Abstract

Fundo

Nós anteriormente demonstrado que o acúmulo nuclear e citoplasmática do domínio intracelular (EP- CID) da molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM), acompanhada por uma redução recíproca do seu domínio extracelular (EPEX), ocorre em cancros da tiróide agressivos. Este estudo foi desenhado para determinar se a acumulação semelhante de Ep-ICD é um evento comum em outros cancros epiteliais.

Metodologia e Resultados

Dez cancros epiteliais foram analisados ​​utilizando imunohistoquímica Ep-ICD e domínio EPEX anticorpos espec�icos. A localização subcelular de EPEX e EP-CDI na linha celular de adenocarcinoma do cólon humano CX-1 foi observada através de imunofluorescência. expressão Ep-ICD nuclear e citoplasmática foi aumentada em cancros da mama (31 de 38 tecidos, 82%), próstata (40 de 49 tecidos, 82%), cabeça e pescoço (37 de 57 tecidos, 65%) e esôfago ( 17 de 46 tecidos, 37%) em comparação com os tecidos normais correspondentes que mostram a localização da membrana da proteína. Importante, Ep-CID não foi detectado nos núcleos de células epiteliais na maioria dos tecidos normais. Alta nuclear e acumulação Ep-ICD citoplasmática também ocorreu em outros seis tipos de câncer epitelial analisados ​​- pulmão, cólon, fígado, vesícula, pâncreas e ovário. Uma redução concomitante na membrana EPEX expressão foi observada em um subconjunto de todos os tipos de cancro. A análise da curva característica revelou nucleares Ep-ICD cancros da mama distinguido com sensibilidade de 82% e 100% de especificidade e próstata com sensibilidade de 82% e 78% de especificidade. Foram observados resultados semelhantes para a acumulação citoplasmática da EP-ICD nestes cancros. Nós fornecemos evidências clínicas de aumento nuclear e acumulação Ep-ICD citoplasmática e uma redução na EPEX membranoso nestes cancros.

Conclusões

O aumento nuclear e citoplasmática Ep-ICD foi observada em todos os cancros epiteliais analisados e distingue-os de tecidos normais com alta sensibilidade, especificidade, e a AUC. Desenvolvimento de um ensaio de alto rendimento robusto para Ep-ICD irá facilitar a determinação da sua relevância diagnóstico, prognóstico e terapêutica em cancros epiteliais

Citation:. Ralhan R, Ele HC-H, Então AK-C, Tripathi SC , Kumar M, Hasan MR, et al. (2010) citoplasmática Acumulação de Ep-ICD Nuclear e é detectada frequentes em cancros epiteliais humanas. PLoS ONE 5 (11): e14130. doi: 10.1371 /journal.pone.0014130

