Abstract

Fundo

cancro da bexiga urinária é muitas vezes resultado de exposição a agentes cancerígenos químicos, tais como o tabagismo . Por causa da semelhança histológica, o modelo de câncer de roedores induzido quimicamente foi largamente utilizado para estudos de câncer de bexiga humanos. Investigações anteriores sugeriram que a nicotinamida, vitamina B3 solúvel em água, pode desempenhar um papel fundamental na prevenção do câncer através das suas actividades de reparação celular. No entanto, até à data, não foram apresentadas provas no sentido de identificar as alterações genéticas de nicotinamida na prevenção do câncer. Aqui, nós procurar as assinaturas moleculares de prevenção do câncer de nicotinamida usando um N-butil-N- (4-hidroxibutil) -nitrosamine (BBN) induzida por urinária modelo de cancro da bexiga em ratos.

Metodologia /PRINCIPAIS CONCLUSÕES

Via microarray perfil de expressão gênica de 20 ratos e 233 amostras de bexiga humanos, realizamos várias análises estatísticas e coloração imuno-histoquímica para validação. Os padrões de 893 genes associados com a actividade de nicotinamida na prevenção do cancro de expressão foram identificados através de análise de dados de microarray. Gene analisa rede desses 893 genes revelou que o

Myc

e seus genes associados podem ser o regulador mais importante de prevenção do câncer de bexiga, e com a assinatura de expressão gênica bem correlacionados com dados de expressão de proteína. Comparação da expressão de genes entre o ser humano e rato revelou que a BBN-induzidos cancros da bexiga do rato exibiram perfis de expressão de genes que eram mais semelhantes às de cancros da bexiga humanos invasivos do que para as de não-invasivos cancros da bexiga humanos.

Conclusões /significado

Este estudo demonstra que a nicotinamida desempenha um papel importante como um agente de quimio-preventiva e terapêutica no cancro da bexiga através da regulação da

Myc

assinatura oncogênico. Nicotinamida pode representar uma modalidade terapêutica promissora em pacientes com câncer de bexiga músculo-invasivo

Citation:. Kim SK, Yun SJ, Kim J, Lee JO, Bae SC, Kim WJ (2011) Identificação do Gene Expression Assinatura Modulada por nicotinamida em um modelo de cancro da bexiga do rato. PLoS ONE 6 (10): e26131. doi: 10.1371 /journal.pone.0026131

editor: Ilya Ulasov, da Universidade de Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de junho de 2011; Aceito: 20 de setembro de 2011; Publicação: 10 de outubro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Kim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Programa de Pesquisa em Ciência básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2011-0.001.042 e R16-2003-002-01001-02006). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Muitos cancros da bexiga pode ser ligada a carcinogéneos químicos, e em populações ocidentais aproximadamente um terço a um meio de cancros da bexiga são associados com o consumo de cigarros [1], [2]. Embora a substância causal no fumo do cigarro não tenha ainda sido identificada, α- e β-naftilamina são agentes suspeitos. Como agentes cancerígenos putativos para o cancro da bexiga, aminas aromáticas, tais como β-naftilamina, 4-aminobifenilo, benzidina, e 2-amino-1-naftol pode ser responsável por até 20 a 30% dos casos de cancro da bexiga [3], [4]. Existem dois modelos induzida quimicamente primárias de cancro da bexiga urinária em roedores, que são induzidas pela administração de N-butil-N- (4-hidroxibutil) -nitrosamine (BBN) tanto em ratinhos ou ratos [5], [6]. Os tumores resultantes são histologicamente semelhantes aos da doença humana, e são manifestados através de duas vias diferentes cancerígenos; nomeadamente, o cancro não-invasiva do músculo da bexiga (NMIBC) em ratos e músculo-invasiva do cancro da bexiga (MIBC) em ratinhos [7], [8]. Como o câncer de bexiga humana é muitas vezes resultado de exposição a agentes cancerígenos químicos, estes modelos de roedores são úteis para a compreensão de cancro da bexiga humana. Williams et al ilustrou os perfis globais de expressão de genes de tumores de roedores e forneceu uma lista de genes que são candidatos prováveis ​​para impulsionar o desenvolvimento e progressão do cancro da bexiga [9].

