Abstract

Fundo

A identificação de um marcador de diagnóstico baseados em sangue é um objectivo em muitos áreas da medicina, incluindo o diagnóstico precoce do câncer de próstata. Nós descrevemos o uso de apresentação diferencial média como um mecanismo eficiente para a descoberta de biomarcadores em RNA sangue total. O processo de média reduz o problema da heterogeneidade clínica, minimizando simultaneamente manipulação da amostra.

Metodologia /Principais Achados

RNA

foi isolado a partir do sangue de pacientes com câncer de próstata e controles saudáveis. As amostras foram reunidas e submetidas ao processo de apresentação diferencial média. Transcritos presentes em diferentes níveis entre pacientes e controles foram purificados e seqüenciados para a identificação. níveis de transcrição no sangue de pacientes com cancro da próstata e os controlos foram verificados por RT-PCR quantitativo. As médias foram comparadas usando um t-teste e uma curva receiver-operacional foi gerado. O Anel de proteína dedo 19A (RNF19A) transcrição foi identificado como tendo níveis mais elevados em pacientes com câncer de próstata em comparação com homens saudáveis ​​por meio do processo de apresentação diferencial média. análise de RT-PCR quantitativo confirmou um mais do que duas vezes maior nível de níveis de mRNA RNF19A no sangue de pacientes com cancro da próstata do que em controlos saudáveis ​​(p = 0,0066). A precisão de distinguir pacientes com câncer de homens saudáveis, utilizando os níveis de mRNA RNF19A no sangue, conforme determinado pela área sob a curva operador de recepção era 0,727.

Conclusões /Significado

Média de apresentação diferencial oferece uma abordagem simplificada para o rastreio abrangente de fluidos corporais, tais como sangue, para identificar biomarcadores em pacientes com cancro da próstata. Além disso, esta prova-de-conceito estudo requer uma análise mais aprofundada da RNF19A como um biomarcador clinicamente relevante para a detecção do câncer de próstata

Citation:. Bai VU, Hwang O, GW Divino, Barrack ER, Menon M, Reddy GP- V, et al. (2012), calculados expressão diferencial para a descoberta de biomarcadores no sangue de pacientes com câncer de próstata. PLoS ONE 7 (4): e34875. doi: 10.1371 /journal.pone.0034875

editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de outubro de 2011; Aceite: 10 de março de 2012; Publicação: 06 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Bai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo Instituto de Urologia Vattikuti. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Enquanto o cancro da próstata metastático continua a ser uma doença incurável [1], a intervenção quando a doença ainda é localizada, e normalmente assintomática, é frequentemente curativa [2], [3], [4]. Desde a intervenção precoce é conhecido para reduzir a mortalidade em homens com cancro da próstata [5], a detecção precoce mantém a promessa de reduzir as taxas de mortalidade por câncer de próstata, mas sua eficácia ainda não foi estabelecida. antigénio específico da próstata (PSA) é o único biomarcador comumente em uso para este fim, mas tem limitações com especificidade e sensibilidade imperfeita. A PSA normal não exclui a presença de câncer de próstata potencialmente letal [6] enquanto a doença benigna da próstata pode causar elevação da PSA que podem exigir biópsia da próstata para o diagnóstico. As limitações do teste de PSA na redução da mortalidade de câncer de próstata foram vistos claramente quando dois grandes ensaios clínicos randomizados publicados resultados conflitantes [7], [8]. Mesmo se interpretada em uma luz favorável, os resultados sugerem que o benefício de sobrevivência de rastreio PSA era pequeno, com 50 homens a necessidade de submeter a prostatectomia para salvar uma vida [7]. Este resultado também destaca o problema de excesso de diagnósticos de câncer de próstata, quando muitos homens são diagnosticados com um câncer de próstata indolente, que não terá impacto sobre sua mortalidade, mesmo se não tratada. No entanto, o fato de que o câncer de próstata continua a ser a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em homens [9] é um lembrete da importância de detectar o câncer de próstata potencialmente letal quando ainda é curável. Assim, a identificação de biomarcadores adicionais para melhorar o desempenho do PSA continua a ser um objectivo importante na detecção precoce do cancro da próstata, em especial na detecção de doença agressiva.