editor: Marc Vooijs, Centro Médico da Universidade de Maastricht, Holanda

Recebido: 20 de junho de 2010; Aceito: 24 de outubro de 2010; Publicação: 30 de novembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Ralhan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Sinai Fundação Monte de Toronto, da Vinci Gala Fundraiser, Alex e Simona Shnaider Cadeira no cancro de tiróide, Mount Sinai Departamento de Fundo de Pesquisa de Medicina, Alex e Simona Shnaider Laboratory em Oncologia Molecular Hospital, e Temmy Latner Fundação Dynacare família. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM) é uma glicoproteína de 40 kDa transmembranar que serve um papel importante na adesão celular, proliferação celular, diferenciação, migração, a regulação do ciclo celular e está implicado no cancro e células estaminais de sinalização [1]. EpCAM é uma das proteínas mais amplamente investigados em cancros humanos, frequentemente sobre-expressa em tumores malignos humanos, localizada na membrana plasmática das células tumorais e embora em níveis mais baixos no epitélio normal, [2], [3], [4], [5 ], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Todos estes estudos anticorpos dirigidos contra o domínio extracelular de EpCAM (EPEX) utilizados [13]. Estes numerosos relatórios sobre a expressão da superfície celular de EpCAM em cancros humanos sugeriram que poderia ser um candidato ideal para a aplicação como um marcador de cancro epitelial e um alvo terapêutico [18], [19], [20], [21]. eficácia Paradoxalmente, a maioria dos estudos clínicos com anticorpos monoclonais de murino ou seja, edrecolomab no cancro colorectal, ou o anticorpo humanizado, adecatumumab, no cancro da mama têm mostrado limitada [14], [22]. A compreensão dessas limitações representa um desafio para os oncologistas e é de grande importância para o futuro desenvolvimento de estratégias mais eficazes anti-EpCAM. Neste contexto, Gires e Baeuerle [23] discutiu a necessidade de medir os níveis de expressão EpCAM em células tumorais e seu impacto sobre os resultados de um ensaio clínico. No entanto, nenhum dos estudos anteriores analisaram expressão EpCAM em tecidos tumorais, prospectivamente ou retroativamente. Se a proteólise recentemente relatado regulada intramembranar (PIR) perda de EpCAM a partir da superfície da célula do tumor mediada pode ser uma das razões para a eficácia limitada das terapias de cancro à base de EpCAM continua a ser estabelecida [24]. A clivagem do ectodomínio de EpCAM, EPEX, pelo factor de necrose tumoral protease α enzima de conversão (TACE) e a sua clivagem foi mostrado para libertar o seu domínio intracelular (EP-CID), que, em seguida, transloca-se para o núcleo, resultando na activação de sinalização oncogénica [ ,,,0],24]. A associação da EP-CID com FHL2 e componentes da via Wnt p-catenina e Lef-1 forma um complexo nuclear que se liga ao ADN em Lef 1-locais de consenso e induz a transcrição de genes, que conduz à proliferação celular aumentada [24]. O significado clínico da EP-CDI em cancros humanos tem de ser determinado, tendo em conta as múltiplas funções de EpCAM como um transdutor de sinal oncogénico, molécula de adesão celular e marcador de células estaminais do cancro [24], [25], [26], [27 ].

a localização nuclear da EP-ICD foi relatada pela primeira vez em um estudo de 26 casos de câncer de cólon humano, mas não em epitélios de cólon normal [24]. Posteriormente, relatou acumulação nuclear e citoplasmática da EP-ICD em diferentes subtipos de cancros da tiróide, que foi associado com uma redução recíproca em EPEX membranoso, e também observaram uma correlação de acumulação Ep-ICD nuclear com a agressividade do tumor e mau prognóstico da doença [28] . A ampla heterogeneidade de tumores sólidos investigação mandados para determinar se a expressão Ep-CID nuclear e citoplasmática também pode ocorrer em outros cancros humanos. No presente estudo, a acumulação compartimental subcelular da EP-CID foi abordada de uma grande variedade de cancros epiteliais, ou seja, da mama, da próstata, cabeça e pescoço, esôfago, ovário, pâncreas, cólon e do recto, do pulmão, da bexiga urinária, fígado carcinomas por imuno-histoquimica (IHC) (usando um anticorpo específico dirigido contra o domínio Ep-CID de EpCAM). Nuclear e citoplasmática Ep-ICD também foi quantitativamente detectado em CX-1 células cancerígenas do cólon usando imunofluorescência. Com a exceção de um relatório anterior no câncer de cólon e nosso estudo no cancro da tiróide [24], [28], a novidade deste relatório é a demonstração da ocorrência generalizada de acumulação nuclear e citoplasmática aumento da EP-ICD em associação com a variável expressão membrana EPEX em um amplo espectro de cancros epiteliais.

Métodos

Declaração de Ética

Este estudo foi realizado de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. O estudo foi aprovado pelo Conselho de Mount Sinai Hospital de Ética em Pesquisa, Toronto, Canadá. Os blocos de tecido parafina arquivados de um estudo de cabeça e pescoço câncer aprovado pelo Comitê de Ética em humanos de todas as Instituto de Ciências Médicas da Índia, Nova Deli, na Índia, com o consentimento prévio dos pacientes, foram utilizados neste estudo.