O ácido nicotínico é uma vitamina solúvel em água pertencente ao família da vitamina B. Pode ser encontrada em muitos tecidos de animais e plantas, e tem actividade anti-hiperlipidémico. No organismo, o ácido nicotínico é convertido na sua forma activa de nicotinamida, que é um componente do dinucleótido nicotinamida adenina coenzimas (NAD) e a sua forma de fosfato, NADP. Estes co-enzimas desempenham um papel importante na respiração dos tecidos e em glicogénio, lípidos, aminoácidos, proteínas, e do metabolismo de purina. A pesquisa atual sugere que a nicotinamida, ou vitamina B3, pode desempenhar um papel fundamental na prevenção do câncer através das suas actividades de reparação celular. Principais cientistas que estudam nutrição nicotinamida acreditam que a vitamina mostra a promessa para o tratamento e até mesmo prevenir o câncer. Myron et ai demonstraram que as células desprovidas de nicotinamida desenvolver cancro dez vezes mais rapidamente do que aqueles que receberam quantidades suficientes da vitamina [10]. A dieta é um fator importante na incidência de cancro da bexiga, com ambas as componentes benéficos e prejudiciais, e nicotinamida é um dos componentes benéficos. Embora a dose óptima de nicotinamida é ainda indeterminado, nicotinamida também um adjuvante promissora à quimioterapia por causa da sua relação com a de necrose tumoral (matando) Factor, um factor relativamente nova que mata selectivamente as células cancerosas [11], [12], [13] . No presente estudo, buscou-se identificar as assinaturas genéticas de nicotinamida na prevenção do câncer utilizando um modelo de cancro da bexiga do rato induzida por BBN, e investigou a potencial eficácia do tratamento nicotinamida em doentes com cancro da bexiga.

Materiais e Métodos

amostras de tecido mouse

os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Comissão Institucional dos cuidados animais da Universidade Nacional de Chungbuk (números de licenciamento: CBNUA-030-0901-02). C3H /He ratinhos fêmea foram obtidos a partir de Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japão) com 6 semanas de idade e foram alojados em gaiolas (cinco por gaiola). Os animais foram mantidos numa sala iluminada durante 12 horas cada dia, mantida a 23 ± 2 ° C e 55% ± 5% de humidade. BBN foi obtido a partir de Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd. (Tóquio, Japão), e nicotinamida foi adquirido de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). BBN foi diluída com água da torneira a uma concentração final de 0,05%. Para a análise dos efeitos preventivos da nicotinamida, água de beber foi suplementada com 0,1%, 0,25%, 0,5%, ou 1% de nicotinamida com ou sem 0,05% BBN durante 20 semanas. Todos os ratinhos receberam o primeiro tratamento com 7 semanas de idade, e foram sacrificados às 20 semanas após o primeiro tratamento. Na necropsia, as bexigas urinárias dos ratos foram inflados com solução salina normal e, em seguida, removido, e sob uma luz de alta intensidade foram examinados para alterações macroscópicas. Após a inspeção, todas as bexigas foram congelados para exame histopatológico e ensaios moleculares subsequentes. Uma parte de cada tecido foi fixada e processada para inclusão em parafina rotina, cortado em secções de 5 mícrons, e montado para hematoxilina e eosina para histopatologia. tumores de bexiga foram classificados em NMIBC e MIBC com base na extensão da invasão no músculo.

extração de RNA, microarrays experimentos e processamento de dados

O RNA total foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Life Technologies, NY), de acordo com o protocolo do fabricante. A qualidade e a integridade do RNA foram confirmados por electroforese em gel e coloração com brometo de etídio de agarose, seguida por exame visual sob luz ultravioleta. Cinco cem nanogramas de ARN total foram utilizadas para marcação e hibridação, de acordo com os protocolos do fabricante (Ilumina-Rato 6 BeadChips, versão 1.0). As matrizes foram digitalizados com um digitalizador de matriz leitor confocal Ilumina grânulo (BeadStation 500GXDW; Illumina, Inc., San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Após a digitalização, os dados de microarranjos foram filtrados por detecção de

