Abstract

câncer de pâncreas (PC) permanece Diferentes a quarta principal causa de morte por câncer com uma sobrevivência inaceitável que se manteve relativamente estável ao longo dos últimos 25 anos. A presença de metástases ocultas ou clínicos no momento do diagnóstico, juntamente com a falta de quimioterapias eficazes representam uma extrema necessidade para a concepção de novos e direcionados resultados terapêuticos que favorece a evolução clínica. Aqui, nós investigamos o potencial anti-tumorigénica de polifenóis de cinco castanho-algas diferente em células PC humano (MiaPaCa-2, Panc-1, BxPC-3 e Panc-3,27). capacidade anti-oxidante (TAC) análise total em separações de polifenóis passo a passo com o aumento da polaridade (hexano-DCM-EA-metanol) identificados níveis elevados de TAC em DCM e EA extrações em todas as algas avaliados. Todos DCM e EA separados polifenóis induziu uma inibição sustentada e dependente da dose (tempo-independente) da proliferação celular e a viabilidade. Além disso, estes polifenóis profundamente melhorado danos no DNA (laranja de acridina /brometo de etídio coloração e fragmentação de ADN) em todas as linhas celulares investigadas. Mais importante ainda, ensaio de repórter de luciferase revelou uma inibição significativa de transcrição NFkB em células tratadas com polifenóis. Curiosamente, a análise de QPCR identificou um diferencial ainda regulamentação definida de EGFR pró-tumorigénico, VEGFA, AKT, hTERT, Kras, Bcl2, FGFα e PDGFα transcrição em células tratadas com DCM e EA polifenóis. Immunoblotting valida o potencial inibitório dos polifenóis de algas em EGFR fosforilação, Kras, AurKβ e Stat3. Em conjunto, estes dados sugerem que as fracções com base de polaridade intermédia de polifenóis de algas pode potenciar significativamente a morte celular tumoral e podem servir como potenciais entrega da droga para a cura do PC. Mais Estudos dissecando os componentes ativos em frações potentes, mecanismos de ação e sinergismo, se houver, são garantidos e estão atualmente em processo de

Citation:. Aravindan S, Delma CR, Thirugnanasambandan SS, Herman TS, Aravindan N (2013) Anti-Cancro do pâncreas Entregas do Mar: Primeira mão evidências sobre a eficácia, Metas Molecular e modo de ação para Multifarious polifenóis de cinco diferentes Brown-algas. PLoS ONE 8 (4): e61977. doi: 10.1371 /journal.pone.0061977

