Abstract
Fundo
O diclofenaco é uma das mais antigas drogas anti-inflamatórias em uso. Em adição à sua inibição de ciclo-oxigenases (COX), diclofenaco inibe potentemente a fosfolipase A
2 (PLA
2), obtendo-se assim um largo efeito anti-inflamatório. Uma vez que a inflamação é um factor importante no desenvolvimento de tumores pancreáticos, exploramos a possibilidade de diclofenac para inibir o crescimento do tumor em ratos inoculados com células PANCO2 ortotopicamente.
Metodologia /principais conclusões
Descobrimos que o diclofenac tratamento (30 mg /kg /de massa corporal por 11 dias) de ratinhos inoculados com células Panc02, reduziu o peso do tumor em 60%, correlacionando-se com o aumento da apoptose de células tumorais. Uma vez que nem este efeito foi observado
in vitro em células
PANCO2 cultivadas, que teorizou que o diclofenaco tratamento benéfico envolver outros mediadores presentes no
vivo
. Com efeito, o diclofenac diminuiu drasticamente vascularização do tumor por regulação negativa de VEGF no tumor e no fluido de cavidade abdominal. Além disso, diclofenac inibiu diretamente vascular brotando
ex vivo
. Surpreendentemente, em contraste com outros inibidores da COX-2, o diclofenac aumentou o teor de arginase actividade /arginase uma proteína em células do estroma tumoral, macrófagos peritoneais e células brancas do sangue de 2,4, 4,8 e 2 vezes, respectivamente. Propomos que a depleção de arginina e posterior diminuição no NO níveis, tanto no soro e cavidade peritoneal, contribui para a inibição do crescimento do tumor por desnutrição e desenvolvimento vasculatura pobres.
Conclusão /Significado
Em conclusão, diclofenac apresenta propriedades anti-tumorais acentuadas no modelo de câncer pancreático que podem contribuir para um maior desenvolvimento do tratamento. A capacidade de diclofenac para induzir a atividade da arginase no estroma tumoral, macrófagos peritoniais e glóbulos brancos fornece uma ferramenta para estudar um assunto controverso de efeitos pró e anti-tumorais de esgotamento de arginina
Citation:. Mayorek N, Naftali-Shani N, Grunewald M (2010) Diclofenac inibe o crescimento tumoral em um modelo murino de cancro do pâncreas por modulação dos níveis de VEGF e Arginase Atividade. PLoS ONE 5 (9): e12715. doi: 10.1371 /journal.pone.0012715
editor: Irene Oi Lin Ng, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 31 de janeiro de 2010; Aceito: 06 de agosto de 2010; Publicação: 15 de setembro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Mayorek et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Hebrew University-Hadassah Medical School (concessão # 0463435). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a inflamação é altamente relacionado com ambos carcinogénese e a progressão do crescimento do tumor [1]. Estudos epidemiológicos mostram que a inflamação crónica predispõe os pacientes com o desenvolvimento do cancro e o uso a longo prazo de drogas anti-inflamatórias não-esteróides (AINEs) reduz o risco de vários cancros [2]
As ciclooxigenases (COX-1 e. – 2) são enzimas limitantes da velocidade na produção de prostaglandinas (PG) a partir de ácido araquidónico.
COX-1 é geralmente expressão constitutiva, enquanto que a COX-2 é induzida por estímulos normalmente envolvidas em respostas inflamatórias. A prostaglandina E2 (PGE2), um metabolito principal de COX-2, tem sido mostrado para promover a sobrevivência celular, a proliferação, e a angiogénese e inibir a apoptose e resposta imunitária anti-tumoral, todos os processos que promovem o desenvolvimento do cancro [3].
pâncreas câncer é uma doença letal com muito poucas opções para o tratamento. pancreatite crónica predispõe indivíduos para desenvolver o adenocarcinoma ductal pancreático [4] e estroma tumoral pancreática é caracterizada pela variedade de células inflamatórias [5], sugerindo o envolvimento de processos inflamatórios no presente cancro. A COX-2 é sobre-expresso em cerca de 75% dos carcinomas humanos, incluindo os do pâncreas. Estudos recentes em ratos transgénicos [6], [7], [8] têm mostrado que a COX-2 superexpressão no pâncreas exócrinas induzida pancreatite-like-estado. O início do câncer nesses camundongos foi evitada através da manutenção ratos em inibidores selectivos da COX-2, demonstrando ainda a importância do papel da inflamação no desenvolvimento de câncer de pâncreas.