Descrevemos aqui a utilidade de uma expressão diferencial média (ADE ) abordagem para identificar biomarcadores em amostras de sangue de homens com câncer de próstata. metodologia de exibição diferencial não requer conhecimento prévio de transcritos de ARN. Differential Display oferece, portanto, um sistema “aberto” em que ambos os transcritos de ARN conhecidos e desconhecidos associados com um estado de doença podem ser identificados, um fato que a distingue da tecnologia de microarray [10], [11]. apresentação diferencial requer pequenas quantidades de iniciar RNA (tão pouco quanto 20 ng de RNA total), e oferece um potencial sem precedentes para a rápida identificação de transcrições de RNA presentes em diferentes níveis de teste contra amostras de referência; é especialmente eficiente na identificação das transcrições de baixa abundância [11], que não podem ser detectados por rastreio de microarray tecnologias à base de hibridização. apresentação diferencial também oferece uma excelente oportunidade para interrogar todo o transcriptoma. Com base em cálculos teóricos, são esperados 240 pares de iniciadores arbitrários e de ancoragem para amplificar ~96% de transcritos de ARN expressas [12]. Próxima geração do transcriptoma sequenciação (por exemplo, RNA-seq) compartilha algumas dessas forças (análise de transcriptoma todo, o conhecimento prévio da sequência de transcrição não seja necessário, pequenas quantidades de iniciar RNA necessário), além de oferecer a capacidade de distinguir variantes alélicas e da emenda que não são facilmente avaliadas com apresentação diferencial [13]. No entanto, os dados de sequenciação de ARN-SEQ irá inclinar no sentido de transcritos de alta abundância e a tecnologia continua-se a 100 vezes mais caros do que exibição diferencial [13].

ADE mantém as vantagens da técnica de apresentação diferencial, facilitando simultaneamente a análise de amostras heterogêneas. A agregação de amostras heterogêneas identifica de forma eficiente transcrições que são diferencialmente expressos em uma alta proporção das amostras que compõem dois grupos [10]. Procurou-se melhorar ainda mais a metodologia ADE, acelerando a descoberta de biomarcadores de câncer de próstata em amostras clinicamente relevantes. Embora o padrão-ouro do diagnóstico de câncer de próstata é uma biópsia da próstata, este procedimento é doloroso, invasivo e sujeito a possíveis complicações de hemorragia e infecção. Portanto, os biomarcadores que podem ser identificados em amostras de sangue, tais como são desejáveis. Uma vez que nem todos os biomarcadores associados a tumores vai ser detectável no sangue, a partir do processo de descoberta no tecido tumoral, mais tarde, requerem um maior dispêndio de tempo e de recursos para a validação em amostras de sangue. Além disso, os biomarcadores à base de sangue, que representam uma resposta do hospedeiro ao tumor não seriam identificadas se biomarcador descoberta é iniciado em amostras de tumor. Especial meios de recolha de sangue permite a recuperação eficiente de RNA não degradada do sangue total, mesmo após incubação prolongada à temperatura ambiente, tornando esta uma opção prática para aplicação clínica. Assim, decidimos iniciar o processo de descoberta de biomarcadores usando amostras de sangue total.

ADE Embora tipicamente tem sido utilizada para avaliar as transcrições que são expressos diferencialmente em tecido (daí, a terminologia “uma média de expressão diferencial”), nós adaptamos esse técnica para identificar os transcritos de ARN que estão presentes em diferentes níveis de ARN de sangue total de dois grupos de pacientes. Estas transcrições não são necessariamente expresso diferencialmente em células que estão presentes no sangue, ou até mesmo em comparação com o tecido do tumor normal, mas a sua presença no sangue pode ser utilizada para diferenciar entre estes dois grupos. Neste estudo, descrevemos o uso de ADE para identificar um transcrito de ARN, RNF19A (Gene ID: 25.897), que está presente em níveis mais elevados no sangue de doentes com cancro da próstata do que em controlos saudáveis. Estes resultados estabelecem prova de princípio de que em média expressão diferencial (ADE) metodologia pode ser utilizada para a descoberta de marcadores de ARN em fluidos corporais de homens com cancro da próstata e apoiar o estudo da RNF19A como um biomarcador potencial de cancro da próstata.

Métodos inicial> Declaração

Todas as pesquisas envolvendo participantes humanos foi aprovado pelo Sistema de Saúde Henry Ford (HFHS) Institutional Review Board. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes e toda a investigação clínico foi realizado de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki.