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de dezembro de 2012; Aceito: 15 de março de 2013; Publicação: 16 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Aravindan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores são apoiados por fundos de desenvolvimento de pesquisa do Departamento de radiação Oncológica da Universidade de Oklahoma Health Sciences Center, a N. Aravindan e do Governo da Índia, do Departamento de Ciência e Tecnologia (DBT Sanção Despacho n.º Data: BT /PR11535 /AAQ /03/431/2008; 17.09.2009) concessão (Avaliação de polifenóis e os polissacáridos de Phaeophytes contra o estresse oxidativo e Câncer progressão para o Desenvolvimento de Medicamentos) para T. Somasundaram. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Por favor, note que o co-autor Natarajan Aravindan é um membro do Conselho Editorial PLOS. Isto não altera a adesão dos autores a todos e qualquer uma das políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de pâncreas (PC) continua a ser a quarta principal causa de morte por câncer em Estados Unidos, com uma expectativa de 43,920 novos casos em 2012 [1]. Infelizmente, as taxas de mortalidade PC permaneceu relativamente inalterada desde 1975, com uma taxa de sobrevida em 5 anos de apenas 5,4% [2]. A presença de metástases ocultas ou clínicos no momento do diagnóstico, juntamente com a falta de quimioterapias eficazes contribui para a elevada taxa de mortalidade em pacientes com PC. Para esse efeito, o tratamento de PC, altamente contar com a melhor compreensão da genética e biologia [3], que podem estar intimamente associada a tumorigénese e formação de metástases. Além disso, PC é um dos tumores resistentes aos medicamentos intrinsecamente mais e, resistência aos agentes quimioterapêuticos é uma das principais causas de insucesso do tratamento em PC. Apesar de extensa pesquisa sobre muitas terapias direcionadas com excelentes efeitos anti-tumorais em modelos pré-clínicos, a investigação clínica mostraram que terapias específicas individuais e terapias mais combinadas não foram capazes de melhorar o prognóstico desta doença. É importante mencionar que existem 1344 ensaios clínicos em curso (trials.gov www.clinical acessados ​​em 30 de Novembro de 2012), actualmente, visando muitos alvos moleculares potenciais com um número de linha de tubulação de drogas-resultados promissores. Apesar de, uma tentativa tão colossal para atenuar a progressão PC e divulgação, em tempo real, estamos em nenhum lugar perto as taxas de sobrevivência aceitáveis. Em parte, isso é atribuído ao fato de que o PC pode possuir características e metas diferentes em diferentes estágios de patogênese, manutenção e metástase [4]. Além disso, a conversa cruzada entre vias de sinalização celular, um fenómeno importante no PC, podem resultar em sobrevivência de células de cancro e metástases, embora algumas vias são bloqueados por terapia-alvo. A sensibilidade à terapia pode também variar para as células cancerosas em diferentes fases. A estrutura PC único, com estroma abundante cria um microambiente do tumor com hipóxia e baixa taxa de perfusão sanguínea, o que impede a entrega de drogas para as células cancerosas. Portanto, existe uma necessidade desastrosas para a concepção de novos e orientadas estratégias terapêuticas que podem melhorar o resultado clínico em pacientes com diagnóstico de PC. Assim, aqui nós investigamos o potencial anti-PC de polifenóis de uma fonte incomum, algas castanhas marinha.

Macro algas (algas marinhas) são importantes fontes de proteínas, iodo, vitaminas e minerais e, portanto, têm demonstrado possuir potenciais preventivas quimio [5]. Outros estudos têm demonstrado que, as algas marinhas possuem um elevado teor de polifenóis tais como catequina, epicatequina, galato de epigalocatequina e ácido gálico (ver revisão [6]). Estes compostos polifenólicos demonstraram muitas bioactividades de saúde beneficiar, tais como anti-oxidantes, anti-cancro, anti-virais, anti-inflamatória, e a capacidade de inibir a agregação de plaquetas humanas 6,7. Além disso estudos têm mostrado uma correlação positiva entre o aumento da ingestão de antioxidantes naturais ea doença coronária reduzida, mortalidade por câncer, bem como a expectativa de vida mais longa [6], [8]. A estreita associação entre a actividade anti-cancerígena e atividade antioxidante foi relatada em modelos de ratos com carcinoma com polifenóis [9] – [12]. Para que a nota, investigações recentes demonstraram precisamente as funções anti-proliferativo, pró-apoptótica, de ADN prejudiciais, anti-angiogénico, inibindo o crescimento, a paragem do ciclo celular e anti-metastáticos de extractos de algas em um certo número de modelos de tumores incluindo melanoma, nasofaringe, carcinoma gástrico, cancro da mama, etc. [13] – [18]. No entanto, estes estudos estão confinados a polissacáridos e /ou de extractos em bruto, e o benefício de polifenóis de algas ou os seus componentes activos contra a carcinogénese do pâncreas e /ou a sua progressão (se não para qualquer tumor) nunca foi investigada. Além disso, uma visão aprofundada sobre o efeito dos polifenóis de algas neste cenário, o seu potencial na regulação da sinalização celular do tumor, o modo de actuação (potenciais alvos moleculares ainda definidas, se for o caso), continua a ser reconnoitered. Devido ao facto de os polifenóis alvo principais vias de sinalização celular, nós investigamos o efeito dos polifenóis de cinco algas castanhas diferente nas configurações de PC. Este estudo fornece evidências de primeira mão sobre os potenciais antioxidante, anti-proliferativa e matar células de extrações com base polaridade destas algas. Além disso, este estudo também identifica o potencial dos polifenóis extraídos sobre os principais alvos moleculares de progressão tumoral, incluindo NFkB, EGFR, Kras, STAT3, VEGF, AKT, TERT, FGFA, BCL2 e PDGFA.