Testes em humanos para prevenir o câncer de cólon foram recentemente realizados utilizando COX 2 inibidores. Apesar resultados encorajadores na prevenção e redução de câncer de cólon na incidência de adenomas do cólon, NSAIDs e de inibidores selectivos da COX-2 pode causar sérios efeitos colaterais cardiovasculares e gastrointestinais e, portanto, não são recomendados rotineiramente para estas doenças [9], [10].
Diclofenac, um dos NSAIDs mais antigos tem sido usado desde 1976. o diclofenaco inibe ciclooxigenases não-seletiva. Estudos em seres humanos demonstraram que reduz 94% de COX-2 e 49% da actividade de COX-1 [11]. In vitro, inibe potentemente a fosfolipase A2 (PLA2) [12], a enzima que liberta ácido araquidónico e lisofosfolípido para gerar uma família de eicosanóides pró-inflamatórias (incluindo PGE2) e factor de activação de plaquetas. Evidência adicional sugere que o diclofenaco também inibe a PLA2
vivo. PLA2 Acredita-se que desempenham um papel fundamental nos primeiros passos da cascata inflamatória conduzindo a pancreatite aguda [12]. O estudo inicial [13], seguido por vários outros grupos, mostraram que o diclofenac pode diminuir significativamente a taxa de pancreatite aguda causada por colangiopancreatografia endoscópica.
À luz da capacidade de diclofenac para inibir potentemente tanto a COX-2 e de PLA2 temos explorado o seu potencial anticancerígeno em um modelo de rato com câncer de pâncreas. Aqui mostramos que o tratamento diclofenaco provoca uma diminuição de 60% no tamanho do tumor. Isto é devido ao aumento da apoptose de células tumorais. Nós fornecemos evidências de que este efeito é indireto e opera através de, pelo menos, dois mecanismos. Em primeiro lugar, o diclofenac produz um efeito antiangiogénico significativa, como demonstrado por uma forte redução do teor de tumor vascular factor de crescimento endotelial (VEGF), diminuição da densidade microvascular e as alterações morfológicas nos vasos sanguíneos do tumor. Em segundo lugar, o tratamento com diclofenac notavelmente aumenta a actividade da arginase em células do estroma tumoral, macrófagos peritoneais e células brancas do sangue. Esta é uma descoberta inesperada uma vez que os inibidores da COX-2 foram mostrados para reduzir o crescimento do tumor através da inibição da arginase [14], [15] Nossos resultados estão de acordo com estudos anteriores, que apontam para antitumoral [16] e efeito antiangiogênico [17] de arginina exaustão e apoiar a abordagem bastante controversa de tratamento antineoplásico, aumentando a atividade da arginase [18], [19].
Métodos
declaração Ética
procedimentos com animais experimentais foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade hebraica, que atua sob a vigilância da AAALAC International.
Animais e PANCO2 linha de células
camundongos fêmeas CB6F1 (9-10 semanas de idade) e ratos Sprague-Dawley (200 g) foram de Harlan, Israel. Feminino CX3CR1
GFP /+ ratos [20] foram generosamente fornecidos por S. Jung (Rehovot, Israel). Nestes ratinhos um repórter GFP é dirigido pelo promotor de CX3CR1. Actividade deste promotor do receptor de quimiocina é restrita a células mononucleares mielóides, incluindo todos CD116 circulante
+ monócitos, e está essencialmente ausente das células da linhagem linfóide. Todos os experimentos, exceto o experimento apresentado na Figura S3 foram realizados utilizando camundongos CB6F1.
