Abstract

sinalização aberrante Wnt está implicada em numerosos cancros humanos, e compreender os efeitos da modulação dos membros da via pode levar ao desenvolvimento de novas terapias. Expressão da proteína relacionada secretada frizzled 4 (SFRP4), um modulador extracelular da via de sinalização Wnt, é progressivamente perdidos em fenótipos de cancro do ovário mais agressivos. Aqui mostramos que SFRP4 recombinante tratamento (rSFRP4) de um serosas resultados linha celular de cancro do ovário na inibição da β-catenina sinalização Wnt dependente como medido pelo ensaio de repórter TOP /FOP Wnt e diminuição da transcrição de genes alvo Wnt, Axin2, CyclinD1 e Myc. Além disso, o tratamento rSFRP4 aumentou significativamente a capacidade das células de cancro do ovário a aderir a colagénio e fibronectina, e reduziu a sua capacidade para migrar através de uma ferida infligida. Conclui-se que estas alterações no comportamento celular pode ser mediada através mesenquimais para epiteliais de transição (TEM), como tratamento rSFRP4 também resultou num aumento da expressão do marcador de E-caderina epitelial, e redução da expressão de vimentina e torção. Combinados, estes resultados indicam que a modulação de um único gatekeeper a montante da via de sinalização Wnt pode ter efeitos sobre a sinalização de Wnt jusante e o comportamento das células do cancro do ovário, como mediada através dos revestimentos epiteliais mesenquimais de plasticidade (EMP). Isso levanta a possibilidade de que SFRP4 pode ser usado tanto para diagnóstico e terapêutico em câncer epitelial de ovário

Citation:. Ford CE, Jary E, Ma SSQ, Nixdorf S, Heinzelmann-Schwarz VA, Ward RL (2013) O Wnt gatekeeper SFRP4 modula EMT, migração celular e Downstream Wnt Sinalização em células câncer de ovário seroso. PLoS ONE 8 (1): e54362. doi: 10.1371 /journal.pone.0054362

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de julho de 2012; Aceito: 11 de dezembro de 2012; Publicação: 11 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ford et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado em parte por doações do cancro da Austrália Fundação Cure (# 1008633, CEF), Nacional de Saúde e Pesquisa médica do Conselho CJ Martin Fellowship (# 466005, CEF), Cancer Institute NSW (# 09 /CRF /2-02, VHS) , William Maxwell Trust (VHS) e do Royal Austrália e Nova Zelândia College de Obstetras e Ginecologistas (VHS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do ovário

epitelial tem a maior mortalidade de todos os cancros ginecológicos mulheres [1], [2]. Apesar dos recentes insights sobre a heterogeneidade desta doença [3] – [6], e um debate sobre a célula de origem [7], [8], a maioria dos pacientes com câncer ovariano epitelial receber o mesmo tratamento sistêmico (carboplatina, Paclitaxel [5] . Outras pesquisas sobre as vias moleculares subjacentes a esta doença é necessária, a fim de identificar novos tumorais marcadores e alvos para intervenção terapêutica Uma via que foi identificado como de importância potencial em cancro do ovário é a via de sinalização Wnt [9] -. [11 ].

a via de sinalização Wnt é um caminho de desenvolvimento cruciais envolvidos na diferenciação, polaridade, migração, invasão, adesão e sobrevivência [12]. Estes mesmos processos celulares são os principais componentes de tumorigénese e metástase, e daí o papel de sinalização Wnt no cancro humano está cada vez mais a ser investigada juntamente com estratégias terapêuticas para alvejar componentes da via. a desregulação da via de sinalização Wnt tem sido implicada em numerosos cancros, incluindo aqueles com elevada prevalência e /ou resultados pobres, tais como colo-rectal, da mama, do ovário, e cancro da próstata (revisto em [13]).