Materiais e Métodos

Cultura de células

Humano Panc-1 (ATCC-CRL1469), Panc-3,27 (ATCC-CRL2549), BxPC-3 (ATCC-CRL1687) e MIA PaCa-2 (ATCC-1420) As células foram obtidas de Dr. Daniel J. Brackett (Departamento de cirurgia da Universidade de Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, OK). Cultura de manutenção e Panc-1, BxPC-3, e células MIA PaCa-2 foram realizados tal como descrito anteriormente [19]. células Panc-3.27 foram mantidas como culturas em monocamada por passagem em série semanalmente em placas de cultura de tecidos de 100 mm em elevado teor de glucose meio RPMI-1640 com 2 mM de L-glutamina, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM, 1,500 mg /L de bicarbonato de sódio, 10 unidades /insulina recombinante humana ml e soro bovino fetal a 15%. MCF10A (ATCC-CRL10317), células de músculo liso de aorta humana (HASMC, ATCC-PCS-100-012) e na artéria ilíaca Humana células endoteliais (HIAE, ATCC), as células foram obtidas do Dr. Mohan Natarajan (Universidade do Texas no Centro de Ciências da Saúde San António, TX). As células foram mantidas como culturas em monocamada em meio 199 (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 1,500 mg /L de bicarbonato de sódio, o MEM de vitaminas, não-aminoácidos essenciais, Pen /Strep e 10% HIFBS. Para MCF10A o meio foi, adicionalmente, suplementada com o suplemento de crescimento epitelial mamária (Life Technologies) e toxina da cólera (Sigma). Para a passagem e para todas as experiências, as células foram descoladas utilizando tripsina (0,25%) /EDTA (1%), re-suspensas em meio completo, contados electronicamente utilizando Condessa contador de células automatizado (Carlsbad, CA), e incubou-se em um 95% ar /5% de CO2, incubadora humidificada.

extracção de polifenóis e de células tratamentos

células plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 100 mm contendo 6 ml de meio de crescimento completo foram deixadas a crescer até 70% a 80 % de confluência. Cinco espécies de algas castanhas,

Dictyota dichotoma

(DD),

Hormophysa triquerta

(HT),

Spatoglossum asperum

(SA),

Stoechospermum marginatum

(SM) e

Padina tetrastromatica

(PT) foram coletados a partir da costa Mandapam, golfo de Mannar, costa sudoeste da Índia. Algas são coletados como parte do Departamento de Ciência e Tecnologia, Governo da Índia patrocinado projeto DBT e, uma vez que esta coleção não envolve quaisquer espécies ameaçadas ou protegidas, não eram necessárias permissões específicas (Departamento Florestal, Governo da Índia isentos). Recentemente algas recolhidos foram lavados, seco em estufa e a sua pó foi utilizado para a extracção sequencial de polifenóis em gradiente (aumento) solventes de polaridade incluindo hexano (H), o diclorometano (DCM), acetato de etilo (EA) e metanol (H). Em resumo, 50 g de algas em pó embebido em três volumes de solvente específica foi agitar durante 48 h à temperatura ambiente. A lama foi filtrada através de papel de filtro Whatman seguido de incubação do resíduo no solvente subsequente. Resultando quatro filtrados foram completamente secas em tubos de centrífuga de micro pré-pesado usando SpeedVac (Thermo Scientific, Asheville, NC). Os filtrados secos foram pesados ​​e dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO) a uma concentração de caldo final de 100 mg /ml. Para o tratamento de células, polifenóis ” da ” soluções foram adicionalmente diluídas em cultura de células simples Médium (DMEM) a uma concentração ” ” de trabalho de 10 mg /ml. As células foram tratadas com várias concentrações (10, 50, 100 ug /ml) de polifenóis e deixada a incubar a 37 ° C durante 3 h e 24 h, a menos que de outro modo mencionado ou no texto. A concentração final de DMSO no meio de cultura celular foi . 0,0001%

