Abstract

glicoconjugados de superfície celular apresentam alterações de suas estruturas em doenças crônicas e epítopos de oligossacarídeos diferentes têm sido associados com câncer. Entre eles, os glicanos truncados presentes (GlcNAc) resíduos terminais não redutores β-N-acetilglucosamina que são raros nos tecidos saudáveis. As lectinas a partir de fontes convencionais tais como fungos ou algi proporcionar novos marcadores que se ligam especificamente a tais epitopos, mas a sua disponibilidade pode ser um desafio. A lectina de ligação GlcNAc do corpo de frutificação do fungo

Psathyrella velutina

(PVL) foi produzido em bom rendimento em cultura bacteriana. Um forte especificidade para resíduos GlcNAc terminais foi evidenciado pela matriz de glicanos. valores de afinidade obtidas por ressonância microcalorimetria e superfície plasmon demonstrou uma afinidade micromolar para epitopos GlcNAcβ1-3Gal e para biantenais N-glicanos com filiais GlcNAcβ1-2Man tampado. estrutura cristalina do PVL complexado com GlcNAcβ1-3Gal estabeleceu a base estrutural da especificidade. Etiquetagem de vários tipos de células de cancro e o uso de inibidores de metabolismo de glicano indicou que se liga a rPVL GlcNAc terminal, mas também para o ácido siálico (Neu5Ac). Análise da expressão de glicosiltransferase que comprova a maior quantidade de GlcNAc presentes em células cancerosas. rPVL ligação é específica para tecido canceroso e fraca ou nenhuma rotulagem é observado para os saudáveis, exceto para as glândulas do estômago que apresentam mucinas apresentadoras αGlcNAc únicas. Em carcinomas pulmonares, mama e cólon, uma definição clara pôde ser observada entre as regiões de câncer e que cercam tecidos saudáveis. PVL é, portanto, uma ferramenta útil para a rotulagem agalacto-glicanos em câncer ou outras doenças

Citation:. Audfray A, Beldjoudi M, Breiman A, Hurbin A, Boos I, Unverzagt C, et al. (2015) A recombinante fúngica lectina para a rotulagem truncadas glicanos com células humanas cancerosas. PLoS ONE 10 (6): e0128190. doi: 10.1371 /journal.pone.0128190

Editor do Academic: Els JM van Damme, Universidade de Ghent, Bélgica

Recebido: 28 Janeiro, 2015; Aceito: 24 de abril de 2015; Publicação: 04 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Audfray et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. LPV /complexo ligando foi depositado no Protein Data Bank com o código de 4UP4

Financiamento:. Agence Natioale de la Recherche: concede NeoLect-11-BSV5 e ANR-11-LabX-003 (http: //www .agence-nationale-recherche.fr /). Cooperação Europeia em Ciência e Tecnologia: CM1102 Acção COST (https://www.cost.eu/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as alterações na glicosilação de superfície celular são conhecidos por estarem associados com um grande número de doenças crónicas e os glicanos de cancro representam um campo muito promissor para a descoberta de biomarcadores [1-3]. Correlação de inflamação ou metástases, com sobre-expressão de epítopos sialilados e fucosilados, tais como a sialil-Lewis x tem sido objecto de investigação intensiva. No entanto, noutros casos, o metabolismo muito activa e Divison de células cancerosas pode resultar na exposição anormal dos epítopos crípticos. Esta parte interna de glicoconjugados, que teria sido decorados por outros monossacarídeos em células normais, podem, por conseguinte, ser exposto na superfície da célula e tornar-se disponível para a detecção de anticorpos ou lectinas [4].

