0,001, P = 0,06), ea 14
th JGCA /7
th estágio UICC (P 0,0001, P = 0,03).
tratamento induziu a expressão da proteína p53 epigenética, concordante com a atividade transcricional p53
tratamento epigenética de células de câncer gástrico NUGC4 linhas (tipo selvagem
p53
) com 5? M de 5-aza-2′-desoxicitidina ou 5? M de 5-aza-2′-desoxicitidina mais tricostatina a apoptose induzida robusta na ausência do agente quimioterapêutico CDDP. tratamento adicional com CDDP aumentada ainda mais significativamente estes efeitos apoptóticos (Fig 6c). Curiosamente, a CDDP em combinação com tratamentos epigenética aumento robustamente o nível de proteína p53, que parcialmente, mas não totalmente, que se reflecte
p53
actividade de transcrição de um gene repórter da luciferase (Fig 6A e 6B). Estes achados sugerem que
actividade de transcrição p53
pode ser reativado por meio de tratamentos epigenéticas, no entanto, também sugere que a apoptose é apenas parcialmente induzida através da
p53
via.
NUGC4 e KATOIII as células foram tratadas com o agente de desmetilação, 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC) na presença ou ausência da histona-desacetilase (HDAC), tricostatina a (TSA), e na presença ou ausência de o reagente quimioterapêutico, a CDDP. 1A e 5A, 1 e 5? M de 5-aza-dC; T, TSA. Subsequentemente, as células foram analisadas quanto a: (A) a expressão da proteína p53 por Western Blotting. (B) Um ensaio de repórter duplo para confirmar
actividade de transcrição p53
. A linha a tracejado indica o valor de corte óptima (0,15) para a determinação da actividade de p53. (C) a apoptose celular foi ensaiado utilizando um ensaio nexina. A imagem representativa é mostrado. Os dados são apresentados como a percentagem de células apoptóticas precoces e tardias. * P 0,05, ** 0,001, ***. 0,0001
Além disso, o tratamento epigenética de células do câncer gástrico KATOIII (
p53
nulos), com 1 ? M de 5-aza-2′-desoxicitidina ou 1? M de 5-aza-2′-desoxicitidina mais tricostatina a apoptose induzida robusta na ausência da CDDP, mas o tratamento adicional de CDDP ainda não aumentar significativamente os efeitos apoptóticos (Fig 6c). CDDP em combinação com tratamentos epigenética não aumentou o nível de proteína p53, que se reflectiu pela falta de
p53
actividade de transcrição de um gene repórter da luciferase (Fig 6A e 6B). Estes achados sugerem que
atividade p53
transcrição não é necessária para a apoptose por meio de tratamentos epigenéticas em células KATOIII (
p53
células nulas).
Discussão
Este estudo é o primeiro relatório que SHM de genes supressores de tumor no
p53
caminho são encontradas exclusivamente no estágio patológico II /III câncer gástrico com tipo selvagem
p53
(Fig 3). Foram selecionados pStage II /III pacientes com câncer gástrico com tratamentos padrão para
Análise p53
caminho, porque os tratamentos multidisciplinares em tais pacientes têm o melhor potencial para alcançar melhoria do prognóstico com possibilidade de cura completa [24, 25]. Esta consideração deve ser a primeira prioridade quando se considera a continuação do desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.
metilação quase completa do promotor ilhas DNA CpG é necessário para o silenciamento do gene completo, e até mesmo pequenas proporções de alelos não metilados pode robustamente induzir a expressão do gene [ ,,,0],1-5]. Nos tecidos de tumor primárias, SHM deve representar metilação quase completo em células de cancro, e SHM nos tecidos tumorais primários foi realmente associado com expressão reduzida de proteína de tais genes (Figura 4). Este resultado sugeriu que SHM de genes no
p53
via poderia ser funcionalmente equivalente a
aberração funcional p53
que ocorre como resultado da
p53
mutação, uma vez que estes 3 moléculas função no mesmo
p53
via.
no câncer gástrico, o
p53
grupo aberração foi significativamente associada com fenótipos clínico-patológicas únicas, como histologia intestinal de Lauren, sexo masculino, idade a idade, o crescimento e menos infiltração (Tabela 1). Nossas observações atuais podem estar relacionadas a relatórios anteriores que demonstraram que
p53
mutação está relacionada com estágio inicial de câncer gástrico tipo intestinal, ou com o estágio final de câncer gástrico tipo difuso [26, 27], ou idade avançada [ ,,,0],28], no entanto, nossa análise clínico-patológico incluiu essencialmente câncer gástrico estágio intermediário. Curiosamente, caminho aberração é única e sustentado, mesmo em pacientes recorrentes (Tabela 2).