Esta rede de sinalização multifacetada é tradicionalmente simplificado dividindo a rede em canônica não-canônicos vias (β-catenina independentes) (dependente de β-catenina) e. sinalização Wnt canónica envolve a ligação do ligando a um Wnt de dez receptores Frizzled (FZD) na presença de uma proteína relacionada com o receptor de lipoproteína de baixa densidade do co-receptor (LRP). Isso gera uma cascata de eventos que levaram à desmontagem do complexo destruição Axin /APC /GSK3β ea estabilização da β-catenina. A acumulação de β-catenina nos resultados citoplasma em translocação para o núcleo e TCF /LEF activação mediada de genes alvo envolvidos na diferenciação e proliferação celular. alvos a jusante chave da sinalização Wnt canônica activado incluem C-myc (

MYC

), CyclinD1 (

CCND1

) e Axin2 (

AXIN2

) [12].

a via Wnt é regulado em vários níveis, com os antagonistas Wnt ou “proteínas gatekeeper” receberam atenção nos últimos anos, devido à sua inativação frequentes no câncer. Este grupo de moduladores Wnt inclui a família Dickkopf (DKK1-4), WIF-1 e da família de proteínas de receptor frizzled secretadas (SFRP1-5). SFRPs são proteínas extracelulares solúveis caracterizados pela sua frizzled-cisteína como domínio rico (CRD), que se pensa ser responsável pela sua capacidade de modular a sinalização de Wnt por ligação directa a ligandos ou receptores Frizzled Wnt. SFRPs foram mostrados para funcionar como supressores de tumores em outros tipos de cancro [14] – [17]. Nós mostramos anteriormente que um destes porteiros, SFRP4, é segregada na corrente sanguínea e progressivamente perdidos em fenótipos de cancro do ovário mais agressivos, tais como os cancros do tipo II [18]. Além disso, pacientes sem expressão SFRP4 tiveram um prognóstico pior do que aqueles que expressam SFRP4 [18].

epitelial para mesenquimal (EMT) é um processo-chave de desenvolvimento que as células cancerosas sequestram para aumentar a sua agressividade e invasiva potencial [19] . Apesar de tipo complexo e específico de célula, células submetidos a EMT pode geralmente ser caracterizado pela perda de E-caderina e ganho de vimentina, Twist and Snail. O processo de transição também pode ocorrer na direcção oposta (mesenquimais a transição epitelial (TEM).) Sabe-se agora que MET é de igual importância na organogénese e metástase, e que muitos estados de células intermediárias ou “metastável” existir como células de transição entre os dois extremos [20], [21]. Este processo dinâmico foi denominado epitelial à plasticidade mesenquimal, ou EMP. Muitas vias de sinalização têm sido associados a EMP, nomeadamente a TGF-β, Notch e as vias de Wnt.

No presente estudo investigamos os efeitos funcionais de modulação de um gatekeeper chave via Wnt, SFRP4 na sinalização Wnt, celular comportamento e EMT. Relatamos pela primeira vez que a re-expressão de SFRP4 em uma linha celular de cancro epitelial de ovário inibe a sinalização de Wnt, aumenta a adesão, inibe a migração celular e inibe EMT. Uma vez que a expressão SFRP4 tem sido mostrado para ser perdido em uma grande maioria dos pacientes com cancro do ovário [18], este levanta a possibilidade de que a modulação da sinalização Wnt através SFRP4 ou outros membros da via Wnt a montante pode representar uma nova via para a terapia-alvo no cancro do ovário.

Materiais e Métodos

cultura celular

células OVCAR3 Humanos serosas cancro do ovário, obtidas a partir de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) foram cultivadas em meio RPMI contendo 10% de soro fetal de vitelo. Os meios foram suplementados com penicilina /estreptomicina (90 unidades /ml de penicilina, e 90 ug /ml de estreptomicina) e 1,8 mM de GlutaMax (Life Technologies). Todas as células foram cultivadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2, a 37 ° C e foram demonstrados para ser livre de contaminação por micoplasma.