pacientes e amostras de tecido

Para a análise IHC, arquivados blocos de tecido de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCCs) e tecidos normais, bem como carcinomas de células escamosas do esôfago (ESCCs) foram obtidos a partir do banco de tumores, revisto pelo patologista e utilizada para o corte de secções de tecido para a imunocoloração com anticorpos Ep-ICD e EPEX como descrito abaixo. Os dados clínicos e patológicos gravados incluídos estágio clínico do tumor, local das lesões, diferenciação histopatológica, idade e sexo em uma pré-concebidas performa como descrito por nós anteriormente [29]. Tissue-microarrays (TMA) de câncer de mama e tecido mamário normal adjacente (IMH-371), cancro da próstata e tecido prostático normal adjacente (IMH-303), cancro do pulmão (IMT-305), cólon e reto (IMH-306) , cancros epiteliais comuns, compreendendo de fígado, bexiga, ovários, pâncreas, mama e próstata (IMH-327) foram adquiridos a partir de Imgenex Corp (San Diego, CA). Vinte e um blocos de tecido de hiperplasia benigna da próstata (HBP) foram obtidos a partir do banco de tecidos em Mount Sinai Hospital, avaliação pelo patologista e usado para o corte de secções de tecido para a imunocoloração com anticorpos Ep-ICD e EPEX.

Antibodies e a linha celular foi obtida

anticorpo monoclonal de coelho Ep-CID

anti-humano de Epitomics Inc. (Burlingame, CA). anticorpo monoclonal de ratinho anti-humano EPEX (MOC-31) foi obtida a partir de AbD serotec (Raleigh, NC). O anticorpo α-EP-ICD 1144 reconhece o domínio citoplasmático de EpCAM humana e tem sido utilizado em nosso estudo recente sobre Ep-ICD em carcinoma da tiróide [28]. MOC-31 reconhece o domínio extracelular de EpCAM. Ambos os anticorpos foram utilizados no nosso estudo recente no cancro da tiróide [28].

A linha celular de adenocarcinoma de cólon humano CX-1 foi cultivada em meio RPMI-1640 contendo 100 ug /mL de estreptomicina e 100 U /mL de penicilina , 10% de soro fetal de bovino (FBS) e aminoácidos não essenciais a 1%. O perfil STR da linha celular foi encontrado para ser de acordo com o perfil conhecido de CX-1 nas bases de dados da Colecção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemanha).

características clínico-patológicos do pacientes

Cinquenta e sete pacientes com CECP, com idade variando de 29 a 75 anos foram incluídos neste estudo. Seus diagnósticos foram baseados em exame clínico e análise histopatológica das amostras de tecido. Os tumores foram histologicamente classificados carcinoma de células escamosas bem diferenciado (WDSCC), carcinoma de células escamosas moderadamente diferenciado (MDSCC) ou carcinoma de células escamosas pouco diferenciado (PDSCC). Vinte tecidos retirados de um local distante de HNSCCs (com confirmação histológica epitélio normal, aqui referida como cabeça e pescoço tecidos normais) também foram avaliados para Ep-ICD e expressão EPEX.

Quarenta e seis pacientes foram inscritos no CICAc este estudo. Seus diagnósticos foram baseados em exame clínico e análise histopatológica das amostras de tecido. Os tumores foram histologicamente classificados CECs bem, moderadamente ou pouco diferenciados. Vinte tecidos retirados de um local distante de ESCCs (com confirmação histológica epitélio normal, aqui referida como tecidos normais esofágicas) também foram avaliadas para a expressão da proteína Ep-ICD. Da mesma forma, os tecidos quarenta tomadas a partir de um local distante de ESCCs (com confirmação histológica epitélio normal, aqui referida como tecidos normais do esôfago) foram avaliadas para a expressão EPEX.

TMAs de câncer de mama e tecido mamário normal adjacente, câncer de próstata e tecido adjacente normal de próstata, câncer de pulmão, cólon e reto, cancros epiteliais comuns composto de fígado, bexiga, ovários, pâncreas, mama e próstata foram examinados. Para Ep-CID, o número de tecidos analisados ​​eram 38 cancros da mama e 25 correspondentes tecidos normais, 49 cancros da próstata e 9 correspondentes tecidos normais e 21 hiperplasias benignas da próstata, 57 HNSCCs e 20 correspondentes tecidos normais, 46 ESCCs e 20 correspondentes tecidos normais, 59 cada um dos cancros do pulmão e cólon, 10 cada um de bexiga, ovário e pâncreas, e 9 cancros do fígado. Para EPEX, o número de tecidos que estavam disponíveis para análise imuno-histoquímica incluiu 40 cancros da mama e 29 correspondentes tecidos normais, 49 cancros da próstata e 9 correspondentes tecidos normais e 21 hiperplasias benignas da próstata, 39 HNSCCs e 20 correspondentes tecidos normais, 47 ESCCs e 40 correspondentes tecidos normais, 59 casos a cada dos cancros do pulmão e cólon, e 10 casos a cada de bexiga, ovário e câncer de fígado.