Pacientes e coleta de sangue

pacientes com câncer de próstata foram identificados por meio do Departamento de Urologia da Henry Ford Health System (HFHS). controles saudáveis ​​foram recrutados da população em geral e clínicas HFHS Internal Medicine. O sangue total (2,5 ml) foi recolhido em tubos de ARN de sangue PAXgene (Qiagen, Valencia, CA), permitindo o transporte à temperatura ambiente, sem degradação do ARN. As amostras foram congeladas a -80 ° C até à extracção do ARN foi realizada.

Isolamento de ARN

de sangue em tubos de ARN PAXgene sangue foi centrifugado. O sedimento foi lavado com água isenta de ARNase e ressuspensas em Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA). O ARN foi extraído de acordo com os protocolos do fabricante. O ARN isolado foi tratado com DNase isenta de RNase (Invitrogen, Carlsbad, CA) e a concentração de ARN total foi determinada utilizando um Qubit Fluorómetro (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Média de expressão diferencial (ADE)

o ARN total a partir do sangue de 10 pacientes e 10 homens saudáveis ​​foram reunidas separadamente, reversamente transcrito, e submetido a ADE como descrito por Bai et al [10]. Âncora e primers arbitrários utilizados para PCR foram H-T11A e H-AP17 (GenHunter Corporation, Nashville, TN). As reacções de PCR foram realizadas em duplicado. Os produtos de PCR foram submetidos a electroforese e as bandas detectadas por autoradiografia. Bandas que diferiam na intensidade entre os pacientes com cancro da próstata e homens saudáveis ​​foram cortadas do gel, re-amplificada utilizando a mesma âncora e iniciadores arbitrários H-T11A e H-AP17, e directamente sequenciado.

qRT-PCR

o ARN foi transcrito de forma inversa utilizando iniciadores de hexâmeros ao acaso e transcriptase reversa transcriptor (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) de acordo com o protocolo do fabricante. Após a transcrição reversa, RNA foi submetido a qPCR em um Applied Biosystems 7500 Rápido Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando primers específicos de sequência para RNF19A (Ensaio Id: Hs00968447_m1) e 18S RNA (Ensaio Id: Hs03928985_g1 ). O número do ciclo em que a reacção cruzada um limiar de fluorescência (C

T) foi determinada para cada transcrito, e o nível de cada gene em relação ao teste de 18S RNA (transcrição de referência) foi determinada utilizando a equação 2

-ΔC

T, onde Sc

T = C

T, teste – C

T, ref [14]

Métodos estatísticos

As médias foram comparadas usando uma t. -teste. A igualdade das variâncias grupo foi testado, eo valor-p Satterthwaite foi relatado para distribuições com variâncias desiguais. O coeficiente de correlação de Pearson foi utilizado para avaliar correlação linear. Uma curva de operador receptor (ROC) foi gerada através da representação gráfica da sensibilidade contra a taxa de falsos positivos (1 – especificidade) que a discriminação do teste foi variado. foi calculada a área sob a curva (AUC). Todos os cálculos estatísticos foram realizados em SAS.

Resultados e Discussão

As amostras de sangue foram obtidas de controles saudáveis ​​do sexo masculino e os homens com câncer de próstata localizado antes da terapia definitiva. Após extracção de ARN, 20 ng de ARN total de cada um dos 10 doentes com cancro da próstata ou a partir de cada um dos 10 homens saudáveis ​​foram combinadas para formar dois grupos separados de ARN (cancro da próstata comparada saudável) que foram, então, analisadas por ADE como descrito por Bai et al [10]. A amplificação por PCR utilizando um conjunto de ancoragem e um iniciador arbitrário foi realizada em duplicado e os produtos de reacção foram submetidos a electroforese em gel (Fig. 1).

Como se mostra na Fig. 1, a análise de ADE identificados dois transcritos de ARN amplificado em níveis significativamente mais elevados em amostras de sangue de pacientes com cancro da próstata (Ca) do que naqueles a partir de homens saudáveis ​​(H). A análise da sequência de nucleótidos (Fig. S1, dados suplementares) revelou que estes dois transcritos partilhada uma sequência comum e que esta sequência tinha 100% de homologia com a sequência de nucleótidos no 19A proteína de dedo de anel (RNF19A) transcrito de ARNm. RNF19A, também chamado Dorfin, é uma ubiquitina ligase E3 conhecido por ser expresso nas inclusões patológicas encontradas na doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, demência do corpo de Lewy e [15]. RNF19A ubiquitinates synphilin-1 mutada e superóxido dismutase 1 (SOD1), que estão implicados na patogénese destas doenças neurodegenerativas [16], [17]. RNF19A não tenha sido previamente associado com cancro, que sublinha a utilidade de exibição diferencial para identificar novas associações. No entanto, tanto RNF19A e os seus alvos (SOD1 e synphilin-1) têm sido implicadas na sobrevivência celular e vias de morte celular [18], [19], [20]. SOD1 foi especificamente associada com o cancro da próstata [21], [22] e podem estar envolvidos na resposta celular a danos no ADN através do seu papel na via de stresse oxidativo. Outros ligases E3-ubiquitina, tais como RNF6, são relatados para regular a actividade do receptor de andrógeno em células de câncer de próstata [23].