ensaios de repórter de Wnt

células OVCAR3 foram semeadas a uma concentração de 5000 células /cavidade em branco placas de 96 poços de fundo. As células foram privadas de soro durante a noite e co-transfectadas com 0,2 ug de ou (3 locais de ligação × TCF4) TOPflash ou FOPflash (3 × mutadas TCF4 locais de ligação) plasmídeos de expressão (Millipore, Temecula, CA, EUA), e 0,1 ug de pRL-TK (vector de Renilla-TK-luciferase, Promega) como um controlo, utilizando Lipofectamine2000. As células foram subsequentemente tratadas com doses crescentes de rSFRP4 e /ou Wnt3 recombinante um (rWnt3 um 0.1 ug /ml) durante 48 horas antes de as actividades da luciferase ser medidos utilizando um Glomax 96 Microplate Luminometer (Turner Biosystems Instrumento, Sunnyvale, CA, EUA). atividade luciferase Firefly foi normalizada para a eficiência de transfecção dividindo pela atividade luciferase Renilla. A razão para cima /FOP foi usado como uma medida de β-catenina transcrição dirigido. actividade média e os desvios padrão foram obtidos a partir de amostras octopulate transfectadas.

RCP-transcriptase reversa quantitativa (qPCR)

A seguir ao tratamento com DNAse, 1 ug de RNA total foi transcrito em ADNc utilizando o kit de RT Quantitect (Qiagen, Valencia, CA, EUA). Foram incluídos controlos contendo RNA, mas sem transcriptase reversa para todas as amostras. qPCR foi realizado em triplicado numa máquina Stratagene MXPRO 3005 P utilizando 25 ng de ADNc molde e SYBR Green /ROX master mix (Qiagen). Expressão foi normalizada para três diferentes genes de manutenção (SdhA, HSPCB, YWHZA) utilizando o método de normalização Vandesompele [22]

As sequências dos iniciadores utilizados para qPCR foram SFRP4:. A frente (F) 5 ‘TGTGTTACGAGTGGCG 3’, reverso ( R) 5 ‘GGGGGATTACTACGACTG 3’, CDH1: R F 5 ‘AGGCCAAGCAGCAGTACATT 3’ 5 ‘ATTCACATCCAGCACATCCA 3’, VIM F 5 ‘CCAAACTTTTCCTCCCTGAACC 3’ R 5 ‘GTGATGCTGAGAAGTTTCGTTGA 3’, torção F 5 ‘GCCAATCAGCCACTGAAAGG 3’ R 5 ‘TGTTCTTATAGTTCCTCTGATTGTTACCA 3’ , AXIN2 F 5 R 5 ‘TAGCCAGAACCTATGTGATAAGG 3’ ‘TCAAGTGCAAACTTTCGCCAACC 3’, MYC F 5 ‘CGTCTCCACACATCAGCACAA 3’, R 5 ‘CACTGTCCAACTTGACCCTCTTG 3’, CCND1 F 5 ‘GGCGGAGGAGAACAAACAGA 3’ R 5 ‘TGGCACAAGAGGCAACGA 3’, JNK F 3 5’TCTGGTATGATCCTTCTGAAGCA ‘R 5’ TCCTCCAAGTCCATAACTTCCTT, RHOA F 5 ‘GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT 3’ R 5 ‘GGCTGTCGATGGAAAAACACAT 3’, R RAC1 F 5 ‘TGTAGTCGCTTTGCCTATTGATG 3’ 5 ‘CATCGTCAGCACTAGCACAGTTT 3’, PRKCA F 5 ‘GCTTCCAGTGCCAAGTTTGC 3’ R 5 ‘CATCGTCAGCACTAGCACAGTTT 3’, SdhA F R 5 ‘CTTGAATGAGGCTGACTGTG 3’ 5 ‘ATCACATAAGCTGGTCCTGT 3’, R HSPCB F 5 ‘TCTGGGTATCGGAAAGCAAGCC 3’ 5 ‘GTGCACTTCCTCAGGCATCTTG 3’, YWHZA F 5 ‘ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA 3’ R 5 ‘CCGCCAGGACAAACCAGTAT 3’.