total análise da capacidade antioxidante

Para determinar o potencial antioxidante da fracção 20 polifenol compreendendo fracções de 4 característicos de cada um de algas um total de 5 algas, o total de análise da capacidade antioxidante (TCA) foi realizada como descrito por Prieto e colegas [20]. Em resumo, as duas partes de cada extracção a várias concentrações (100, 250, 500 ug /ml e 1 mg /ml) foi misturada com uma parte do reagente de TCA (ácido sulfúrico 0,6 M, fosfato de sódio 28 mM e molibdato de amónio a 4 mM) e incubou-se a 95 ° C durante 90 min. A absorvância foi medida a 635 nm utilizando Sinergia II leitor de microplacas (Biotek Instruments, Inc. Winooski, VT). O ácido gálico (GA) foi utilizado como o controle positivo e controle negativo com solventes simples, também foram incluídos. As fracções que exibem elevados níveis de capacidade total anti-oxidante irá ser utilizado para análise posterior (anti-PC).

Viabilidade Celular

ensaio de exclusão de azul

tripano foi usada para identificar a eficácia de polifenóis algas na regulação da viabilidade das células PC. Mia-PaCa-2, Panc-1, Panc-3,27 e BxPC-3 células tratadas com várias concentrações (10, 20, 50 ou 100 ug /ml) de fracções de diclorometano (dd-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) ou fracções de acetato de etilo (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) foram examinadas após 24 h de alterações na viabilidade celular. Avaliação quantitativa foi realizada utilizando o contador de células automatizado condessa como descrito anteriormente [19] e comparados com controlos não tratados utilizando ANOVA de duas vias com o teste post-hoc de Bonferonii (GraphPad Prism v4.03, GraphPad Prism Software Inc., La Jolla, CA) . Um valor de P 0,05 é considerado estatisticamente significativo

A sobrevivência celular

A sobrevivência celular foi analisada utilizando CyQUANT Proliferação de Células Assay Kit (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, EUA) em Panc-. 1 e MIA PaCa-2 células tratadas com diclorometano (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) ou acetato de etilo (DD-eA, SA-eA, SM-eA, PT-eA , HT-EA) Os constituintes seguintes protocolo do fabricante. Em resumo, as células (5000 células /poço) cultivadas em placas de 96 poços com 200 ul /poço de meio de crescimento foi incubada a 37 ° C durante um período de 24 h. Para as células de estudos de escalonamento de dose foram expostos a concentrações crescentes (10, 20, 50 e 100 ug /ml) de polifenóis algas e analisados ​​após 3 h. Para estudos de recuperação dependentes do tempo, as células foram tratadas com 100 ug /ml de fracções polifenólicas e examinada após 3, 24, 48 ou 72 h. Após o tratamento, o meio de crescimento foi cuidadosa e completamente removido e as placas foram mantidas sob congelação (-70 ° C) durante mais 24 h. As células congeladas foram então lisadas com tampão de corante CyQUANT® GR /célula por lise celular (200 ul /poço) à temperatura ambiente, protegida da luz, durante 5 min e a fluorescência (480 nm de excitação e 520 nm de emissão) utilizando um leitor de placas de Sinergia II micro ( BioTek). Todas as amostras foram ensaiadas em triplicado. Os controlos negativos sem células foram incluídos. comparações entre os grupos-wise foram feitas usando ANOVA de duas vias com o teste Bonferonii post-hoc (GraphPad PRISM) e um valor de P 0,05 é considerado estatisticamente significativo. Além disso, para determinar se este polifenol (s) conduzido anti-proliferação de células de tumor é-selectiva e, para delinear a sua citotoxicidade celular normal, se for o caso, que examinaram os seus efeitos sobre células primárias. Para isso, as células MCF10A, HIAE e HASMC tratados com 100 ug /ml de DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT- eA ou HT-AE foram examinados depois de 24 h para alterações na proliferação celular.

morfologia nuclear por coloração dupla

Panc-1, Panc-3,27, BxPC-3 e MIA-PaCa-2 As células (5 × 10

5 células) cultivadas em 4 poços de placas (Nunc) tratados com 100 ug /ml de diclorometano (dd-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) ou acetato de etilo (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) fracções foram analisadas após 24 h para a morfologia nuclear como descrito anteriormente [21].