a análise imunohistoquímica da expressão de Ep-ICD em cancros epiteliais

incluídas em parafina Serial secções embebidas (5 um de espessura) de HNSCCs, ESCCs e seus tecidos normais foram usadas para Ep-ICD e EPEX imunocoloração como já descrita recentemente [28]. As lâminas TMA e secções de tecido individuais foram de-parafinado por cozedura a 62 ° C durante 1 hora na orientação vertical e re-hidratadas em xileno e classificados série de álcoois. Daí em diante, as condições de recuperação de antigénios foram optimizadas e foi realizada em tampão de citrato 0,01 M, pH 6,0 durante 3 minutos a 115 ° C, usando um forno TTmega (Milestone Inc. Shelton, CT). A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação de secções em metanol contendo 0,3% de peróxido de hidrogénio durante 20 minutos. Após bloqueio da ligação não específica com o cavalo normal ou soro de cabra, as secções foram incubadas com α- Ep-CID anticorpo monoclonal de coelho 1144 (diluição 1:200) durante 30 minutos e o anticorpo secundário anti-coelho de cabra biotinilado durante 30 minutos ou incubadas com MOC-31 (diluição 1:200) durante 30 minutos com o anticorpo secundário biotinilado correspondente (cavalo anti-ratinho ou anti-coelho de cabra) (Vector Laboratories, Burlington, Ontário, Canadá) para 30 minutos. As seções foram finalmente incubadas com Vectastain Elite ABC Reagente (Vector Laboratories) e diaminobenzedine foi usado como cromógeno.

Avaliação da coloração imuno-histoquímica

As imagens TMA foram adquiridos usando o System Integrator Visiopharm (Visiopharm , Horsholm, Dinamarca). Ep-ICD e EPEX coloração imuno foi avaliada em cinco áreas das imagens adquiridas das secções de tecido e a média destes cinco pontuações foi calculado. As secções foram classificados como positivos se as células epiteliais mostrou imunopositividade na membrana plasmática, citoplasma e /ou núcleo quando observada por dois avaliadores que foram cegos para a histopatologia clínico e diagnóstico. Estas secções foram classificadas com base na percentagem de positividade como se segue: 0, 10% das células; 1, 10-30% de células; 2, 30-50% das células; 3, 50-70% das células; e 4, 70% das células mostraram imunorreactividade tal como descrito anteriormente [28]. As secções foram também teve semi-quantitativamente em função da intensidade da seguinte maneira: 0, nenhum; 1, leve; 2, moderada; e 3, intensa. Finalmente, uma pontuação total (que varia de 0 a 7) foi obtida por adição das pontuações de percentagem e a intensidade de positividade para cada secção do cancro e tecido normal. Os dados de imuno-histoquímica foram submetidos à análise estatística, tal como descrito anteriormente [29].

A análise estatística

Os dados IHC foram submetidos à análise estatística usando SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL) e Graphpad 5 Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). Gráficos de dispersão foram utilizados para determinar a distribuição da pontuação total para membrana, nuclear, e Ep-expressão citoplasmática CID em tecidos normais e cancerosos. characteristic (ROC) curva receiver operating análises foram realizadas para calcular a sensibilidade, a especificidade e a área sob a curva (AUC) em cada tipo de cancro para nuclear e citoplasmática Ep-CID. Com base na sensibilidade e especificidade ideal, um valor de corte pontuação IHC de ≥4 foi definida como imuno uniformemente para todos os tipos de câncer analisados ​​para exame estatístico.

Análise

Imunofluorescência da EP-ICD e EPEX localização em CX -1 linha celular de cancro do cólon

células de cancro do cólon foram cultivadas em lâminas de vidro até 60% de confluência e, em seguida, incubadas com α-EP-CID anticorpo monoclonal de coelho 1144 (1:100 diluição) ou rato 1-CX anticorpo monoclonal MOC-31 (1:100). Para Ep-CID, o anticorpo secundário foi utilizado um isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) marcado com anticorpo de cabra anti-coelho (Sigma-Aldrich, 1:200 diluição). Para EPEX, o anticorpo secundário foi utilizado um isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com anticorpo de cabra anti-ratinho (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 1:200 diluição). As lâminas foram visualizados usando um microscópio de fluorescência ereto Olympus (BX61) e as imagens foram analisadas usando software Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA).