relevância prognóstico positivo do
p53
mutação no cancro gástrico é controversa com os dois apoiadores [29] e dissidentes [30 ] desta possibilidade. À primeira vista, os nossos dados parecem sustentar o último grupo, no entanto, deve ter-se em conta que os nossos dados de sobrevivência é provável que tenha sido modificado por quimioterapia adjuvante pós-operatório (terapia padrão no Japão). Considerando que, em contraste com o estudo, o tipo difuso de cancro gástrico mostrou prognóstico pior do que o tipo intestinal de cancro gástrico em nossos décadas hospitalares atrás [15, 31], os dados de sobrevivência mais recente de suporte actualizados os resultados opostos (isto é, o intestino tipo de cancro gástrico mostra prognóstico pior do que o tipo difuso de cancro gástrico), a qual é supostamente devido a S-1 efeitos adjuvantes pós-operatório [32]. Pós-operatória adjuvante S-1 a quimioterapia tem sido proposto para ser significativamente mais eficaz para a doença peritoneal do que para a metástase órgão distante [24], e é provável que seja mais eficaz para o cancro gástrico tipo difuso do que para o cancro gástrico tipo intestinal [32] . Por estas razões, a análise mais recente indica que a sobrevivência do prognóstico do tipo difuso do cancro gástrico é melhorada em relação à do tipo intestinal do cancro gástrico.
Não houve diferença estatística na taxa de recorrência ou na única locais de recorrência entre o
grupo p53
aberração e
p53
grupo não-aberração, porém mais recorrências foram encontrados em cada um dos locais de recorrência do
p53
não aberração grupo em comparação com o
p53
grupo aberração. Estes resultados podem sugerir que o
p53
grupo não-aberração tem um fenótipo mais agressivo do que o
p53
grupo aberração como um todo. Em nosso estudo, o tipo difuso de câncer gástrico mostrou significativamente melhor prognóstico do que o tipo intestinal de câncer gástrico no
p53
grupo aberração. Uma vez que esses pacientes tendem a ser distribuído a um estágio mais avançado, esses dados de sobrevivência sugeriu que S1 adjuvante pós-operatório quimioterapia é mais eficaz para o cancro gástrico tipo difuso do que para câncer gástrico tipo intestinal em casos com
p53
via aberração. Estes resultados foram consistentes com relatos anteriores de que mutante
p53
e /ou imunocoloração da proteína p53 pode ser biomarcadores preditivos para efeitos positivos da alta dose de quimioterapia neoadjuvante em câncer gástrico [30].
finalmente avaliou os efeitos do tratamento epigenética em combinação com um agente quimioterapêutico, a fim de comparar a importância de o
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via para a via epigenética em células de cancro gástrico tratados com CDDP. Inesperadamente, verificou-se que o
p53
via era improvável a desempenhar um papel muito importante na indução de apoptose pela CDDP (Figura 6). Recentemente, foi demonstrado que a carcinogênese epigenética é de fato possível. Neste sistema, iPS sistémicas induzidas pela reprogramação de fatores resulta na ocorrência de cancro sistémico com mudanças epigenéticas dinâmicas, enquanto a reversão sistêmica desses fatores de reprogramação reverte células cancerosas em células normais [33]. O câncer gástrico é provável que abrigam poucas mutações de genes de driver [34] do que o cancro colorectal [35], e, da mesma forma, com excepção do
p53
gene são raros no cancro da mama [35], sugerindo que a carcinogênese epigenética mutações é uma possível grande etiologia através de infecção crônica de Helicobacter Pylori [36-38]. Temos recentemente demonstrou a hiper-metilação do
Reprimo
[39], o que novamente é um gene no
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via, mas que não puderam ser incluídos no estudo, e de
HOPX
[16] e
CDO1
[40] que estão ambos envolvidos na apoptose, mas supostamente não através do
p53
via. Com base nas nossas experiências funcionais actuais, o
p53
via contribuição para efeitos de tratamento epigenética é provável que seja muito menor do que a de outras vias (Fig 5). Utilizou-se outras linhas de células (2 linhas celulares de cancro gástrico e uma linha celular de cancro hepatocelular) para determinar com precisão a contribuição de o
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via de apoptose induzida pela CDDP em combinação com tratamentos epigenética. As experiências adicionais realizados são mostrados na figura S3. linhas celulares AZ521 e HepG2 são
p53
tipo selvagem, e a linha de células SH10 é
p53 mutante
.
atividade p53
foi detectado no
p53
células de tipo selvagem, no entanto, a sua actividade era dependente de cada linha celular. Assim,
p53
actividade foi detectada em células NUGC4 com tratamento com CDDP e em células HepG2 e AZ521 sem tratamento com CDDP. apoptose forte como avaliado por um ensaio de apoptose (Caspase 3 ou nexina Assay) não refletem necessariamente o grau de
p53
activação da transcrição. Em
p53 mutante
(SH10) ou
células nulas p53
,
a actividade transcricional de p53
não foi induzida em todos, no entanto apoptose verificou-se ser semelhante à de
p53
células de tipo selvagem.