Panc02 células foram uma generosa doação de M Dauer (Munique, Alemanha). As células foram mantidas em RPMI com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina.
modelo ortotópico-singeneicos de cancro pancreático
Os ratinhos foram anestesiados com uma mistura de cetamina-xilazina. O pâncreas foi injectado com 4 × 10
5 (ratos CB6F1) ou 6 × 10
5 (CX3CR1
GFP /+ ratinhos) Panc02 células em 30 ul de solução salina tamponada de fosfato (PBS). Os ratinhos foram removidos a partir de uma experiência, se um vazamento peritoneal foi suspeitado. ratos Sham operados foram submetidos ao mesmo procedimento e foram injectados com 30 ul de PBS. Os ratinhos foram divididos em grupos de 6 a 8 animais por grupo. O grupo tratado recebeu 30 mg /kg p.c. diclofenac na água potável a partir de dia 3 após a inoculação. A dose foi calculada com base na estimativa de que um rato bebidas cerca de 3 ml de água por dia. Os ratos foram mortos 14 dias após a inoculação, a menos que especificado de outra forma.
O sangue para as células brancas do sangue (WBC) preparação, óxido de VEGF e de azoto (NO) a concentração foi feita a partir do coração. cavidade peritoneal foi lavada com 2 ml de PBS com albumina de soro bovino a 0,1% (BSA) para a preparação macrófagos, para a medição de VEGF e para nenhum concentrações.
células peritoniais e macrófagos peritoniais isolamento
Peritoneal as células foram obtidas por centrifugação de descarga cavidade peritoneal. macrófagos peritoneais foram isolados a partir de células peritoneais por adesão diferencial ao plástico. Os macrófagos foram cultivadas em RPMI com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, durante 20 horas. Para medir a actividade da arginase, as células foram lavadas com PBS e dissolvidas em 0,1% de TritonX100 em água durante 30 min à temperatura ambiente.
tumorais homogeneizados de
homogenatos tumorais foram preparadas a partir de amostras de tumores que foram armazenadas a -80 ° C, em água contendo 0,1% de Triton X 100 e cocktail de inibidor de protease (Sigma P8340). Os homogenatos foram centrifugados durante 30 min a 13.400 g e os sobrenadantes foram usados para medir a actividade da arginase, arginase 1, actina de músculo liso e conteúdo de VEGF e a activação de caspase-3.
células de medula óssea isolamento
tíbias e fémures de murganhos portadores de tumores foram retirados e lavados com PBS. Após a centrifugação das células colhidas num gradiente de Ficoll a 4000 g durante 20 min à temperatura ambiente as células mononucleares foram isoladas com PE conjugado com o anticorpo primário anti-CD 115 e microesferas anti-PE (Biolegends). células positivas e negativas CD-115 foram analisadas para a atividade da arginase.
isolamento de células brancas do sangue (WBC)
WBC foram isolados usando gradiente de densidade Ficoll (Amersham). fração WBC foi lavado, as células foram contadas, lisadas em água contendo 0,1% de Triton X 100 e analisadas quanto ao teor arginase 1 proteína.
anel aórtico ensaio brotando
anéis de aorta foram preparados a partir aortas torácicas de ratos Sprague-Dawley, como descrito [21]. Anéis foram embebidos em gel de colagénio e mantidas em meio de Bio MPM (Biological Industries, Israel). O tratamento com diclofenac de 10 uM começou um dia após a sementeira e durou durante 5 dias. Anéis foram então fixadas em formalina a 4% tamponada, coradas com violeta de cristal a 0,02% em etanol absoluto. área Sprouting foi avaliada utilizando-se o programa Image Pro.
A caspase-3 de activação
activação de caspase-3 foi medida em homogeneizados de tumor através da separação da não-clivado e clivada da caspase-3 em um 20% acrilamida SDS-PAGE em gel de eletroforese e borrando com monoclonal anti-caspase-3 (Cell Signaling).
VEGF e nO conteúdo
conteúdo VEGF foi medida no soro, no sobrenadante de descarga cavidade peritoneal, em homogeneizados tumorais, Panc02 e macrófagos cultivados usando o mouse kit VEGF Quantikine imunoensaio (R D systems).
nO conteúdo foi medido no soro e no sobrenadante de descarga cavidade peritoneal usando um nitrato /nitrito colorimétrico kit de ensaio (Cayman Chemical Company).
atividade Arginase
atividade Arginase foi medida como descrito [22]. 100 ug de proteína foi testada durante 10 min a 37 ° C para as células e macrófagos peritoneais, 30 min para homogenatos tumorais e 2 horas para as células da medula óssea. O teor de proteína foi medida em cada amostra utilizando o kit de ensaio de proteína BCA micro (Thermo Scientific).
arginase 1 e actina de músculo liso teor de proteína
As proteínas de homogenados tumorais, lisados WBC e células positivas para GFP isolado a partir de tumores foram separados em gel de electroforese em acrilamida SDS-PAGE a 10% e colocados a hibridar com anticorpo monoclonal quer arginase-1 (BD Transduction Laboratories) ou monoclonal actina do músculo liso (Sigma).