Western Blots

Os lisados ​​celulares foram preparados por células em tampão de lise (Tris-HCl 50 (pH 7,5), EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, lise 1% de Triton X-100, pirofosfato de sódio a 5 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, fluoreto de sódio 50 mM, 0,27 M de sacarose, 1 × inibidor de protease completo (Roche, Basileia, Suíça)). Os lisados ​​foram centrifugados e o sobrenadante foi recolhido para análise de concentração de proteína usando o kit BCA (Pierce, Rockford, IL, EUA). Os lisados ​​de proteínas nucleares foram preparados por células a lise em núcleos de tampão gelado (10 mM Tris, pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, EDTA 0,1 mM e 0,5% de NP-40, inibidores da protease) e incubou-se em gelo durante 10 minutos . Os núcleos foram recuperadas por centrifugação a 900g durante 3 minutos, lavadas em tampão Núcleos de lavagem (Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM e EDTA 0,1 mM contendo inibidores de protease) e ressuspensas em tampão de lise. As proteínas foram separadas utilizando SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF. Por Western blot, os anticorpos contra SFRP4 (ab32784, Abcam, Cambridge, MA, EUA), E-caderina (# 3195, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), Vimentin (# 5741, Cell Signaling Technology), Twist (# sc15393, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), β-catenina (# sc7963, Santa Cruz Biotechnology), histona H3 (# 9715s, sinalização celular) e α-tubulina (# 3873, Cell Signaling Technology) foram usadas. bandas de proteínas foram detectadas e quantificadas usando a imagem Quant LAS 4000 (GE Healthcare).

ensaios de migração

células OVCAR3 foram semeados em Ibidi Cultura-inserções (Ibidi GmbH, Am Klopferspitz 19, 82152 Martinsried , Alemanha) e foram tratadas durante 24 horas com rSFRP4 (5 ug /ml). Ibidi inserções foram removidas e o fecho do ferimento resultante foi monitorada durante as próximas 48 horas. Imagens da ferida foram capturadas em diferentes pontos no tempo, usando o sistema de microscópio Leica DMIL (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha).

ensaios de adesão

placas de cultura de tecidos foram revestidas com soluções de 10 ug /tipo I colágeno ml (Sigma, Castle Hill, Austrália), 5 ug /mL de fibronectina (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos) ou 3% de BSA em PBS e foram incubadas durante a noite a 37 ° C. As placas foram enxaguadas com etanol a 80%, incubadas em BSA a 3% em meio isento de soro durante 30 min a 37 ° C e lavadas novamente com PBS. As suspensões de células foram adicionadas às placas revestidas e deixadas a aderir durante 4 horas a 37 ° C. As placas foram suavemente lavadas com PBS, fixadas com etanol a 96% e coradas com violeta de cristal a 0,1%. Excesso de corante foi removido por extensivamente lavando pratos com água estéril. Depois de placas tinha secado, as células foram lisadas com ácido acético a 50% e a absorvância foi lida a 595 nm utilizando um SpectraMax Plus384 absorvância leitor de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA).

A análise estatística

Os resultados são expressos como média desvio ± padrão (SD). As estatísticas foram realizadas utilizando o teste t de Student de duas caudas. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, ***

P

. 0,001

Resultados e Discussão

SFRP4 inibe a sinalização Wnt em uma linha de células de câncer de ovário seroso

na sequência do nosso trabalho anterior, indicando que a perda SFRP4 foi um acontecimento frequente em câncer epitelial de ovário [18] determinou-se a adição de recombinante humana SFRP4 (rSFRP4)

in vitro

poderia inibir β-catenina sinalização Wnt dependente. Foi selecionado o serosa linha celular de cancro do ovário OVCAR3 para estas experiências, uma vez que não tem qualquer expressão SFRP4 detectável e foi previamente relatado para expor a sinalização de Wnt constitutiva (como é evidenciado pela acumulação /presença de β-catenina nuclear, [23]). A estimulação de células OVCAR3 com Wnt3a recombinante (rWnt3a) resultou num aumento significativo na β-catenina sinalização Wnt dependente como medido através TOP /FOP FLASH luciferase ensaio de repórter de Wnt (Figura 1A), confirmando que era de facto uma linha celular responsiva de Wnt. Em seguida, testou concentrações de rSFRP4 crescente, e descobriram que 5 ug /ml de rSFRP4 foi necessária para inibir significativamente β-catenina dependente de sinalização Wnt (Figura 1A). Esta concentração de rSFRP4 também foi mostrado para inibir os níveis de proteína de β-catenina no núcleo (Figura 1B). Esta concentração foi, em seguida, utilizado para todas as experiências subsequentes.