N-acetilglucosamina (GlcNAc ) é um resíduo de hidrato de carbono que está presente na parte interna de N-glicanos, tal como o núcleo quitobiose ligado ao resíduo asparagina e mais raramente como β1-4 ligado ao núcleo de manose em N-glicanos bissectados ramificada. GlcNAc também está presente nos ramos destas glicoconjugados, quer β1-2-ligada à manose (Man) sobre o núcleo de trimanose ou β1-3-ligado a galactose (Gal) como parte de polylactosamine ramos estendida (Fig 1A). No entanto, devido à actividade de galactosiltransferases e sialiltransferases, estes resíduos de GlcNAc não estão em posições terminais em tecidos normais. Da mesma forma glicoesfingolipídios conter GlcNAcβ1-3 ou β1-6 ligada a Gal, mas não em posições terminais expostos. Os epitopos são semelhantes em mucinas com Gal, ácido siálico (Neu5Ac) ou resíduos de fucose (Fuc) tampando os epítopos terminais. A única exceção é um epitopo rara que consiste em α1-4 ligados mucinas GlcNAc-encerrado a partir de células da mucosa glandular no estômago [5] (Fig 1A).

A. Exemplos de oligossacáridos normais e truncadas que podem ser encontrados em tecidos normais ou de cancro. Que codifica para a representação esquemática de monossacáridos está na parte inferior da figura. O heptasaccharide usadas em experiências de ligação está indicado como “hepta”. B. Síntese de 2 heptasaccharide azida correspondente ao oligossacárido “hepta” no painel A.

A ocorrência de epitopos de terminação βGlcNAc aberrantes foi observada num número limitado de tipos de cancro, incluindo células de leucemia humana [6 ]. IgGs com truncadas N-glicanos foram relatados no soro de pacientes com cancro da próstata [7]. Foram propostos mucinas alterados com motivos GlcNAc terminais para formar o epitopo Tk, um tumor de cólon antígeno associado [8]. A caracterização mais precisa das alterações de glicosilação com a exposição de GlcNAc interna foi realizada por análise de glycome carcinoma diferente, que aponta para a ocorrência de curtos truncadas N-glicanos terminados por GlcNAβ1-2Man em ambos antena e de GlcNAc-linear terminado e glicoesfingolípidos ramificada , em particular no carcinoma de células pequenas do pulmão e o adenocarcinoma, mas também no rim, carcinoma da mama e dos ovários [9] (Fig 1A).

lectinas, geralmente derivados de plantas, têm sido demonstrados ser muito eficiente para detectar glicosilação aberrante em amostras biológicas. Uma nova tecnologia é o uso de matrizes de lectina que pode conter lectinas com grande espectro de especificidade e, por conseguinte, caracterizar a variação da glicosilação [10]. A utilização de lectinas extraídos a partir de organismos naturais pode ser demorado e pode gerar problemas de contaminação ou variações entre os lotes. Portanto, a tecnologia de lectina recombinante está a começar a ser desenvolvidos [11]. Lectinas que são classicamente usados ​​para GlcNAc-ligação são extraídos de plantas como o trigo (WGA), tomate (SLT) e

Griffonia simplicifolia

(GSL-II). Uma nova lectina específica de GlcNAc-(PVL) foi purificada a partir dos corpos de frutificação e micélio de um fungo,

Psathyrella Velutina

[12] e, em seguida, caracterizada estruturalmente [13]. Uma proteína intimamente relacionada, lectina de cogumelo 2

Agrocybe aegerita

(AAL-2) foi clonado recentemente e demonstraram que ligam-se a células de hepatoma [14]. A estrutura PVL apresenta um romance dobra entre as lectinas, com sete beta-folhas dispostas em uma dobra β-hélice. Por conseguinte, a lectina adota uma forma de rosca com seis locais de ligação GlcNAc, e é esperado para apresentar forte avidez para superfícies de células que apresentam alta densidade de resíduos GlcNAc terminais.

O objetivo do presente trabalho foi produzir uma forma recombinante da LPV e para caracterizar a sua especificidade fina para os diferentes epitopos terminada-GlcNAc que podem estar presentes em formas truncadas relacionados com patologia de glicoconjugados humanos. A avidez da lectina de superfície GlcNAc-decorado foi avaliada em matrizes. Finalmente, também foi descrita a capacidade da lectina para marcar células cancerosas e tecidos de carcinoma.