Isolamento das células mononucleares a partir de tumores mielóides
Os tumores foram extraídos a partir de CX3CR1
ratinhos GFP /+ e digerido com colagenase (400 unidades /ml; Sigma e Dnase 0,33 mg /ml; Sigma) durante 45 min a 37 ° C. população positiva GFP foi purificado por separação de células de alta velocidade usando FACS Aria (Becton, Dickinson). As células foram contadas e lisaram-se em água contendo 0,1% de Triton X 100 e analisadas quanto ao teor de proteína da arginase 1.
células PANCO2 taxa de crescimento de células
Panc02 foram semeadas em meio RPMI suplementado com FBS a 10%, 2 mM de L-glutamina, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. Diclofenac (10 ou 50 fiM) foram adicionados no dia seguinte e depois de 4 dias de tratamento, as células de conteúdo foi medida utilizando um kit de proliferação de células (Biological Industries, Israel).
A imuno-histoquímica, coloração TUNEL e morfometria
as secções de parafina de tumores foram coradas utilizando os seguintes anticorpos primários: rato anti-F4 /80 (Serotec), anticorpo monoclonal anti-arginase-1 (BD Transduction Laboratories), anticorpo monoclonal anti-α-actina de músculo liso (Sigma), monoclonal anti-Ki 67 (Neomarkers), coelho anti-H3 fósforo-histona (Cell Signaling), de coelho anti-VEGF (Calbiochem) e monoclonal anti-fator de von Willebrandt (DACO). A peroxidase de rábano (HRP) anticorpos secundários conjugados foram usados para a detecção cromogénica.
coloração TUNEL [23] foi realizada usando no kit de detecção da morte celular in situ (Roche).
quantificação dos dados imunomarcação foi realizada quer por alto campo de energia contagem análise de pelo menos 10 áreas /lâmina de 4 tumores diferentes em cada grupo ou com a ajuda de sistema de análise de imagem (Ariol SL-50).
a análise estatística
Todos os dados foram analisados com o software SigmaStat (software Aspire internacional). Um teste de Mann-Whitney foi utilizado para calcular as diferenças significativas entre as amostras tratadas e não tratadas diclofenac. Um valor de p ≤ 0,05 foi aceito como significativo.
O tamanho da amostra e número de repetições são indicadas em lendas.
Resultados
O diclofenaco inibe o crescimento do tumor em um modelo ortotópico de câncer de pâncreas em ratos
células Panc02 foram injectadas na cauda do pâncreas. Após 4 dias as células cancerosas formadas pequenas tumores de comprimento de aproximadamente 4 mm. Tumores desenvolveu-se rapidamente; no dia 8 que dobrou em tamanho e forma consistente metástase para a área peritoneal da incisão abdominal executado por inoculação do tumor. No dia 14, os tumores que cresceram no local da inoculação (tumores primários), pesavam 300-500 mg e eram altamente vascularizado. Os tumores metastáticos no corte abdominal e no baço também eram proeminentes (Fig 1A).
Os ratos foram inoculados com 4 × 10
5 Panc02 células para a parte da cauda do pâncreas. No dia 3 após a inoculação (dia da inoculação foi designado como dia 1) os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente em grupos não tratados e tratados diclofenac (7-8 ratos em cada grupo) e o diclofenac de 30 mg /kg b.w o tratamento foi iniciado. No dia 14 após a inoculação ratinhos foram mortos e os tumores primários e metastáticos foram removidos e pesados. A, um fotografias representativas de
In Situ
primárias (
círculos
) e tumores metastáticos (
setas
). Inserções mostram tumores primários isolados. B, média ± SE de pesos tumorais de 8 não tratados e 7 ratinhos tratados diclofenaco * p≤0.01. A experiência representativa em cada quatro é mostrada.