P

-valor (

P Art 0,05), que foi fornecido pela Genome Estúdio

TM software (Illumina, Inc., San Diego , CA) e foram normalizados utilizando a normalização quantil na linguagem de R (versão 2.10.0, disponível em https://www.r-project.org/). valores de expressão de genes medidos foram LOG2 transformado e mediana centrada através genes e amostras. O conjunto de dados microarray completo está disponível no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) base de dados pública com o número de série de dados GSE21636. Todos os dados microarray é informação mínima sobre um experimento Microarray (Miame) compatível.

bexiga humana microarrays câncer

Para análise comparativa das mouse e câncer humano, foi utilizado um dados publicados anteriormente conjunto de bexiga humana microarrays câncer (coorte coreano), GSE13507, a partir do banco de dados público NCBI GEO [14]. O conjunto de dados consistiu em 165 amostras de bexiga primária de câncer (103 NMIBCs e 62 MIBCs), 58 amostras de tecidos circundantes aparência normal histologicamente, e 10 mucosa normal da bexiga de pacientes com doenças benignas. Estes dados de expressão de genes foram construídos em Illumina HumanWG-6 BeadChips (versão 2). Para uma validação adicional, nós também utilizado outro conjunto de dados câncer de bexiga humana (coorte espanhol, Affymetrix U133A GeneChip), que consistia em 24 NMIBCs, 66 MIBCs, e 38 mucosa da bexiga normais [15].

reversa em tempo real transcriptase polimerase reacção em cadeia (RT-PCR), análise

RT-PCR foi realizada utilizando um sistema de PCR Rotor Gene 6000 (Corbett Research, Mortlake, Austrália). reações de RT-PCR em tubos de micro-reação (Corbett Research) continha primers e SYBR Premix EX Taq (Takara Bio Inc., Otsu, Japão). Os dados espectrais foram capturadas e analisadas utilizando Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0 Build 14 (Corbett Research). a expressão do gene foi normalizado para

GAPDH

expressão.

imuno análise

coloração imuno-histoquímica foi realizada em, espécimes embebidos em parafina fixadas em formalina de rato normal e de tumor bexigas. As secções foram incubadas com os anticorpos primários anti-Myc (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) e anti-PMP22 (Abcam, Reino Unido). Para a coloração automatizado, Autostainer XT referência (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) foi usado. Após a coloração, foi avaliada tanto a intensidade de coloração e a proporção de células epiteliais coradas. intensidade da coloração foi classificada como segue: 1, fraco; 2, moderada; e 3, forte. A proporção de células positivas foi expresso como uma percentagem do número total de células epiteliais examinados, e atribuído a uma das cinco categorias: 0, 5%; 1, 5-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; e 4, 75%. Pontuações para a percentagem de células positivas e intensidade de coloração foram multiplicados em conjunto para produzir a pontuação imunorreatividade (IS) para cada espécime. O IS de Myc e PMP22 foi medida no núcleo e no citoplasma, respectivamente. Cada espécime foi examinado e marcou separadamente por três investigadores, e as pontuações discrepantes foram discutidas até que o acordo foi alcançado.

Western blot análise

Depois de enxaguar em água destilada, amostras em tubo de vidro contendo 1 ml de tampão de lise das células, foram mecanicamente homogeneizados com um homogeneizador de tecidos. O homogeneizado foi transferido para um tubo de 1,5 ml e foram centrifugadas a 14000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. A fase aquosa superior foi rejeitado e misturado com 2UL de fluoreto de fenilmetilsulfonilo e 200 ul de tampão de análise de proteínas. Após incubação durante 1 hora a 4 ° C, as amostras foram centrifugadas a 14000 rpm durante 30 minutos a 4 ° C. A fase aquosa superior foi transferida para um novo tubo e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. As concentrações de proteína foram determinadas pelo ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Cada amostra (70 ug) foi carregado em 10% (peso por volume) O gel de sulfato de dodecilo de sódio e transferida para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (GE Healthcare, San Antonio, TX). Western blot foram analisadas com anticorpos contra PMP22 (Abcam, Cambridge, UK) e Myc (LifeSpan BioSciences, Seattle, WA).