Materiais e Métodos

material

GlcNAc foi adquirido de Sigma-Aldrich. Dissacárido GlcNAcβ1-3Gal, lacto-N-tetraose (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), lacto-N-triose (GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc) quitobiose (GlcNAcβ1-4GlcNAc), chitopentaose (GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc ) foram adquiridos de Elicityl (Crolles, França). Sialidase de

Clostridium perfringens

foi adquiridos de Sigma-Aldrich (ref. N2876) ou New England Biolabs (Ipswich, MA). SS-D-N-acetil-hexosaminidase

F de

Streptomyces plicatus

foi adquirido a partir de New England Biloabs. A lectina específica do ácido siálico marcado com biotina foi adquirido de MAH Vector Labs (Burlingame, CA):

Síntese de N-glicano 2

Nonasaccharide azida 1 (Figura 1B) foi preparado a partir de gema de ovo seguido por hidrólise enzimática e azidação [15, 16]. 5,1 mg (3,1 umol) de nonasaccharide 1 foram dissolvidos em 203 ul de tampão de fosfato (100 mM, pH 6,8, MgCl 1

2). 10 unidades de liofilizado β-galactosidase (EC 3.2.1.23) foram adicionados à solução. A mistura foi incubada a 37 ° C durante 3 dias (tlc: 2-propanol, 1 M acetato de amónio, 2: 1). Após a liofilização, o resíduo foi purificado por filtração em gel (Superdex 30, 1,6 x 60 cm de altura, 0,1 m NH

4HCO

3, 0,9 mL min

-1). O pico, eluindo a 86 min, foi liofilizado e dessalinizada por filtração em gel (Sephadex G-25, 2,5 x 15,5 cm, etanol a 5% em água, 0,6 mL min

-1). O pico eluindo a 75 min, foi liofilizado obtendo-se 2,9 mg (2,2 umol) de heptasaccharide 2 (70%). [Α]

D

22 = -9,0 (c = 0,5, H

2O). A pureza foi confirmada por 360 MHz

1H RMN em D

2O (S1 FIG)

1H-RMN (360 MHz, D

2O): δ = 5,03 (d,

J

1,2 1 Hz, 1H, H-1

4), 4,83 (d,

J

1,2 1 Hz, 1H, H- 1

4 ‘), 4,68-4,64 (m, 2H, H-1

1, H-1

3), 4,53 (d,

J

1,2 = 7,7 Hz, 1H, H-1

2), 4,47 (d,

J

1,2 = 8,3 Hz, 2H, H-1

5, H-1

5 ‘), 4,18-4,15 (m, 1H, H-2

3), 4,12-4,09 (m, 1H, H-2

4), 4,04-4,01 (m, 1H, H- 2

4 ‘), 1,99 (s, 3H, NAc), 1,97 (s, 9H, NAC). ESI-MS: m /z calculado para C

50H

83N

7O

35: 1341,49; encontrado 1342,62 (M + H)

+, 1365,86 (M + Na)

+

Produção de recombinante

PVL

Uma sequência de nucleótidos que codifica para a sequência peptídica de lectina de frutificação corpo de cogumelo

P

.

velutina

(GenBank, número de acesso DQ232759) [13] complementada na posição N-terminal com os aminoácidos MSVVVIS foi sintetizada após a otimização de codões para expressão em

Escherichia coli

(GenScript, Piscataway, NJ). Foi introduzido no vector de expressão pET25b utilizando locais de restrição Ndel e Xhol. O vector pET25-rPVL foi transformado em

E

.

coli BL21 (DE3) (Novagen), e as células que albergam o plasmídeo pET25-rPVL foram crescidas em caldo LB contendo 100 ug ml

-1 de ampicilina a 37 ° C até a A600 atingiu 0,7. As células foram então cultivadas durante 16 h depois da adição de 0,5 mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranosido. Após centrifugação (7000 x g durante 15 min), as bactérias foram ressuspensas em tampão de equilíbrio (20 mM Tris /HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM) e quebrado por disrupção celular a uma pressão de 1,7 kbar (Constant Systems Ltd). Após centrifugação (50000 x g, 30 min a 4 ° C) e filtração, a cromatografia de afinidade numa coluna de agarose-GlcNAc (laboratórios EY Inc.) Foi realizada no sobrenadante. rPVL foi deixada ligar-se a GlcNAc imobilizada em tampão de equilíbrio, e após a lavagem (20 mMTris /HCl a pH 7,5, NaCl 1 M), que foi eluida com 200 mM de GlcNAc livre em tampão de equilíbrio. A proteína purificada foi dialisada extensivamente contra água ultrapura durante 7 dias, liofilizado, e armazenado a 4 ° C.