Resultados

A análise imunohistoquímica da expressão de Ep-ICD no epiteliais humanas cancros

os parâmetros conhecidos clínicos, histopatologia, e contagens Ep-ICD IHC para cada tipo de câncer são fornecidos nos quadros suplementares S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10. Entre os tipos de cancro que foram comparados aos tecidos normais (Tabela 1), os cancros da mama exibiram 82% de positividade nuclear Ep-CID (31 de 38 tecidos) e 84% de positividade citoplasmática Ep-CID (32 de 38 tecidos). Com base em uma nota de corte IHC de 4, nenhum dos 25 tecidos normais da mama analisados ​​foram considerados positivos para nuclear Ep-ICD; 56% (14 de 25 tecidos) não mostraram coloração nuclear detectável em células lobular de mama ou de células do ducto, enquanto os restantes 11 casos apresentaram escores IHC baixos. cancros da próstata exibiu 82% de positividade nuclear (40 de 49 tecidos) e 82% de positividade citoplasmática (40 de 49 tecidos). Nuclear Ep-CID foi positiva em 2 9 de tecidos prostáticos normais, e positividade citoplasmática foi observado em 1 de 9 tecidos. Entre os 21 tecidos analisados ​​BPH, positividade citoplasmática foi observada em um dos 21 tecidos; nenhum dos tecidos eram nuclear Ep-ICD positiva com base em uma nota de corte de 4. Em HNSCCs, positividade nuclear Ep-ICD foi de 65% (37 de 57 tecidos) e positividade citoplasmática foi de 74% (42 de 57 tecidos). positividade nuclear CICAc foi de 37% (17 de 46 tecidos) e positividade citoplasmática foi de 70% (32 de 37 tecidos). Nuclear e citoplasmática Ep-ICD foi cada observado para ser positivo em apenas 1 de 20 tecidos normais em câncer de cabeça e pescoço. Para CICAc, positividade nuclear foi observada em dois de 20 tecidos normais e positividade citoplasmática foi observada em 6 de 20 tecidos normais. Todos os restantes cancros epiteliais exibida acumulação nuclear e citoplasmática da EP-CID (Tabela 1). Notavelmente, embora o uso de um ponto de corte de ≥4 para determinar positividade levou a reduzida positividade nuclear e citoplasmática em cancros pancreáticos, um exame da pontuação revelou que um corte de 3,5 teria identificado 7 de 10 casos de acumulação Ep-ICD e nuclear 5 de 10 casos de acumulação de Ep-ICD citoplasmática (Veja suplementar Tabela S8).

As fotomicrografias representativas mostrado na Figura 1 demonstram Ep-ICD imunomarcação em tecidos normais e cancerosas. O painel A mostra a localização da membrana predominante da EP-ICD e nenhuma coloração nuclear no tecido mamário normal (I), enquanto que o tecido de cancro mostra acumulação Ep-CID nuclear e citoplasmática (II). Painel B (Ia) descreve baixo nível de membrana Ep-CID nas células epiteliais e as células basais mostram coloração nuclear ligeira no tecido da próstata normal e em doentes com hiperplasia benigna da próstata (Ib). O tecido de câncer de próstata mostra citoplasmática intenso e marcação nuclear aumentou (painel B, II). Nas células endoteliais, forte coloração Ep-ICD foi observado de forma consistente. Em adipócitos, coloração variava de ausente para suave em algumas células. Linfócitos fortemente coradas nos tecidos tumorais, ao passo que nenhuma foi observada em tecidos normais. coloração do músculo liso estava ausente ou fraco em todos os casos. Nenhuma coloração detectável Ep-CID foi observada no tecido esofágico normal (painel C, I), enquanto que o CICAc nuclear mostrou intensa e imunocoloração citoplásmica (painel C, II). A cabeça eo pescoço mucosa normal mostrou membrana fraco Ep-ICD (painel D, I), enquanto nuclear intensa e imunocoloração citoplasmática foi observada em CECP (painel D, II).