A análise estatística

Para comparar as características moleculares entre diferentes grupos de rato, foi realizada uma análise de agrupamento hierárquico. Um algoritmo de agrupamento hierárquico, utilizando o coeficiente de correlação centrada como a medida de similaridade e agrupamento médio de ligação, foi aplicada conforme descrito no Eisen et al [16]. Foram identificados genes que foram diferencialmente expressos entre os dois grupos usando um random-variância de duas amostras teste t [17]. Genes foram considerados como tendo diferenças estatisticamente significativas na expressão se o P-valor foi inferior a 0,001. Nós também realizado um teste global se os perfis de expressão difere entre as classes através da realização de permutações. Para cada permutação,

P

-Valores foram re-calculado eo número de genes significativos ao nível de 0,001 foi anotada. A proporção de permutações que resultaram em, pelo menos, como muitos genes significativos como os dados reais foi tomado como o nível de significância do teste global. Enquanto a obtenção de genes diferencialmente expressão, foram selecionados genes que tiveram uma dobra 1.2 ou mais diferença de valores médios de dois grupos de expressão.

Para explorar as relações entre genes tumorigênicos que responderam a nicotinamida, examinamos as associações funcionais entre os genes e redes de genes gerados com base em se eles tinham genes mais interligados do que seria esperado para ocorrer por acaso. O significado de cada rede foi estimada utilizando o sistema de pontuação fornecido pela Pathway Analysis Tool Ingenuity (versão 7.5). As pontuações foram determinados pelo número de genes diferencialmente expressos em cada uma das redes e da força das associações entre os membros da rede.

Como meio de comparação de padrões de expressão gênica entre amostras humanas e de rato, os dados microarray de rato modelos foram reunidas com o conjunto de dados de cancros da bexiga humanos utilizando HomoloGene (NCBI), um sistema para a detecção dos genes homólogos em vários genomas eucarióticos [18]. Antes de integração dos dois conjuntos de dados, os níveis de cada gene em cada conjunto de dados de expressão foram padronizados de forma independente, para uma média de zero e um desvio padrão de 1. Para prever modelos de ratinho contra tecidos humanos, foram aplicados quatro modelos de previsão diferentes: Composto predictor covariável [19], análise discriminante linear [20], mais próximo de classificação centróide [20], e de apoio máquinas de vetores [21]. Os modelos incorporados genes que foram diferencialmente expressos entre as duas classes utilizando uma de duas amostras do teste t. Genes foram considerados como tendo diferenças estatisticamente significativas na expressão se o

P

-valor foi inferior a 0,001. Estimou-se o erro de predição de cada modelo usando leave-one-out validação cruzada (LOOCV), como descrito por Simon et ai [22]. Para cada conjunto de treinamento LOOCV, o processo de construção do modelo inteira foi repetido, incluindo o processo de seleção genética. procedimento de previsão entre espécies foi realizado em BRB ArrayTools (versão 3.8.0).

Resultados

A eficácia de nicotinamida como um agente protetor contra o câncer do mouse bexiga induzidas BBN

para investigar o efeito da nicotinamida sobre a formação de tumor no modelo de cancro da bexiga induzida por BBN, os ratinhos receberam 0,05% BBN ou BBN sozinho mais concentrações de nicotinamida aumento na sua água potável durante 20 semanas (Figura 1A). Notavelmente, a suplementação de nicotinamida inibiram a formação de tumores. A suplementação com 0,5% nicotinamida reduzida a razão de formação de tumor a partir de 100% a 74%, e 1% de nicotinamida reduzida a proporção ainda mais, para 52% (Figura 1B). A análise histológica de tumores da bexiga dos vários grupos de tratamento revelou que o desenvolvimento de MIBC foi marcadamente inibida pelo nicotinamida. O tratamento com 0,1% nicotinamida reduzida a incidência de MIBC 88-42%, e 1% de nicotinamida reduzida ainda mais, para 12% (Figura 1B), o que indicava que a nicotinamida inibe fortemente a progressão do tumor da bexiga. O volume do tumor foi também notavelmente reduzido em nicotinamida. A maioria dos camundongos tratados com BBN desenvolveu tumores grandes (tamanho médio, 129 mm