a fragmentação de DNA em agarose geles

DNA laddering ensaio foi usado para identificar a eficácia de polifenóis de algas na indução de fragmentação de ADN de células PC. Em resumo, o ADN de Panc-1, Panc-3,27, BxPC-3 e MIA-PaCa-2 células tratadas com DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA -EA, SM-eA, PT-eA e HT-eA por 24 h foi extraída com DNA stat-60 (Tel-Test Inc., Friendswood, TX, EUA), seguindo as instruções do fabricante. As amostras de DNA (5 ug) foram sujeitas a electroforese em gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio, visualizado utilizando ChemiDoc ™ XRS gerador de imagens (Biorad, Hercules, CA) e quantificada utilizando-Quantidade Um software de análise de imagens (Biorad). comparações entre os grupos-wise foram feitas utilizando análise de variância com correção de post-hoc de Tukey. Um valor de p 0,05 é considerado estatisticamente significativo

plasmídeo Preparação, DNA transfecção e luciferase Reporter Assay

Alterações na ativação do promotor de NFkB em diclorometano (DD-DCM, SA-DCM, SM. -DCM, PT-DCM, HT-DCM) ou acetato de etilo (DD-eA, SA-eA, SM-eA, PT-eA, HT-eA) frações tratados Panc-1, BxPC-3 e células MiaPaCa-2 foram investigada utilizando um ensaio de repórter de luciferase. A construção de plasmídeo pNFκB-Luc foi amplificado e purificado como descrito nos nossos estudos anteriores [22], [23]. lisados ​​celulares de células tratadas durante 24 h foram analisadas quanto à actividade de luciferase de acordo com o protocolo do fabricante (BioVision Research Products, Mountain View, CA) e do grupo de comparações sábios foram feitas usando ANOVA com correção de post-hoc de Tukey. Um valor de p . 0,05 é considerado estatisticamente significativo

QPCR

alterações transcricional de moléculas-chave de progressão tumoral, incluindo,

Bcl2, EGFR, PDGFA, VEGF, AKT, TERT, Kras e FGF

em diclorometano (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) ou acetato de etilo (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA ) fracções tratadas (durante 3 horas) Panc-1, Panc-3,27, BxPC-3 e MiaPaCa-2 foram analisados ​​por QPCR em tempo real como descrito anteriormente [23]. Utilizou-se β

-actina

como um controlo positivo e um controlo negativo sem ARN modelo também foi incluído. Cada experimento foi realizado em triplicado, eo

ΔΔ

C valores

t foram calculadas através da normalização dos níveis de expressão de genes a p

-actina

, eo nível de expressão relativa foi expressa como uma mudança vezes.

Immunoblotting

Panc-1, BxPC-3 e MiaPaCa-2 células expostas a diclorometano (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT -DCM) ou acetato de etilo (DD-eA, SA-eA, SM-eA, PT-eA, HT-eA) fracções foram analisadas após 24 h para as alterações na fosforilação do EGFR e os níveis de proteína de Kras, STAT3, EGFR e AURKβ. extracção de proteína total e imunotransferência foram realizadas como descrito nos nossos estudos anteriores [23], [24]. Para este estudo, as membranas transferidas-proteína foram incubadas com anticorpo monoclonal de coelho anti-pEGFR

(Tyr1068) (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, EUA), Kras (Grupo Proteintech, Inc. Chicago, IL, EUA), a STAT3 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, EUA) ou monoclonal de ratinho EGFR (Santa Cruz), anticorpo AURKβ (Proteintech). As manchas foram retirados e reblotted com anticorpo monoclonal de murganho anti-tubulina-α (Santa Cruz) para determinar a carga igual das amostras. análise de densitometria foi realizada utilizando Quantidade-ona (Biorad) e a intensidade da banda correspondente foi representada graficamente num histograma usando 5 Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA). comparações sábios do grupo foram feitas utilizando análise de variância com correção de post-hoc de Tukey.