análise ADE identificou duas transcrições de RNA com níveis significativamente mais elevados no RNA sangue total de pacientes com câncer de próstata ( Ca) do que em homens saudáveis ​​(H). análise de sequência de nucleotídeos revelou que estas duas transcrições compartilhado uma sequência comum. Esta sequência tinha 100% de homologia com a sequência de nucleótidos no E3 ubiquitina-ligase de dedo anelar 19a Proteína (RNF19A) transcrição e está localizado na região 3 ‘não traduzida (UTR).

Após a identificação de a transcrição RNF19A como um biomarcador potencial de distinguir o sangue de pacientes com cancro da próstata a partir do sangue de controlos saudáveis, qRT-PCR foi utilizada para medir o nível deste transcrito, em relação à de 18S ARN, em amostras de ARN de sangue inteiro de pacientes individuais. níveis RNF19A relativos foram medidos em 33 pacientes com câncer de próstata e 19 controles saudáveis ​​do sexo masculino. Estes grupos foram independentes dos grupos de pacientes utilizados para o processo de descoberta de ADE. As amostras de controlo (idade média 40 anos, intervalo 31-50 anos) foram retirados da população em geral e, como tal, não foram idade corresponde a casos de câncer de próstata. dados clínicos de linha de base para a coorte de câncer de próstata são apresentados na Tabela 1. Todos os casos de câncer de próstata tinham adenocarcinoma convencional na avaliação patológica e nenhum foi documentado para ter doença metastática ganglionar ou distante. RNF19A níveis relativos como medidos por qRT-PCR estão apresentados na Fig. 2 (para comparação de matéria-C

Dados T, consulte os dados suplementares, Tabela S1). O nível relativo médio de RNF19A foi de 4,79 ± 0,91 (SE) em pacientes com câncer de próstata em comparação com 1,96 ± 0,39 (SE) em controles saudáveis. Esta diferença entre os dois grupos foi estatisticamente significativa (p = 0,0066). A diferença estatisticamente significativa similar em níveis RNF19A entre pacientes com câncer de próstata e controles saudáveis ​​foi obtida quando os níveis foram avaliados através de semi-quantitativa RT-PCR (Fig. S2, dados suplementares).

RT-PCR quantitativo foi realizada em amostras de sangue total de ARN a partir de pacientes com cancro da próstata localizado (n = 33), bem como controlos saudáveis ​​masculinos (n = 19). Os níveis de transcrição RNF19A foram normalizadas para ARN 18S (gene de referência). resultados normalizados são apresentados em formato de caixa de enredo, com caixas representando a

th 25, 50

th e 75

th percentis e bigodes que representam o th 10

e 90

th percentis da dados. Outliers também são exibidos. A diferença entre as médias foi estatisticamente significativa (p = 0,0066).

Uma curva receiver-operacional para RNF19A foi gerado como uma estimativa global da sensibilidade e especificidade deste biomarcador de sangue para distinguir os casos de câncer de próstata dos controlos (Fig. 3). A AUC para o modelo foi de 0,7273, onde uma AUC de 1 corresponde a um teste de diagnóstico com perfeita (100%) especificidade e sensibilidade. Como ponto de referência, a AUC para a PSA tem sido estimada em 0,640-0,678, enquanto a AUC para um nomograma popular que tem em conta outros factores de risco do cancro da próstata, para além do nível de PSA foi estimado em 0,691 [24], [ ,,,0],25], [26].

uma curva-operacional do receptor (ROC) foi gerado como uma estimativa preliminar da precisão dos níveis relativos de RNF19A na classificação de pacientes com câncer ou controles saudáveis ​​na nossa coorte de pacientes. A taxa positiva verdadeira (sensibilidade) foi registada em relação à taxa de falsos positivos (1-especificidade). A área sob a curva foi calculada como 0,7273.