matriz Glicano

rPVL purificada foram marcadas com Alexa Fluor 488 (Invitrogen) de acordo com a instruções do fabricante e purificado de novo numa coluna de dessalinização de poliacrilamida D-Sal (Pierce). Alexa marcado rPVL foi usado para matriz de glicanos triagem com o procedimento normal da proteína-glicanos Interação Núcleo (H) do Consórcio para Glycomics funcionais.

turno térmica análise

ensaios de desvio térmicas foram realizada utilizando um Mini Opticon, máquina de PCR em Tempo real (Bio-Rad Laboratories) com 0,5 mg ml

-1 de proteína diluída em NaCl 100 mM, Tris 20 mM, pH 7,5, 100 uM de CaCl

2, com ou sem oligossacárido num volume total de reacção de 25 uL. SYPRO Orange (Molecular Probes, CA) foi utilizado como uma sonda fluorescente detectada a 530 nm. A temperatura foi aumentada usando passos de 1 ° C /minuto desde 25 ° C a 100 ° C e leituras de fluorescência foram tomadas em cada intervalo. Um valor ΔTm positivo indica que o ligando estabiliza a proteína de desnaturação, e, portanto, se liga à proteína. Um mínimo de duas medições independentes foram realizados para cada condição

A microcalorimetria

rPVL recombinante liofilizado foi dissolvido em tampão (20 mM Tris /HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 100 uM de CaCl

2) e desgaseificada. A concentração de proteína foi verificada medindo A280 usando um coeficiente de extinção molar teórica de 65.890 M

-1 cm

-1. ligandos de hidratos de carbono foram dissolvidos no mesmo tampão, desgaseif içado, e carregado na seringa de injecção. ITC foi realizada com um microcalorímetro ITC200 (GE Healthcare). A solução rPVL foi colocada numa célula de amostra de 200 uL a 25 ° C. A titulação foi realizada com 20 injecções de 2 ul ligantes de carboidratos a cada 120 s. Os dados experimentais foram ajustados a uma curva de titulação teórica usando software Origin fornecido pela GE Healthcare, com AH (variação de entalpia), Ka (constante de associação) e N (número de sítios de ligação por monómero) como parâmetros ajustáveis. mudança de energia livre (ΔG) e entropia contribuições (TΔS) foram obtidos a partir da equação ΔG = AH – TΔS = -RT ln Ka (com T como a temperatura absoluta e R = 8,314 J mol

-1 K

– 1). Dois independentes titulações foram realizadas para cada ligando testado.

Superfície de ressonância de plasmão

Todas as experiências SPR foram efectuadas num instrumento Biacore X100 (GE Healthcare), a 25 ° C em HBS (Hepes 10 mM /NaOH, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05%) suplementado com 100 uM de CaCl

2 a uma taxa de fluxo de 30 min ul

-1. A ligação foi medida como unidades de ressonância ao longo do tempo, após subtracção do branco, e os dados foram, em seguida, avaliada utilizando o software de avaliação da Biacore X100, versão 2.0. As constantes de dissociação foram determinadas traçando a resposta no estado de equilíbrio (req, 10 s antes do fim da injecção) contra a concentração do analito. Para chip revestido com proteína, 3500 unidades de ressonância de rPVL (100 ug ml

-1, 10 mM de tampão de acetato de pH 6,2) foram imobilizados em canal de fluxo 2 de um chip CM5 de grau de pesquisa utilizando procedimentos de acoplamento de amina convencionais. canal de fluxo 1 foi ativado /desativado. As experiências consistem de injecção (360 s de associação, dissociação 400 s) de várias concentrações de oligossacáridos (2 diluições em cascata de dobragem, de 0 a 10