Resultados

polifenóis alga abrigar altos níveis de antioxidantes

Para determinar o potencial antioxidante dos polifenóis de algas , foi examinada a capacidade antioxidante total das fracções extraídas, incluindo hexano, dichloromethane-, acetato de etilo-metano- e fracções de todas as cinco algas investigados. O ácido gálico foi utilizado como controlo positivo, e uma fracção de polissacárido a partir de algas marinhas correspondente foi também examinada para proporcionar uma ampliação relativa dos antioxidantes em polifenóis. TCA revelou níveis significativos de antioxidantes em todas as fracções polifenólicas de algas marinhas (Fig. 1). aumento dependente da dose nos níveis de antioxidantes de todas as fracções investigado valida precisamente disponibilidade e concentração antioxidante. Relativamente, observou-se níveis muito elevados de antioxidantes em diclorometano e acetato de etilo fracções de todas as algas investigados (Fig. 1). Inimitably, polifenóis extraídos de

Stoechospermum marginatum

mostrou a abrigar antioxidantes máximo, ~3.5 vezes maior em frações DCM e EA (Fig. 1). Devido ao facto de que, as fracções de DCM e EA contém antioxidantes elevados em todo o algas castanhas examinados, utilizou-se selectivamente estas duas fracções de cada erva daninha do mar para delinear o potencial anti-PC

.

Os polifenóis foram extraídos a partir de cinco espécies de algas castanhas,

Dictyota dichotoma

(DD),

Hormophysa triquerta

(HT),

Spatoglossum asperum

(SA),

Stoechospermum marginatum

( SM) e

Padina tetrastromatica

(PT) utilizando solventes de polaridade rampa incluindo hexano (H), o diclorometano (DCM), acetato de etilo (eA) e metanol (H). análise da capacidade antioxidante total foi realizada com ácido gálico (GA) como controle positivo, solventes simples como controlos negativos e fração de polissacarídeo de algas correspondente, como medida relativa.

frações polifenol antioxidante-ricos retarda a viabilidade das células PC

Mia-PaCa-2, Panc 3,27, Panc 1 e BxPC3 células tratadas com diclorometano (DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) ou acetato de etilo (DD-eA , SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) fracções (10, 20, 50 ou 100 ug /ml) foram examinados para determinar alterações na viabilidade celular utilizando o ensaio de exclusão de azul de tripano. Todas as fracções polifenólicas de DCM e EA mostraram um aumento significativo (P 0,001) inibição da viabilidade celular tão baixo quanto concentração de 10 ug /ml (Fig. 2A). Com concentrações crescentes de fracções polifenólicas, observou-se uma inibição dependente da dose da viabilidade das células em células de MiaPaCa-2 expostas a DCM ou fracções EA (Fig. 2a). Consistentemente, 100 ug /ml de toda a fracção (s) de DCM e EA viabilidade celular significativamente introvertido ( 60%) em células BxPC3 (Fig. 2B). No entanto, HT-EA mostrou relativamente menos potencial inibitório nessa linha celular. Like-sábio, observou-se uma eficiência inibitória consistente (~ 50%) de todas as frações do DCM em Panc 3.27 células (Fig. 2C). Por outro lado, as fracções EA mostrou um declive na eficácia de baixa actividade com DD-EA a um máximo da actividade com HT-EA em Panc 3.27 células (Fig. 2C). Em Panc 1 células, tanto DCM e as fracções EA inibiu marcadamente a viabilidade celular (Fig. 2D). Relativamente, observou-se uma inibição máxima da viabilidade celular com a SM-DCM e DD-EA ( 50%) fracções. Estes resultados demonstram que os polifenóis de algas potencialmente inibir a viabilidade das células PC e ainda identificar a ‘

célula de tipo

independente “dose mínima eficiente (50%) de inibição neste cenário.