Embora esta descoberta é encorajador, deve notar-se que o uso de PSA para diferenciar pacientes com cancro da próstata a partir de controlos em nossos coortes também pode ter resultado numa melhoria AUC dada a idade relativamente jovem da nossa coorte saudável. Com uma idade média de 40, o PSA esperado na nossa coorte saudável seria inferior a 1,0 ng /mL, substancialmente menor do que o valor de PSA médio de 6,4 ng /mL visto na nossa coorte de cancro da próstata. No entanto, os níveis de RNF19A não se correlacionou com a idade (coeficiente de Pearson de 0,09), o que torna improvável que nossos resultados são simplesmente devido a um efeito relacionada à idade. Claramente, uma validação adicional precisa ser realizada em populações que mais se assemelham a configuração do mundo real de pacientes que estão sendo encaminhados para biópsia da próstata. Além disso, ele continua a ser determinado se RNF19A ou outros tais biomarcadores irá adicionar valor adicional aos métodos estabelecidos clinicamente para estabelecer o risco de câncer de próstata, tais como PSA, idade, raça e história familiar. Este estudo não foi desenhado para abordar a questão crítica de aumento da detecção de câncer potencialmente letal, evitando o excesso de diagnósticos de câncer indolente. Novos esforços em descoberta de biomarcadores para identificar esses subtipos letais são um objetivo essencial para o futuro.

Em conclusão, descrevemos aqui o uso da expressão diferencial média para identificar RNF19A como um transcrito de RNA que é níveis atuais a um maior no sangue de pacientes com câncer de próstata em comparação com controles saudáveis. Em nossa amostra de pacientes, esta transcrição foi capaz de distinguir pacientes com câncer de próstata de controles com uma AUC da curva receiver-operacional de 0,7273. Os resultados discutidos aqui estabelecer prova de princípio de que a metodologia ADE pode ser utilizado para a descoberta de marcadores de RNA no sangue de homens com cancro da próstata e garante uma análise mais aprofundada de RNF19A como um biomarcador clinicamente relevante para a detecção precoce do cancro da próstata.

Informações de Apoio

Figura S1.

Cromatogramas de transcrições identificou-ADE. As amostras de controlos saudáveis ​​e doentes com cancro da próstata foram sujeitos a análise da expressão diferencial em média. Transcrições (A e B), presentes em diferentes níveis nos controles saudáveis, em comparação com pacientes com câncer de próstata, foram submetidos a sequenciação. Os cromatogramas de as reacções de sequenciação para ambos transcrição A e B são apresentados, indicando uma sequência comum idênticos. Dado a solução do gel de exibição diferencial, a diferença de comprimento entre as duas bandas (A e B) é de não mais do que vários nucleótidos. Um local de recozimento diferente tanto para o iniciador aleatório ou o primer poli pode explicar este resultado

doi:. 10.1371 /journal.pone.0034875.s001

(PPT)

Figura S2. análise

RT-PCR de RNF19A no sangue de pacientes com câncer de próstata e homens saudáveis. Níveis de RNF19 foram avaliados usando semi-quantitativa por RT-PCR. O ARN foi transcrito de forma inversa utilizando hexâmeros aleatórios ou oligo iniciador (dT) e transcriptase reversa transcriptor (Roche Applied Science) de acordo com o protocolo do fabricante. A amplificação de ADNc foi efectuada utilizando iniciadores específicos da sequência de genes RNF19A e GAPDH. Os produtos de PCR foram corridos num gel de agarose a 2%. A quantificação das bandas de ADNc no gel foi efectuada por análise digital de intensidade da banda usando um sistema Eagle Eye II ainda vídeo com o software fornecido pela Stratagene (La Jolla, CA). níveis de transcrição RNF19A foram significativamente maiores em pacientes com câncer de próstata em relação aos controles

doi:. 10.1371 /journal.pone.0034875.s002

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Tabela S1.

Raw C

Dados T são apresentados para as coortes de validação de pacientes com câncer de próstata (pts AEP) e controles saudáveis. Quer dizer C

valores de T foram menores nos pts PRCA em relação aos controles (28,25 vs 29,50, p = 0,02). Quer dizer C

valores T para o gene de referência de 18 anos não foram estatisticamente diferentes entre pacientes e controles (16,62 vs 16,67, p = 0,89). As médias foram comparadas utilizando um teste t

doi:. 10.1371 /journal.pone.0034875.s003

(DOC)

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos pacientes e suas famílias que fizeram este trabalho possível.