As fotomicrografias representativas retratam Ep-ICD imunocoloração em tecidos normais e cancerosas. O painel A mostra a localização da membrana predominante da EP-ICD e nenhuma coloração nuclear no tecido mamário normal (I), enquanto que o tecido de cancro mostra acumulação Ep-CID nuclear e citoplasmática (II). O painel B mostra baixo nível de membrana Ep-CID nas células epiteliais e as células basais mostram alguma coloração nuclear no tecido da próstata normal (Ia) e na hiperplasia benigna da próstata (B, Ib), enquanto que o tecido de cancro mostra citoplasmática intensa e nuclear coloração (II). O painel C mostra a coloração não Ep-CID detectável no tecido esofágico normal (I), enquanto que o CICAc mostra nuclear intensa e imunocoloração citoplásmica (II). O Painel D mostra a cabeça e pescoço membrana mucosa normal que mostra fraca Ep-CID (I), enquanto que o HNSCC mostra nuclear intensa e imunocoloração citoplásmica (II). ampliação original × 400.

O aumento nuclear e imuno citoplasmática e reduzida ou foi observada ausência de coloração da membrana da EP-ICD em cancros da bexiga (Figura 2, painel A), pulmão (B), fígado (C), dos ovários (D), cólon (e), e pâncreas (F). Notavelmente, a coloração da membrana Ep-CID foi observada, em alguns casos de cancro epitelial cada analisados. fotomicrografias representativas de cancro da próstata e cancro do cólon que descreve coloração heterogéneo Ep-CDI são mostrados na Figura 3 A, B. Algumas áreas da secção de tecido revelou membrana citoplasmática fraca e predominante, mas nenhuma localização nuclear da EP-CID (Figura 3A, B – esquerda quadrado), enquanto as outras áreas da mesma secção de tecido mostraram acumulação nuclear e citoplasmática da EP-ICD com ausência de expressão membranoso Ep-ICD (Figura 3A, B – quadrado direita). As fotomicrografias de controlo positivas e negativas são mostradas na Figura 4.

O aumento da imunorreactividade nuclear e citoplasmática e reduzida ou ausência de coloração da membrana da EP-CID foi observada em cancros da bexiga (Painel A), pulmonar (painel B ), fígado (Painel C), ovário (Painel D), cólon (painel e), e pâncreas (Painel F). ampliação original × 400.

Membrane, citoplasmática, e expressão Ep-ICD nuclear no cancro da próstata (A) e cancro do cólon (B). Algumas áreas da secção de tecido mostram membrana predominante e fraco citoplasmática mas nenhuma localização nuclear da EP-ICD (A, B – quadrado esquerda), enquanto as outras áreas da mesma seção mostram tecido nucleares e de acumulação citoplasmática da EP-ICD com ausência de expressão membranoso Ep-ICD (A, B – quadrado direita). ampliação original × 400.

As microfotografias controlo positivo e negativo são mostrados. Ep-ICD controlos negativos para HNSCC (A), o cancro da próstata (B), o cancro do cólon (C), o cancro da mama (D), CICAc (E), e do esófago normal (F); painéis G e H são controles positivos para coloração Ep-ICD. ampliação original × 400.

Dispersão Análise

Os gráficos de dispersão na Figura 5A e 5B mostram a distribuição dos escores nuclear e citoplasmática de positividade Ep-ICD em todos os tipos de câncer epitelial analisados . Nuclear Ep-ICD foi observada em 39 dos 57 tecidos CECP e em 18 dos 46 tecidos CICAc. Trinta e sete destes 39 tecidos CECP examinados e 17 dos 18 tecidos CICAc mostrou pontuação IHC ≥4. Citoplasmática de coloração Ep-ICD foi detectada em 42 dos 57 tecidos (74%) CECP examinados e 32 dos tecidos 46 (70%) CICAc. câncer de mama, câncer de próstata, e positivamente-coloração HNSCCs e ESCCs todas as elevações notáveis ​​expostas de ambos nuclear e citoplasmática Ep-ICD em comparação com os tecidos normais e de próstata tecidos hiperplásicas benignas analisados. Pulmão, cólon, fígado, bexiga, ovário, e os tipos de cancro do pâncreas cada demonstrou expressão proeminente de nuclear e citoplasmática Ep-CID. Os gráficos de dispersão da Figura 5C mostram a distribuição da membrana pontuações Ep-ICD em todos os tipos de câncer epitelial analisados.