3). Aumentando o tratamento de nicotinamida reduzida de forma significativa o tamanho médio do tumor (99 a 18 mm

3 quando 0,1 a 1% foram tratados nicotinamida, Figura 1C). Estes resultados demonstraram que a nicotinamida impede efectivamente a formação de tumor e suprime o crescimento de tumores e para a progressão de MIBC.

(A) Protocolo experimental para a análise dos efeitos preventivos da NC. Os ratinhos foram tratados com BBN sozinho ou em combinação com as quantidades indicadas de NC para 20 semanas. “N” indica o número de ratos em cada grupo. Uma dose de 0,1% na água de beber NC é aproximadamente equivalente a 100 mg /kg /dia. (B) Síntese da incidência da formação do tumor, não-muscular cancro da bexiga invasivo (NMIBC), e cancro da bexiga invasivo do músculo (MIBC) para cada grupo de tratamento. O número sobre cada barra indica o número de ratinhos em cada categoria histológica. (C) O gráfico de caixa comparando os volumes dos tumores dos grupos de tratamento. O

P

-Valores foram obtidos por duas amostragens testes t entre G1 grupo e outros grupos.

Padrões de expressão

gene diferencial entre os grupos experimentais

Para caracterizar a padrões de nicotinamida na prevenção do câncer de expressão gênica, vamos selecionar aleatoriamente 20 bexigas de rato e realizou um perfil de expressão gênica; cinco tumores do rato da bexiga induzidas BBN (MIBCs do Grupo G1, Figura 1A), cinco bexigas não tendo a tumores tratados com BBN e nicotinamida (amostras normais do Grupo G5, Figura 1A), cinco bexigas normais tratados com 1% de nicotinamida (Grupo G6 na Figura 1A), e cinco bexigas normais sem tratamento (grupo G7 na Figura 1A). As amostras de 5 em cada grupo foram histologicamente idênticos uns aos outros. Nós aplicada pela primeira vez a análise de agrupamento hierárquico dos padrões de expressão gênica para avaliar as características moleculares dos diferentes grupos experimentais. Como esperado, a análise de agrupamento hierárquico de dados de expressão de genes a partir de todos os tecidos resultou em três grupos principais, um que representa o grupo normal da bexiga, uma segunda representando o grupo de ratinho de tumor da bexiga induzida por BBN, e uma terceira representando o BBN + não-tumorigénico tratou-nicotinamida grupo bexiga (Figura S1). Assim, padrões de expressão gênica refletem a configuração molecular são facilmente distinguíveis entre tumores da bexiga e tecidos não-tumorais.

A seguir, teve como objetivo identificar conjuntos de genes que foram diferencialmente expressos entre os três grupos diferentes. Antes da análise, bexigas normais tratados com nicotinamida foram excluídos, uma vez que não houve histopatológico ou diferenças moleculares entre bexiga normal e tratados-nicotinamida (Figura S1). Nós aplicamos Venn comparação diagrama de duas listas de genes para selecionar os padrões de expressão de genes comuns a carcinogênese e prevenção do câncer. Primeiramente, foram gerados dois listas de genes diferentes, aplicando o teste t de duas amostras (Figura 2A,

P

0,001). lista Gene A representa os genes que foram diferencialmente expressos entre a bexiga normal e grupos de tumores induzidos por BBN, e lista de gene B representa os genes que foram diferencialmente expressos entre o BBN- e grupos tratados com nicotinamida BBN +. Ao comparar as duas listas de genes, observaram-se três padrões diferentes: A, não B (3.344 genes), A e B (893 genes), e B não um (1.115 genes) (Figura 2B). Os genes na categoria A, não B apresentaram padrões de expressão específicos de tumores induzidos por BBN, enquanto os genes da B Uma categoria não exibiu os padrões de genes que responderam a nicotinamida expressão. Genes na categoria A e B exibiram tanto BBN-induzida tumorigénico, bem como padrões de expressão de nicotinamida-responsivo. Estes resultados significava que 893 genes na categoria A e B eram comuns a ambos carcinogênese induzida pela BBN e à prevenção do câncer induzido por nicotinamida.