Três a quatro semanas após a inoculação, a cavidade peritoneal foi cheio de ascite sangrentas. Numerosos tumores metastáticos foram encontradas na cavidade peritoneal, incluindo nódulos linfáticos da pista alimentar, e murganhos começaram a morrer. Os tumores metastáticos no fígado ou os pulmões não foram detectadas.
experimentos subsequentes foram, portanto, encerrado no dia 14 após a inoculação. Os ratos pareceram normais nesta fase e não houve perda de peso corporal.
O diclofenac (30 mg /kg de peso corporal) foi administrado diariamente na água potável a partir de 3 dias após a inoculação. Os seus efeitos foram examinados após 11 dias de tratamento. Como mostrado na Fig 1B, o peso do tumor primário (crescente no pâncreas) era significativamente menor (60%) em ratinhos tratados diclofenac, em comparação com animais não tratados. Os tumores metastáticos que cresceram no corte abdominal também pesou menos em camundongos diclofenaco tratados, em todos os experimentos, mas este efeito não atingiu significância estatística.
O diclofenaco aumenta a apoptose de células tumorais
in vivo
, mas não
in vitro
a diminuição do peso do tumor observado em camundongos tratados diclofenaco levou-nos a examinar a proliferação e apoptose das células tumorais.
Os tumores coradas para Ki 67 (presente durante todas as fases activas do ciclo celular G1, S, G2, e mitose) e H3 de fosfo-histona (o marcador específico das células mitóticas) não mostrou qualquer diferença entre os ratos não tratados e tratados diclofenac, Fig S1
. no entanto, como mostrado na figura 2, o tratamento com diclofenac aumento da apoptose por seis vezes, tal como indicado por coloração TUNEL de tumores e quantificação (Fig 2A). Este achado foi ainda apoiada por um aumento crescente da presença de caspase 3 clivada em homogenatos de tumores excisados de ratinhos tratados com diclofenac (Fig 2B).
A e B, os ratinhos foram inoculados com células Panc02 e tratada com diclofenac como descrito em Figura 1. A,
lef
t, TUNEL coloração superpositioned sobre coloração DAPI de tumores fixos,
direito
, média ± SE% de núcleos TUNEL positivos fora de núcleos DAPI manchadas. Cerca de 9.000 núcleos de tumores não tratados e de 4 4 ratinhos tratados foram contados diclofenac * p≤0.001. B, a activação de caspase-3 em homogenatos de tumores de ratos tratados e não tratadas 4 3 diclofenac foi medida como descrito em Materiais e Métodos, uma de duas experiências. C, Panc02 (3000 células /poço) foram semeadas em placas de 96-poços NUNC. No dia após a sementeira de 10 ou 50 uM de diclofenac foi adicionado e as células foram incubadas por mais 4 dias. O número de células foi medido utilizando um kit de proliferação de células. Média ± SE de OD de 6 poços em cada grupo. Um representante experimento de 3.
A apoptose aumentada causada por diclofenac
in vivo
não poderia ser recapitulada
in vitro
. Panc02 células cultivadas durante 4 dias na presença de 10 e 50 uM de diclofenac cresceram à mesma taxa que as células não tratadas (Figura 2C), indicando que o
In vivo
efeitos de diclofenaco exigir alguns mediadores que estão ausentes no
in vitro
sistema.
efeito antiangiogênico de diclofenac
in vivo
e
ex vivo
Os tumores de diclofenaco animais tratados eram muito pálido (Figura 1A), sugerindo que o tratamento causou um efeito anti-angiogénico. Com efeito, como mostrado na Fig 3A e B, coloração para vascular marcador endotelial factor de von Willebrand e contagem dos vasos sanguíneos revelaram uma gota quatro vezes no número de grandes vasos periféricos e uma redução de 2 vezes na densidade capilar em tumores de ratinhos diclofenac tratada. Além disso, a coloração suave actina de músculo (Fig 3C), revelaram vasos direitas finas em tumores tratados quando comparados a numerosas, vasos sanguíneos tortuosos largura de tumores de murganhos não tratados. Análise da expressão de actina do músculo liso em homogenatos tumorais por Western blot mostrou uma diminuição significativa (2,5 vezes) em murganhos tratados diclofenac (Fig 3D e E).