Gráficos de dispersão que mostram a distribuição de escores totais de positividade determinados por IHC de secções de tecido de cancro da mama (n = 38), da próstata (n = 49), pulmão (n = 59), ovário (n = 10), cólon (n = 59), da bexiga (n = 10), HNSCCs hepática (n = 9), de forma positiva de coloração (n = 39) e ESCCs (n = 19), e mama normal (n = 25), da próstata (n = 9) e hiperplasia prostática benigna (n = 21), esofágico normal (n = 20), e cabeça e pescoço (N = 20) tecidos. O eixo vertical dá a pontuação total IHC como descrito nos Métodos. Um ponto de corte de ≥4 foi usada para determinar a positividade. N, normal; Ca, câncer. A. Aumento da acumulação nuclear da EP-CID foi observado na maioria dos cancros epiteliais analisados. B. Aumento da acumulação citoplasmática da EP-ICD foi observada em quase todos os cancros epiteliais analisados. C. Membrana localização de Ep-ICD variada nos diferentes câncer e tipos de tecidos normais examinados.

A análise imunohistoquímica de expressão EPEX em cancros epiteliais humanas

Uma análise semelhante IHC de expressão EPEX em estes cancros epiteliais humanos também foi realizada utilizando MOC31, um anticorpo específico contra o domínio extracelular de EpCAM (EPEX) em todas as dez cancros epiteliais (Figura 6 e 7). fotomicrografias representativas na Figura 6, painel I mostram baixo nível de membrana expressão EPEX em mama normal (A) e da próstata (B, Ia), BPH (B, Ib), e (d) os tecidos esófago normal (C) e da cabeça e pescoço . Os tecidos de cancro correspondentes descrevem aumento do nível de EPEX na membrana são mostrados na Figura 6, painel II (A- mama; B-próstata; C- esófago; e D- cabeça e do pescoço). Em contrapartida, muitos dos tecidos de cancro de cada tipo de cancro mostrou ausência de membrana EPEX; fotomicrografias representativas são mostrados no painel III (A-D). A Figura 7, Painel I apresenta membrana intensa EPEX no cancro do cólon (A), fígado (B), da bexiga (C), do pulmão (D), dos ovários (E) e do cancro do pâncreas (F). Figura 7 Panel II (A-F) mostra reduzida ou ausência de membrana EPEX em um subconjunto de cada um destes cancros epiteliais. Os controlos positivos e negativos são mostrados na Figura Suplementar S1.

As fotomicrografias mostram MOC31 membrana manchado EPEX em cancros epiteliais. O painel E mostra baixo nível de expressão EPEX membrana em mama normal (A) e da próstata (B, Ia), BPH (B, Ib), e (d) os tecidos esófago normal (C) e da cabeça e pescoço. Os tecidos de cancro correspondentes descrevem aumento do nível de EPEX na membrana são mostrados no painel II (A-D). Em contrapartida, muitos dos tecidos de cancro de cada tipo de cancro mostrou ausência de membrana EPEX (Panel III, A-D). ampliação original × 400.

expressão

Membrana EPEX foi observada em todos os cancros epiteliais. Painel I apresenta membrana intensa EPEX no cancro do cólon (A), fígado (B), da bexiga (C), do pulmão (D), do ovário (E) e do cancro do pâncreas (F). Os painéis II A-F mostram reduzida ou ausência de membrana EPEX em um subconjunto de cada um destes cancros epiteliais. ampliação original × 400.

Análise da EP-ICD e EPEX imunofluorescência na linha de células de câncer de cólon-1 CX

Em CX-1, uma linha de células de câncer de cólon agressivo, EPEX e Ep-CID foram detectadas tanto na membrana plasmática (Figura 8). expressão membrana intensa foi observada nas junções célula-célula com ambos EPEX e anticorpos específicos de domínios Ep-CDI (Figura 8 – A, D, F, e G). Além disso, observou-se acumulação de Ep-CID no citoplasma e núcleo das células cancerosas, mas não foi encontrado EPEX acumulação nos núcleos (Figura 8 – C, E, G). A verificação quantitativa sinal de fluorescência de EPEX e EP-ICD apoia claramente estas observações (Figura 8H).