Dose regulação associada de a viabilidade celular para cada fracções polifenólicas foram comparadas com controlos não tratados utilizando ANOVA de duas vias com o teste post-hoc de Bonferonii e um valor de P 0,05 é considerado estatisticamente significativo. gráficos de linhas que mostram a inibição significativa da viabilidade das células em (B) BxPC-3, (C) Panc-3,27 e células Panc-1 tratadas com DCM /ml fracções EA ou 100 ug (D).

polifenóis algas inibe a proliferação celular PC

Além disso para substanciar o potencial inibitório de células-viabilidade de anti-oxidantes polifenóis ricos na verdade traduz a consequente regulação da sobrevivência celular, examinámos o potencial anti-proliferativa das frações DCM e eA. Para alcançar este objectivo, foi medida a quantidade total de ADN (que aproximadamente proporcional ao número de células) e a extensão da proliferação foi determinada por comparação de contagem de células tratadas com droga MiaPaCa-2 e células Panc-1 com controlos não tratados. Em comparação com os controlos não tratados, CyQUANT-NF análise revelou uma dose significativa (10, 20, 50 e 100 ug /mL) inibição dependente da proliferação celular, tanto em MiaPaCa-2 e células Panc-1 com cada diclorometano (DCM-DD, frações SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM) ou acetato de etilo (DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA, HT-EA) (Figura 3). No entanto, estas fracções ricas em anti-oxidantes exibiu um “tipo de célula dependente ‘e /ou magnitude’ solvente-dependente” de inibição da proliferação celular. Evidentemente, todas as cinco fracções de DCM (100 ug /ml) profundamente (~ 50%) inibiu a proliferação de células de MiaPaCa-2, com a inibição máxima (-75%) observada após tratamento HT-DCM (Fig. 3A). Like-sábio, em células Panc-1, DD-DCM, PT-DCM e tratamento HT-DCM robustamente (~ 50%) inibiu a proliferação de células com a inibição máxima em PT-DCM células (Fig. 3B) tratados. Mais importante, todas as fracções EA também exibiu comparável DCM (~ 50%) a proliferação das células em potencial de inibição MiaPaCa-2 células (Fig. 3C). Evidentemente, o tratamento PT-EA apresentado inibição máxima nestas células. Embora, DD-EA, PT-EA e HT-EA mostrou potencial inibidor em células Panc-1, relativamente (por oposição ao DCM), EA fracções produziu efeito marginal (Fig. 3D). Em segundo lugar, examinamos se o polifenol algas inibiu células-sobrevivência é transitória (com recuperação dependente do tempo) ou de uma causa e efeito permanente. MiaPaCa-2 células tratadas com 100 ug /ml de DCM e EA fracções foram submetidas a análise de CyQUANT após 3, 24, 48 e 72 h. Em comparação com os controlos não tratados, polifenóis algas exerce uma significativa (P 0,001) anti-proliferação tão baixa quanto 3 h (Fig. 3E). Mais importante ainda, esta DCM e as fracções EA inibição da proliferação de células induzida permaneceu consistente após 24, 48 e 72 h (Fig. 3E). Estes resultados demonstram o potencial anti-proliferativa de polifenóis de algas em células PC e ainda mais short-list dos potenciais frações neste cenário.

As células expostas aos polifenóis de algas foram avaliados para a proliferação celular 3 h pós tratamento. Dose inibição da proliferação celular associado para cada fracções polifenólicas foram comparadas com controlos não tratados utilizando ANOVA de duas vias com o teste post-hoc de Bonferonii e um valor de P 0,05 é considerado estatisticamente significativo. (E) parcelas linha de DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA e HT-EA expuseram células MiaPaCa-2 que mostra a inibição significativa e sustentada (3, 24, 48 e 72 h) de proliferação de células. (F) parcelas linha de DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA e HT-EA expostos MCF10A humano normal, células HASMC e HIAE mostrando a sobrevivência da célula consistente 24 h após o tratamento. Em comparação com os controlos não tratados, todas as fracções de DCM e EA não revelaram inibição significativa da proliferação de células de todas as três linhas celulares investigadas. Tempo-line no line-parcelas mostra medições (480 nm de excitação e 520 nm de emissão) a fluorescência continuamente até 60 minutos.