células OVCAR3 (A) foram co-transfectadas com pRL-TK (Renilla) e ambos os plasmídeos de expressão ou TOPflash FOPflash. As células foram subsequentemente tratadas com doses crescentes de rSFRP4 e /ou um recombinante Wnt3 (rWnt3a 0,1 ug /ml) durante 48 horas antes de serem actividades da luciferase medida utilizando um luminómetro de microplacas Glomax 96. actividade média e os desvios padrão foram obtidos a partir de amostras octopulate transfectadas. Os resultados representam a média de 3 experiências e as barras representam o desvio padrão (D.P.) da média. *

P Art 0,05. (B) imunoblots representativa mostrando aumento SFRP4 e diminuição da expressão da proteína β-catenina nuclear em células OVCAR3 seguinte de 72 horas de tratamento com rSFRP4 (5 ug /ml). expressão SFRP4 painel superior (SFRP4, ab32784, Abcam, Cambridge, UK), segundo painel α-tubulina expressão (α-tubulina # 3873, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, EUA), terceiro painel nuclear β-catenina (# sc7963, Santa Cruz Biotechnology), painel inferior histona H3 (# 9715s, Sinalização celular). (C) A análise densitométrica da expressão da proteína SFRP4 em 3 experiências separadas. As barras representam o D.P. da média. *

P Art 0,05. (D) SFRP4 Relativa expressão de ARN foi aumentada em células tratadas com OVCAR3 rSFRP4 (5 ug /ml) durante 48 horas. qRT-PCR foi realizado em triplicado e normalizadas para três diferentes genes de manutenção (SdhA, HSPCB, YWHZA). Os resultados representam uma média de 6 experiências. As barras representam o D.P. da média. *

P Art 0,05. (E) A expressão relativa de genes alvo β-catenina dependentes Wnt foi reduzida nas células tratadas com OVCAR3 rSFRP4 (5 ug /ml) durante 48 horas. qRT-PCR foi realizado em triplicado e normalizadas para três diferentes genes de manutenção (SdhA, HSPCB, YWHZA) expressão de AXIN2, myc e CCND1 foram reduzidos em rSFP4 células tratadas, em comparação com o grupo de controlo. Os resultados representam uma média de 4 experiências e as barras representam o D.P. da média. *

P Art 0,05. (F) A expressão relativa de genes alvo β-catenina independente Wnt foi inalterada em células OVCAR3 tratados com rSFRP4 (5 ug /ml) durante 48 horas. qRT-PCR foi realizado em triplicado e normalizadas para três diferentes genes de manutenção (SdhA, HSPCB, YWHZA) Expressão de JNK, RHOA, RAC1 e PRK2A ficaram inalterados em rSFP4 células tratadas em comparação com o grupo de controlo. Os resultados representam uma média de 3 experiências e as barras representam o DP da média.

Quarenta e oito horas após o tratamento com rSFRP4 (5 ug /ml) conduzem a um aumento de aproximadamente duas vezes em ARNm e proteína SFRP4 , como a adição de proteínas Wnt recombinantes extracelulares aumenta a produção de proteína endógena. (Figura 1B-D). A expressão dos três genes alvo a jusante de Wnt CyclinD1 (CCND1), C-myc (MYC) e Axin2 (AXIN2) diminuíram após o tratamento rSFRP4 (Figura 1E). No entanto, um desses 3 genes, única expressão AXIN2 foi significativamente reduzida (

P

= 0,03). Em contraste com CCND1 e MYC, AXIN2 é bem aceite como um gene específico para o alvo de Wnt, e até à data não tem sido associado a outras vias de sinalização [24] – [27]. O aumento da expressão AXIN2 foi relatada em todos os pacientes com câncer de ovário seroso em um estudo recente [10], indicando que a sinalização Wnt aberrante pode ser mais difundida em câncer epitelial de ovário do que se pensava. Ambos myc e CCND1 são conhecidos para funcionar em outras vias de sinalização cruciais implicados na carcinogénese do ovário [28] – [31], que pode explicar porque eles exibiram alterações de expressão mais fracos do que AXIN2 em resposta ao tratamento SFRP4. No entanto, é de notar que a adição de SFRP4 no nosso sistema era capaz de reduzir a transcrição dos três genes a jusante da via de sinalização Wnt, mas não teve efeito sobre alvos a jusante da via de sinalização Wnt independente β-catenina (Figura 1F), nem em um receptor a montante da via (FZD7) e três receptores independentes (EGFR, ErbB3, AKT, dados não mostrados).