(A) diagrama de Venn de genes selecionados por t de duas amostras-teste o modelo de mouse. O círculo roxo (gene da lista A) representa genes expressos diferencialmente entre os tecidos normais da bexiga e N-butil-N- (4-hidroxibutil) -nitrosamine (BBN) induzidas por tumores da bexiga. O círculo azul (gene lista B) representa genes diferencialmente expressos entre os tumores de bexiga induzidas BBN e BBN + nicotinamida (NC) tratados tecidos não-tumorais. Foi aplicado um cut-off

P

-valor de menos de 0,001 para selecionar genes cuja expressão foi significativamente diferente entre os dois grupos. padrões (B) a expressão de genes seleccionados do diagrama de Venn. Entre os genes em uma categoria não B, 1.525 genes (45,6%) apresentaram up-down padrões e 1.819 genes (54,4%) apresentaram padrões para baixo-up no cancro normal e induzida por BBN. Na categoria A e B, 290 genes (32,5%) e 603 genes (67,5%) representaram os padrões de baixo-up-down e up-to para baixo até padrões, respectivamente, em normal, câncer BBN-induzido, e BBN + NC- grupos da bexiga tratados. No B não uma categoria, 606 genes (54,3%) exibida para baixo-up padrões e 509 genes (45,7%) apresentaram padrões de up-down no cancro induzido por BBN e grupos de bexiga tratados com NC BBN +. Os dados são apresentados no formato de matriz em que as linhas representam genes individuais e colunas representam cada tecido. As cores vermelhas e verdes refletem os níveis de expressão de alto e baixo, respectivamente.

visão biológica para os padrões de expressão genética para a prevenção do câncer

Para identificar as redes de sinalização predominante ativos na prevenção de câncer de bexiga por nicotinamida, análise de rede gene dos 893 genes na assinatura prevenção do câncer (Figura 2) foi realizada utilizando software Ingenuity

TM Pathways Analysis. Dos 893 genes, 477 foram mapeados para redes de genes definidos por esta ferramenta. Esta análise revelou uma série de redes putativos e categorias funcionais associadas. As redes 10 putativos com as pontuações mais altas estão listados na Tabela S1 e suas funções associadas são ilustradas na Figura S2

.

Como esperado, os genes envolvidos em funções relacionadas com a carcinogénese, tais como o crescimento e proliferação celular, cancro, morte celular e DNA-replicação e -consertos foram enriquecidos, proporcionando confiança nos nossos resultados. Nós também descobrimos que os genes envolvidos na resposta inflamatória, a resposta imune mediada por células, em doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doença imunológica e também estavam presentes em números significativos. Curiosamente, uma abundância significativa de genes envolvidos no desenvolvimento do sistema esquelético /muscular e distúrbios foi observado (Figura S2).

Exame dos genes enriquecidos revelou várias redes de sinalização importantes (Tabela S1), o mais impressionante de que mostrou ativação predominante do

Myc

, uma das assinaturas oncogênicos (Figura 3).