Além disso determinar o tumor potencial seletiva de polifenóis algas e delinear o normal citotoxicidade celular, se for caso disso, foram examinados os efeitos destas fracções sobre a sobrevivência de células saudáveis. Para este MCF10A, células HIAE e HASMC tratados com 100 ug /ml de DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA ou HT-AE foram examinados após 24 h de alterações na proliferação de células. Fluorescência (480 nm de excitação e 520 nm de emissão) foi medida continuamente até 60 minutos. Em comparação com os controles não tratados, a análise CyQUANT NF não revelou nenhuma inibição significativa da sobrevivência das células em células MCF10A. Like-sábio, observou-se uma célula de sobrevivência consistente tanto em células HASMC e HIAE tratados com DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, PT-EA ou HT-EA implicando nenhuma citotoxicidade definitivo dessas frações em células normais.

polifenóis alga exerce a morte celular por apoptose em células PC

Para delinear se o potencial anti-PC de polifenóis de algas envolvem a morte celular por apoptose e para identificar a magnitude potencial de diferentes fracções caracterizadas, examinámos as alterações associadas na fragmentação de DNA. Desde que a avaliação da apoptose não pode ser invocado um único ponto final, utilizamos tanto /coloração laranja de acridina qualitativa brometo de etídio e semi-quantitativa fragmentação do DNA em gel de agarose em Panc-1, Panc 3,27, BxPC3 e células MiaPaCa-2. Em comparação com os controles não tratados, microscopia de fluorescência revelou que todas as frações de polifenóis ricos anti-oxidantes, incluindo DD-DCM, SA-DCM, SM-DCM, PT-DCM, HT-DCM, DD-EA, SA-EA, SM-EA, a PT -EA e HT-eA exibe características de apoptose (Fig. 4). Evidentemente, observou-se fragmentação de ADN grandezas diferenciais através de quatro linhas de células PC tratadas com estes polifenóis. Consistentemente, em comparação com os controlos não tratados, agaorse análise de fragmentação do ADN em gel mostrou estatisticamente significativa (P 0,05) da indução de fragmentação de ADN em Panc 1, Panc 3,27, BxPC-3 e MiaPaCa-2 células tratadas com polifenóis de algas, excepto para DD DCM (Fig. 5). Comparativamente, observou-se uma máxima ( 2 vezes) DNA efeito de todos os polifenóis de algas prejudiciais em Panc-1 e células Panc-3.27. Extensão da fragmentação do DNA causados ​​por esses polifenóis demonstra que as algas utilizam células-morte apoptótica em PC

Inserir:. Microfotografias alta ampliação mostrando cromatina com formação de bolhas, condensação nuclear, e fragmentação indicando características apoptóticos típicos em células tratadas com algas polifenóis.

amostras de DNA foram submetidas a electroforese em gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio e quantificada utilizando Quantidade-One.

polifenóis alga inibe a ativação funcional do NFkB

Além disso para investigar que os polifenóis algas induzida morte celular apoptótica envolve a inibição da pro-sobrevivência NFkB, examinámos a regulação do promotor de NFkB activação com estas fracções de DCM e eA em células PC. Para isso, as células Panc-1, BxPC-3 e MiaPaCa-2 humanos foram transitoriamente transfectadas com uma construção de plasmídeo pNFκB-Luc que expressa o gene repórter de luciferase de um modo dependente de NFkB. A ligação de NFkB para o promotor activa a transcrição, permitindo que o gene repórter Luc para ser expressa. As células transfectadas foram expostas a DCM e as fracções EA (individualmente), e o ensaio de repórter de luciferase foi realizada após 24 h. As células tratadas com DCM e as fracções algas polifenol EA resultou na inibição profunda da actividade de luciferase, indicando que estas fracções poderia especificamente aliviar a activação da transcrição de NFKB (Fig. 6). Embora encontramos diferenças marginais entre frações e entre linhas celulares, em geral, os dados retratos claramente uma notável redução da actividade da luciferase muito menor do que os níveis basais demonstrando o seu potencial na atenuação NFkB da transcrição.

As células foram então colhidas em 24 h pós-tratamento. Os dados mostrados representam média e desvio padrão (DP) de três experiências independentes. diminuição significativa na atividade de luciferase em polifenóis algas trataram células de PC.

polifenóis alga regular moléculas de progressão do tumor em células PC

Além disso, para dissecar o benefício de anti-oxidantes polifenóis ricos algas