em conjunto, estas experiências iniciais demonstram que a adição de um único modulador pode modular a via Wnt gene a transcrição de uma linha celular de cancro do ovário seroso modelo. Com base no ensaio de repórter TOP /FOP Wnt, Western Blot e Wnt resultados de genes alvo, os nossos dados também sugerem que, no caso de cancro do ovário, SFRP4 diz efectivamente funcionar como um antagonista da via de sinalização Wnt dependente canónico ou β-catenina. Parece também que SFRP4 não actua para inibir β-catenina independente sinalização Wnt, como quatro genes alvo não foi afectada pelo tratamento com SFRP4. Isto é de interesse, como é claro, no campo de sinalização Wnt exactamente quais os ligandos de Wnt são inibidas pela qual os membros específicos da família SFRP, e se, em alguns casos SFRPs pode realmente aumentar, em vez de inibir a sinalização Wnt [32] – [34 ].

SFRP4 tratamento diminuiu a migração e aumento da adesão de células de cancro do ovário

SFRP4 tratamento não teve qualquer efeito sobre a proliferação celular (Figura 2A), mas inibiu significativamente a capacidade das células OVCAR3 para migrar através de um ferida infligida (Figura 2B). Mostrou-se também que a adição de SFRP4 aumentaram a capacidade das células de cancro do ovário a aderir a colagénio e as placas de cultura de tecidos revestidas com fibronectina (Figura 2C). Estes dados sugerem que SFRP4 tem a capacidade de inibir o potencial metastático de células de cancro do ovário

in vitro

, que se encaixa com o relato nossos dados clínicos anteriores que os pacientes expressam SFRP4 teve sobrevida livre e global melhor progressão em comparação com aqueles SFRP4 falta expressão [18]. Acrescenta ao corpo crescente de evidências de que a via de sinalização Wnt podem desempenhar principalmente um papel na metástase do cancro em vez de iniciação do cancro.

(A) 24 horas rSFRP4 tratamento (5 ug /mL) não teve nenhum efeito sobre células proliferação, tal como medida através de contagem de azul de tripano de células usando o sistema condessa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Os resultados representam a média de 3 experiências e as barras representam o D.P. da média. (B) SFRP4 inibiu a migração de células. células OVCAR3 foram semeadas em Ibidi Cultura-inserções e tratou-se durante 24 horas com rSFRP4 (5 ug /ml). Ibidi inserções foram removidas e o fecho do ferimento resultante foi monitorada durante as próximas 24 horas. O experimento foi repetido três vezes e os resultados representam a percentagem média de ferida aberta e barras representam a DP **

P Art 0,01. (C) SFRP4 aumento da adesão ao colagénio e fibronectina. SFRP4 (5 ug /ml, 48 horas) as células tratadas foram deixadas a aderir durante 4 horas a 37 ° C, quer 10 ug /Tipo ml Eu colagénio ou 5 ug /mL de fibronectina, em seguida, lavadas, lisadas e a absorvância medida a 595 nm utilizando o SpectraMax Plus384 absorvância Microplate Reader. Os resultados representam a média de 6 experiências e as barras representam o D.P. da média. *

P

. 0,05

SFRP4 inibe EMT em células de cancro do ovário

Como as mudanças no comportamento celular estão ligados a EMT, também investigou se SFRP4 faria afetam a morfologia celular e a expressão da chave marcadores EMT, e-caderina (CDH1), vimentina (VIM), e TWIST1 (TWIST1). Enquanto não há alterações evidentes na morfologia celular foram observados 48 horas após o tratamento SFRP4 (Figura 3A), o tratamento com rSFRP4 aumentou a expressão de E-caderina (Figura 3B-D), e redução da expressão de vimentina e torção (Figura 3B-D) a tanto a nível da transcrição e tradução, sugestivo de início do MET.