A-F, os ratinhos foram inoculados com células e tratada com Panc02 diclofenac, como descrito na Figura 1. a-D, o tratamento diclofenaco provoca alterações morfológicas nos vasos sanguíneos do tumor. A, Von Willebrand coloração de grandes vasos periféricos (
top) Comprar e capilares (
inferior). B, média ± SE dos grandes vasos /slides periférica. contadas em torno da periferia de cada slide (
topo
) e média ± SE de capilares /área contados em 10 diferentes áreas centrais de tumores menores de aumento de 40X (
parte inferior
). Quantidade de vasos foi avaliada em tumores de quatro não tratada e 4 ratinhos tratados diclofenac, * p≤0.01. C, suave coloração actina de músculo revelou muito finas paredes de vasos sanguíneos em ratos tratados diclofenac. D e E, teor de proteína actina de músculo liso em homogenatos tumorais (50 ug de proteína carregada por pista) de 4 não tratado e 3 ratos tratados diclofenac medida como descrito em Materiais e Métodos, média ± SE de unidades arbitrária /pista, * p≤0.01. F, diclofenac reduz o teor de VEGF do tumor e a cavidade peritoneal, mas não no soro. os níveis de VEGF foram medidos como descrito em Materiais e Métodos na proteína tumorais homogeneizados-pg /mg (
superior), na cavidade peritoneal-pg /rato (
centro
) e no soro -PG /ml (
parte inferior
). Os resultados são a média ± SE de 4 a 6 ratos por grupo. *, ** E # significativamente diferente de não tratado, apresentando tumores ratinhos P≤0.02. Foram obtidos resultados semelhantes em duas experiências independentes. L, diclofenac inibe germinação vascular. O
ex vivo
efeito inibidor de diclofenac na germinação foi medida em anéis de aorta de rato cultivadas na ausência ou na presença de 10 uM de diclofenac durante 5 dias, como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados são a média ± SE de área do broto de 5 anéis em cada grupo medidos utilizando o programa de imagem Pro. * Significativamente diferente do grupo não tratado p≤0.01 As fotografias de anéis representativos de não tratada (
esquerdo) e diclofenac (
direito
) grupos tratados estão incluídos. Resultados semelhantes foram obtidos em 4 experiências independentes.
O VEGF tem sido mostrado para ser o principal factor pró-angiogénico em tumores [24]. Portanto, medimos os níveis de VEGF tumor de diclofenaco tratada e ratos não tratados (Fig 3F). tumores ratinhos tratados continha 3 vezes menos de VEGF quando comparados com os tumores de murganhos não tratados, o que sugere que a diminuição no resultado de a vasculatura do tumor a partir de uma regulação para baixo de VEGF (Fig 3F,
topo
). Como as células tumorais rapidamente se espalhou através da cavidade abdominal, nós próxima medida conteúdo VEGF no fluido peritoneal. A quantidade lavável de VEGF a partir da cavidade peritoneal de ratinhos portadores de tumor-era 13 vezes maior do que os ratos saudáveis operados por simulação. Este valor diminuiu 2,8 vezes após o tratamento diclofenac (Fig 3F,
centro
).
Estes efeitos pronunciados sobre o conteúdo VEGF, tanto na cavidade peritoneal e no tecido tumoral, não foram refletidas em quaisquer alterações na concentração sérica de VEGF (Fig 3F,
parte inferior
). Assim, as concentrações de VEGF no soro foram similares em soro de ratos operados de forma simulada saudável, em ratinhos portadores de tumor-e em ratinhos portadores de tumor tratados com o diclofenac.
Para determinar se o diclofenac pode inibir a angiogénese directamente, medimos sprouting angiogénese de anéis de aorta de ratos
ex vivo
em resposta ao tratamento medicamentoso. Como mostrado na Fig 3G, a área de germinação foi inibida por 2,5 vezes, quando os anéis de aorta foram incubados com 10 uM de diclofenac (C max de pacientes tratados com diclofenac), mostrando assim que o diclofenac pode inibir directamente o desenvolvimento de vasos sanguíneos.