Myc

formado o eixo principal da rede de genes, com a maior conectividade para o resto dos genes na rede, o que sugere que

Myc

poderia ser um factor crítico na molecular tanto carcinogénese induzida pela BBN e prevenção do câncer induzido por nicotinamida. Muitos dos genes de satélite ligados ao

Myc

(ou seja,

MSH6

[

MSH6

],

MetAP2

[

MetAP2

] ,

LMNB1

[

Lmnb1

],

hK2

[

hK2

],

PPAT

[

Ppat

],

PGK1

[

PGK1

],

CCT2

[

Cct2

], e

PMP22

[

PMP22

]) (Figura 3) participar na tumorigénese, a proliferação celular, crescimento celular, ou apoptose, que correspondem com as actividades mais conhecidos de

Myc. Estas descobertas indicam fortemente que a função oncogénica do

Myc

e seus genes associados pode ser regulamentada por tratamento nicotinamida para prevenir carcinogênese da bexiga.

cima e para baixo-regulados genes nos cancros do mouse bexiga são indicado em vermelho e verde, respectivamente. A intensidade da cor é indicativa do grau de expressão sub-super ou. Os genes sem cor realçada não são parte da assinatura progressão mas estão associadas com os genes regulados. Cada linha e flecha representa interações físicas e funcionais entre os genes e a direção da regulação relatados na literatura.

Validação do

Myc

assinatura para a prevenção do câncer de nicotinamida

para validar a nossa assinatura a expressão do gene recém-identificado para a prevenção do cancro por nicotinamida, nós adicionalmente realizadas análises de expressão de genes e proteínas expressão. Entre os genes de

Myc

assinatura identificado por análise de rede de genes (Figura 3),

Myc

como um oncogene e eixo principal

PMP22

como um gene de supressão de tumor que tem a mais forte intensidade de sinal foram escolhidos para validação, e os resultados são apresentados na Tabela 1 e na Figura 4.

-transcriptase reversa em tempo real da reacção em cadeia da polimerase análise (RT-PCR) foi realizada durante

Myc

(A) e

PMP22

(B). Diferenças (

P valores

) entre os grupos de rato foram obtidos por t de duas amostras-teste. O eixo dos y indica (razão de expressão de cada gene /

GAPDH

) × 1,000. A análise imuno-histoquímica de Myc (C) e PMP22 (D) foi realizada para confirmar os níveis de expressão de proteína. Detecção de Myc (E) e a expressão da proteína de PMP22 (F) foi também determinada por análise de transferência de Western. A análise da expressão do gene

primeiramente realizada por RT-PCR. Os níveis de expressão

Myc

no grupo cancro da bexiga induzida por BBN foram significativamente maiores do que o normal ou BBN + grupos tratados com nicotinamida (

P Art 0,001 e P = 0,02 por dois t- amostra teste, respectivamente, A Figura 4, A). Por outro lado, os níveis de expressão

PMP22

no grupo de cancro da bexiga induzida por BBN foram significativamente diminuída em comparação com o normal ou BBN grupos tratados +-nicotinamida (

P

= 0,02 e P = 0,03 por duas amostras teste-t, respectivamente, a Figura 4, B).

Para determinar se a expressão do gene assinatura foram identificados de acordo com os níveis de expressão de proteína, análise imuno-histoquímica foi levada a cabo. Observou-se que Myc foi altamente expressa no citoplasma de células de rato urotélio normais, mas não foi expresso no núcleo. Myc foi localizada principalmente para o núcleo das células tumorais no tumor da bexiga do rato induzida por BBN. Tanto um nuclear e uma distribuição citoplasmática de Myc foi observado; No entanto, o número de núcleos Myc-positivas no urotélio ratinho tratado com BBN e nicotinamida foi significativamente menor do que no tumor da bexiga induzida por BBN, e a intensidade da coloração citoplasmática de Myc em ambos os grupos BBN foi mais fraco do que no urotélio normal (Figura 4, C e Tabela 1). Nós também descobrimos que PMP22 foi distribuído no citoplasma do urotélio normal de murganho, enquanto não houve evidência de expressão quer citoplasmática ou nuclear de PMP22 no tumor da bexiga do rato induzida por BBN. No BBN + urotélio tratados com nicotinamida, expressão de PMP22 citoplasmática foi observado; No entanto, o nível de expressão de PMP22 foi reduzida em relação à do urotélio normal (Figura 4, D e Tabela 1).