anticorpos secundários são FITC-anti-rato (verde) e TRITC anti-coelho (vermelho). A) EPEX; B) Ep-ICD; C) DAPI; D) EPEX e DAPI (A C fundiu); E) Ep-ICD e DAPI (B C fundiu); F) EPEX e EP-ICD (A B fundiu); G) EPEX, EP-ICD, e DAPI (A, B, C fundiu); I) A medição da densidade de três cores em toda a linha nas células em H.

curvas ROC Curve Análise

ROC foram geradas para nuclear e citoplasmática Ep-ICD em CECP, CICAc, cancros da próstata, e da mama (Figura 9) e os seus resultados estão resumidos na Tabela 2. com base nesta análise, um ponto de corte de ≥4 foi usada para determinar a positividade nuclear e citoplasmática. A análise revelou que a energia nuclear acumulação Ep-ICD distinguido cânceres de próstata e câncer de mama a partir de tecidos normais com sensibilidade de 82% e com uma especificidade de 100% para câncer de mama e 78% para próstata. Em HNSCCs, nuclear Ep-CID foi capaz de distinguir os cancros a partir de tecidos normais com sensibilidade de 65% e especificidade de 95%, enquanto que em ESCCs, nuclear Ep-CID mostrou 37% de sensibilidade e especificidade de 90%. Os valores da AUC foram encontrados para ser 0,905 para câncer de mama, 0,867 para câncer de próstata, 0,822 para CECP, e 0.630 para ESCC. expressão citoplasmática Ep-ICD no câncer de mama e próstata tinha uma sensibilidade de 82% e 84%, respectivamente, com uma especificidade de 100% para câncer de mama e 89% para próstata. Em HNSCC, citoplasmática expressão Ep-ICD tinha uma sensibilidade de 74% e uma especificidade de 95%, enquanto citoplasmática Ep-ICD teve sensibilidade e especificidade de 70% cada um em ESCCs. Os valores da AUC para citoplasmática Ep-ICD foram 0,928 no cancro da mama, 0.880 no cancro da próstata, 0,864 para CECP e 0,758 em ESCC.

curvas ROC que descrevem a relação entre sensibilidades e 1-especificidades do Ep nuclear e citoplasmática expressão -ICD nestes cancros epiteliais. O eixo vertical de cada curva indica a sensibilidade e o eixo horizontal indica o 1-especificidade. A sensibilidade, especificidade e valores da AUC para os cânceres estão resumidos na Tabela 2.

Discussão

O presente estudo destaca a ocorrência frequente de acumulação nuclear e citoplasmática de Ep -ICD em dez tipos de câncer epitelial. O epitélio normal dos tecidos da mama, da próstata e esôfago analisados ​​mostraram membrana distinta Ep-ICD localização. Importante, redução ou ausência de membranoso Ep-ICD foi observada em cancros da mama, próstata, cabeça e pescoço e esôfago, em paralelo com acentuado acúmulo de Ep-ICD no núcleo e citoplasma das respectivas células tumorais. No entanto, um subconjunto de tumores de cada uma destas dez tipos de cancro apresentaram expressão elevada membrana Ep-CID que correlacionada com a expressão elevada EPEX na membrana detectada usando um domínio externo Ep-CAM (EPEX) anticorpo específico (MOC31), sugerindo um aumento da expressão de a proteína de comprimento completo, como detectado pela EP-ICD e anticorpos específicos EPEX. Notavelmente, a análise imuno-histoquímica de cancros epiteliais usando MOC31 mostraram aumento da expressão de membrana EPEX em comparação com os tecidos normais em alguns tumores, enquanto os outros mostraram redução ou ausência de membrana EPEX, apoiando as nossas observações com anticorpos específicos de domínio Ep-ICD. Vale a pena salientar que os cancros mostrando reduzida ou ausência de membrana EPEX ou EP-CID tinha marcadamente aumentada Ep-CID no citoplasma e núcleo das células tumorais tais. Notavelmente, EPEX não foi detectada em qualquer um dos núcleos das células de tumor em qualquer um dos cancros analisados. Tomados em conjunto, estas observações favoráveis ​​a uma maior expressão e aumento da excreção de EPEX por células tumorais em um subconjunto de todos os tumores epiteliais estudados.