Diclofenac aumenta a actividade de arginase no tumores pancreáticos e em macrófagos peritoneais, mas não na medula óssea de CD 115-células positivas e negativas de CD 115
um dos resultados de COX-2 sobre-expressão por células tumorais é uma grande produção de a PGE2, que leva a uma resposta inadequada das células T [14] [25]. PGE2 induz arginase 1 actividade e absorção de arginina em células supressoras mielóides derivadas (MDSCs), causando depleção de arginina no tumor circundante. A relativa falta de arginina provoca um defeito na expressão CD3ζ das células T que se infiltram no tumor. Dado que os inibidores de COX-2 foram mostrados para parar parcialmente o crescimento de tumores através da inibição da arginase no MDSC [14], [25], medimos a actividade de arginase no homogenatos tumorais pancreáticas de não-tratados e ratinhos diclofenac tratados (Fig 4A,
topo
).
a-C, todos os ratos, exceto os indicados foram inoculados com tumores no dia 1 e mortos no dia 14. a, a atividade da arginase foi medida como descrito em Materiais e Métodos em homogeneizado de tumor
( top)
, em macrófagos isolados por cavidade peritoneal flush e cultivadas por 20 horas (
centro)
, e em células peritoneais isolados de fresco (
fundo)
. Os ratinhos foram tratados com diclofenac de 30 mg /kg durante 11 dias (
parte superior e central
) ou durante 2 dias antes do fim da experiência (
inferior). Os resultados são a média ± SE da atividade da arginase em homogeneizados de tumor de 6-7 ratos em cada grupo (
topo
) ou em Triton X-100 células dissolvidos obtido a partir de 3-7 ratos por meio de descarga peritoneal e medidos em quadruplicado (
centro e na parte inferior
). Cada experiência foi repetida pelo menos 3 vezes e os resultados da experiência representativa são mostrados. * Significativamente diferente do grupo não tratado p≤0.01. # Significativamente diferente de grupo não tratado de ratinhos tumor-Free-. B, coloração arginase-1 de tumores. tumores fixados foram coradas para arginase 1 como descrito em Materiais e Métodos. Fotografias de secções foram tomadas sob X 10
(top)
ou X 40 (
parte inferior
) ampliação. C, a identificação de duas populações distintas de células no tumor (tratado com diclofenaco) estroma: F4-80 células positivas positivos e arginase. Os cortes seriados foram coradas para F4 /80
(
esquerda) e para arginase 1,
(direita)
. Foram identificadas as mesmas áreas e comparados quanto à presença de ambos os marcadores. Fotografias de secções foram tomadas sob X 20 ampliação. Um experimento representativo de 2. D, diclofenac não induz a actividade da arginase quando incubado com macrófagos em cultura de células. Macrófagos peritoneais foram isolados a partir de ratinhos livres de tumor, tal como descrito em Materiais e Métodos e foram incubadas durante 48 horas com 10 ou 30? M de diclofenac seguido por medição da arginase. Média ± SE da actividade da arginase de 3 poços em cada grupo. Um experimento, representante 3.
Para nossa atividade surpresa arginase não foi inibida por tratamento diclofenac, mas foi significativamente ativado por 2,4 vezes.
coloração imuno-histológica mostrou arginase 1 células positivas na periferia dos tumores em ambos os ratinhos não tratados e tratados com diclofenac (Fig 4B). O número de células que expressam um arginase e a sua intensidade de coloração pareceu aumentar sob tratamento diclofenaco. Um, 1,8 vezes de aumento significativo no teor de proteínas da arginase 1 em tumores de ratos tratados diclofenaco também foi medido por análise de transferência de Western de homogenatos de tumores (Fig S2). Usando um anticorpo contra o marcador de macrófagos F4 /80 (Fig 4C) que não poderia detectar qualquer sobreposição com a arginase 1 coloração.
Para caracterizar ainda mais os arginase 1 células que expressam em tumores Panc02, nós inoculados Panc02 células em ratinhos transgénicos em que um repórter GFP é dirigido pelo promotor de CX3CR1. Actividade deste promotor do receptor de quimiocina é restrita a células mononucleares mielóides, incluindo todos CD116 circulante
+ monócitos, e está essencialmente ausente das células da linhagem linfóide. Isolamos células positivas para GFP a partir de tumores e verificou que estas células expressam níveis elevados de arginase 1 (Fig S3).