também realizada western blots para Myc e PMP22 para verificar rigorosamente a análise de perfis de expressão de gene. Na análise western blot, Myc foi altamente expressa no grupo tumor da bexiga do rato induzida por BBN em relação ao normal eo grupo + bexiga não-tumorigénico tratados com nicotinamida BBN, mas Myc expressão não mostrou nenhuma diferença entre o normal eo BBN + nicotinamide- grupo tratado com bexiga não tumorigénico. Por outro lado, o nível de expressão de PMP22 no grupo normal da bexiga foi significativamente maior do que no grupo de tumores da bexiga do rato induzida por BBN. Embora a expressão de PMP22 foi observado no grupo da bexiga + não tumorigénico tratada nicotinamida-BBN, o nível de expressão de PMP22 foi reduzida em relação à que em condições normais. Estes resultados indicaram que as mudanças nos níveis de expressão de proteína do

Myc

e seus genes associados também concordou com as alterações nos níveis de expressão de genes revelados pela análise de microarray. Os resultados também forneceram a evidência forte para a confiabilidade da identificação expressão gênica assinatura.

Comparação da expressão gênica entre cancros da bexiga do rato humanos e

Tendo em conta os três subgrupos distintos de o rato modelo experimental, examinaram quão bem esses modelos recapitular fenótipos de câncer de bexiga humanos, tal como definido pelos padrões de expressão gênica. Porque duas plataformas de microarray diferentes foram utilizados para estudar o cancro da bexiga humana (coorte coreano) do mouse e, foram selecionados genes homólogos que estavam presentes em ambos os microarrays utilizando HomoloGene, que forneceu informações sobre o mouse homólogos e genes humanos. Um total de 11,565 genes homólogos estavam presentes em ambos os microarrays. Na análise de agrupamento hierárquico dos dados integrados, os três subgrupos foram bem separadas umas das outras (Figura 5). Excepto para apenas uma amostra de rato, os padrões da bexiga em ratos normais e ratos BBN + tratou-nicotinamida expressão do gene eram muito semelhantes às da mucosa normal ou cancros da mucosa circundante (adjacente a) em humanos (grupo I na Figura 5). Em contraste, os padrões de cancros da bexiga do rato do grupo de tumor induzida por BBN expressão foram muito semelhantes aos de MIBCs em seres humanos (Grupo III na Figura 5).

Genes com valores de expressão que tinha um desvio padrão de pelo menos, 0,9 foram selecionadas para análise hierárquica (1.059 características genéticas). As cores vermelhas e verdes refletem os níveis de expressão de alto e baixo, respectivamente. BBN, NC, NMIBC e MIBC indicam N-butil-N- (4-hidroxibutil) -nitrosamine, nicotinamida, não-músculo invasivo cancro da bexiga e câncer de músculo da bexiga invasivo, respectivamente.

próxima aplicados métodos de aprendizagem supervisionadas para validar a análise de cluster sem supervisão. Aplicou-se quatro métodos de predição independentes para determinar qual dos modelos de rato pode imitar melhor os fenótipos humanos. Foram utilizados os conjuntos de dados de expressão de genes das duas subclasses de bexigas humanas para treinar métodos de previsão (Normal vs. CINM, NMIBC vs. CINM, e Normal vs. NMIBC). Todos os métodos de predição previu que bexigas de rato tratados com nicotinamida mais normais e BBN + são relativamente semelhante à mucosa normal ou cancros em humanos mucosa circundante (adjacente a), ao passo que induzidas por BBN cancros rato da bexiga são relativamente semelhantes aos MIBC em humanos (Quadro 2) . Além disso, quando nós aplicamos métodos de previsão treinados com NMIBCs e MIBCs, observamos que todos os cancros da bexiga de rato induzidas BBN foram previstos como CINM (Tabela 2). Além disso, quando da aplicação de métodos de predição treinados com NMIBCs normal e, a maioria + bexigas de rato tratado de nicotinamida-BBN eram relativamente semelhante à mucosa normal ou em tipos de cancro humano (Tabela 2) em torno da mucosa (ao lado).