(a) tratamento SFRP4 (5 mg /ml, 48 horas) não causaram quaisquer alterações óbvias para a morfologia das células da linha de células de cancro do ovário seroso , OVCAR3 (10 × ampliação). (B) de E-caderina (CDH1) expressão foi significativamente aumentada, e vimentina e torção diminuiu em SFRP4 (5 ug /ml, 48 horas) as células OVCAR3 tratados. qRT-PCR foi realizado em triplicado e normalizadas para três diferentes genes de manutenção (SdhA, HSPCB, YWHZA). Os resultados representam uma média de 6 experiências e as barras representam o D.P. da média. **

P Art 0,01, ***

P Art 0,001. (C) imunoblots representativa mostrando aumento CDH1, e diminuição do VIM e a expressão da proteína em células OVCAR3 TWIST1 seguinte de 72 horas de tratamento com rSFRP4 (5 ug /ml). expressão Painel superior CDH1 (# 3195, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA), expressão segundo painel VIM (# 5741, Cell Signaling Technology), expressão TWIST1 terceiro painel (# sc15393, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA ), e painel de fundo α-tubulina expressão (α-tubulina # 3873, Cell Sinalização Technology). (D) Análise densitométrica da CDH1, VIM e TWIST1 expressão da proteína em 3 experiências separadas. As barras representam o D.P. da média. **

P Art 0,01, *

P

. 0,05

EMT, como a via Wnt, é mais fortemente associado ao desenvolvimento, ainda recentemente tem recebido grande interesse no seu potencial como um alvo para terapia do câncer. generalizadas processos que ocorrem em todas as células cancerosas são uma via atractiva para a terapia do cancro, como tratamentos potenciais terá aplicabilidade generalizada. Além disso, a sinalização Wnt aberrante tem sido fortemente ligadas a cânceres com um mau prognóstico [12], [35], de modo ainda mais elucidação do papel desta via e seus gatekeepers naturais trará importantes insights sobre doenças humanas. Tem sido conhecido durante muitos anos que a sinalização de Wnt podem afectar a migração de células de cancro e de aderência, e este estudo proporciona alguma evidência de que estes efeitos podem ser dirigidos através do processo de EMT. Nossos resultados corroboram com um estudo recente que liga AXIN2 e EMT no cancro colorectal [27]. Além disso, é nossa hipótese de que SFRP4 inibe a capacidade de ligandos específicos Wnt para se ligar a receptores Frizzled. Com base em dois estudos anteriores, uma indicando que Wnt7a é overexpressed no cancro do ovário [11], e um sugerindo SFRP4 pode inibir Wnt7a ligação a Fzd5 no câncer de endométrio [36], especula-se que sob vínculos normais condições SFRP4 e sequestra afastado Wnt7a. No entanto, em câncer epitelial de ovário, SFRP4 é silenciado, permitindo Wnt7a para ligar Fzd5 e ativar β-catenina sinalização Wnt dependente, e dirigir TCF /LEF transcrição mediada de genes repórter de Wnt como AXIN2, MYC e CCND1.

A via de sinalização Wnt é uma via altamente complexo e interligado associada a muitas doenças humanas. Como o percurso é principalmente envolvidos na embriogénese e reparação dos tecidos adultos, medicamentos direccionados para esta via não são esperados para causar efeitos secundários significativos ou toxicidade [37]. No entanto, as tentativas para atingir a via de sinalização Wnt no câncer têm falhado, sem drogas clinicamente aprovados até à data. Isto pode ser devido à selecção de alvos de drogas que residem mais a jusante na via de sinalização Wnt (recentemente revisto em [38]). Numerosos estudos têm relatado a inactivação de componentes a montante da via Wnt no cancro, incluindo membros da SFRP e famílias DKK, indicando um papel chave para estas proteínas gatekeeper na oncogénese [14] – [17], [34], [39] . Estas proteínas extracelulares também têm forte potencial como alvos de drogas devido à sua posição a montante na via. Este trabalho mostra o potencial da modulação via a montante utilizando um único antagonista Wnt. Como existem pelo menos dez antagonistas extracelulares da via Wnt actualmente identificados, combinações destes podem produzir efeitos ainda mais fortes [40] e é digno de uma maior exploração.