Assim, o aumento da actividade da arginase encontrados nos tumores dos ratinhos tratados diclofenac é devido, pelo menos em parte, a a activação da arginase 1 em monócitos derivado CX3CR1
+ células. atividade da arginase estava ausente em Panc02 cultivadas (resultados não apresentados) e arginase 1 proteína não foi detectada em células tumorais
in vivo
por imunocoloração.
O efeito marcante do tratamento diclofenaco sobre a atividade da arginase no pâncreas tumores nos levou a examinar a atividade da arginase em macrófagos peritoneais. Macrófagos peritoneais podem estar envolvidos na vigilância de tumores [26] e mostram uma expressão reforçada de arginase em ratinhos portadores de tumores [27]. Macrófagos de lavagem peritoneal foram isolados por ligação preferencial aos pratos de cultura e cultivadas durante a noite. A imunocoloração demonstrou que eles eram ambos F4 /80 positivos e arginase 1 positivos (resultados não mostrados). actividade de arginase foi regulada positivamente (4,8 vezes) em macrófagos derivados de ratinhos portadores de tumor-tratados com diclofenac durante 11 dias, quando comparado com os ratinhos não tratados (Fig 4A
centro).
Desde arginase macrófagos expressão pode mudar em resposta a adesão prato de cultura [28] nós também mediram a atividade da arginase no não-cultivadas células recentemente isoladas da cavidade peritoneal do rato, comprometendo, assim, nos macrófagos pureza, (Fig 4A
fundo)
.
diclofenac eficazmente estimulou a actividade da arginase em células não cultivadas derivadas de ambas, e ratos tratados com o diclofenac para 2 dias apenas por 7 e 3 vezes, respectivamente, portador de tumor livre de tumor. presença de tumor melhorada actividade da arginase por 4 vezes o aumento da actividade de 0,03 (células de ratinhos portadores não-tumorais) a 0,12 mg de ureia /min /mg de proteína (células de tumor de ratinhos -bearing) que está em linha com os resultados reportados anterior [27] .
também contado o número de células peritoneais extraídos a partir de cada rato e descobriu que um tratamento de dois dias de diclofenac produziu um aumento de 3 vezes em células de ratinhos livres de tumor. O número médio de células ± SE foi de 0,6 × 10
6 ± 0,06 x 10
6 extraídas de ratos não tratados e 1,5 × 10
6 ± 0,4 × 10
6 de camundongos tratados diclofenaco (p≤ 0,02, 7 ratinhos em cada grupo).
Esta observação mostra que depois de um tratamento de curta diclofenac, a actividade total da arginase em células peritoneais (principalmente macrófagos) é extremamente elevada, tanto devido ao grande aumento na actividade específica desta enzima e por causa do aumento do número de células activadas
.
a activação da actividade da arginase por diclofenac não podia ser demonstrada
in vitro
. A incubação de macrófagos peritoneais de 48 horas (Fig 4D) não aumentou a actividade da arginase, mas produziu uma certa diminuição na actividade especifica dessa enzima. Os mesmos resultados foram obtidos quando os macrófagos foram incubadas durante 96 horas com diclofenaco (resultados não mostrados). Assim, de forma semelhante ao efeito do diclofenac sobre a apoptose de células tumorais, mediadores presentes
In vivo
e ausente em macrófagos cultivados foram necessárias para atingir a indução da actividade da arginase por esta droga.
investigou-se também se a activação da arginase por diclofenac pode ser detectada em precursores de macrófagos da medula óssea. Nós isolado a partir de células mononucleares de tíbias e fémures de murganhos portadores de tumores não tratados e tratados durante 11 dias com o diclofenac. Encontramos muito baixa atividade da arginase em ambos os CD 115
+ e CD 115
– células. Assim, a activação da arginase por diclofenac ocorre tanto em macrófagos diferenciados ou os mediadores necessários para promover diclofenac- activação da arginase induced- não atingir o compartimento da medula óssea.
Diclofenac diminui NÃO nível na cavidade peritoneal e no soro
a seguir, investigou se a activação pronunciada da arginase tanto em tecido tumoral e em macrófagos peritoniais influenciado produção de nO.