Abstract

Uma opção de tratamento padrão para o câncer em estágio avançado é a ressecção cirúrgica de tumores malignos seguintes de quimioterapia adjuvante e quimioradioterapia . Além disso, a quimioterapia neoadjuvante pode ser aplicado, se necessário. Durante o curso de tempo de tratamento, os pacientes são geralmente seguida por tomografia computadorizada (TC) de vigilância, através de diagnóstico e marcador tumoral. No entanto, atualmente, os primeiros indícios de recidiva e /ou metástase de tumores com um biomarcador clinicamente relevante continua a ser um grande desafio terapêutico. Em particular, não houve nenhum biomarcador validado para predizer os resultados do tratamento em contextos terapêuticos. Recentemente, vimos glycoforms de α sérica

1-glicoproteína ácida (AGP) usando um affinoimmunoelectrophoresis cruzou com duas lectinas e um anticorpo anti-AGP. As estruturas de glicanos de AGP primários foram também analisadas por um espectrómetro de massa e de um software de novo em um grande número de doentes com vários cancros. Assim, a abundância relativa de glicanos α1,3fucosylated em AGP (FUCAGP) foi encontrado para ser significativamente elevados em doentes com cancro, em comparação com os controles saudáveis. Além disso, níveis surpreendentemente elevados de FUCAGP foram encontrados em pacientes com mau prognóstico, mas não em pacientes com bom prognóstico. No estudo atual, os níveis de FUCAGP em amostras de soro de vários pacientes com câncer foram analisadas e 17 pacientes, incluindo 13 que tinham sido submetidos a quimioterapia foram seguidos para a operação de vários anos post. FUCAGP nível determinado diligentemente usando um espectrómetro de massa foi encontrada para alterar juntamente com o prognóstico da doença, bem como com as respostas aos tratamentos, em particular, a várias quimioterapias. Portanto, os níveis FUCAGP medidos durante acompanhamento dos pacientes após a operação parecia ser biomarcador clinicamente relevante da intervenção tratamento

Citation:. Yazawa S, Takahashi R, Yokobori T, Sano R, Mogi A, Saniabadi AR, et ai. (2016) glicanos fucosilado em α1-glicoproteína ácida para monitorização do tratamento Outcomes e prognóstico de pacientes com câncer. PLoS ONE 11 (6): e0156277. doi: 10.1371 /journal.pone.0156277

editor: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, United States |

Recebido: 01 de março de 2016; Aceito: 11 de maio de 2016; Publicação: 13 de junho de 2016

Direitos de autor: © 2016 Yazawa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que nenhum interesse competindo existem

Introdução

a ocorrência de alterações associado a um tumor de estruturas de glicano em glicoproteínas e glicolípidos expressos na superfície das células do tumor, o que leva à secreção de tais moléculas com glicanos aberrantes para o plasma como antigénios associados a tumor é amplamente conhecido [ ,,,0],1,2]. Enquanto isso, uma série de antigénios, com base em glicano associados a tumores já foram isolados e validado para prever, preferencialmente, a presença de tumores em pacientes, e alguns encontraram aplicação clínica como marcadores tumorais, incluindo o antigénio carcinoembrionário (CEA) [3,4] , antigénio de carbohidrato 19-9 (CA 19-9) [5,6], α-fetoproteína (AFP) [7,8], antigénio do cancro 125 (CA125) [9,10], sialil Lewis Xi (SLX-I) [11,12] e sialil-Tn (STN) [13,14] antígenos. Estes biomarcadores reflectir o progresso no esforço passado para detectar tumores malignos e siga o seu prognóstico durante a intervenção tratamento. No entanto, uma vez que os poderes de diagnóstico destes marcadores são muitas vezes limitadas pela baixa sensibilidade e altas taxas de falsos positivos, o diagnóstico foi realizado em combinação com biomarcadores alternativas para acelerar taxas positivas e precisão nos cenários de prática. Por exemplo, no cancro do pâncreas, um ensaio de combinação de soro de CEA, CA 19-9 e o CA 242 é conhecido por ter melhorado a sensibilidade e especificidade do diagnóstico e prognóstico de doentes com cancro pancreático [15]. usos combinados de marcadores multi-tumorais também foram procuradas em outros pacientes com câncer [16-19]. No entanto, o valor clínico de antigénios associados a tumores em amostras de soro parece ser limitada como marcadores tumorais em pacientes com cancros gástricos e do pulmão, em particular, quando uma fase clínica anterior é considerada. Além disso, uma vez que o nível de tais antigénios segregados a partir de células de tumores no plasma não são suficientes para chegar a uma faixa positiva [20.21], fomos à procura de um novo biomarcador adequado e confiável.

Entre as ligações glicosil encontrados em antigénios associados a tumores de glicano-base, resíduos α1,3fucosyl ligados a resíduos de GlcNAc são uma das estruturas mais comuns expressos em células de tumor com muito abundante e aberrante existência no plasma e /ou soro como Lex (Galβ1,4 [Fucα1,3 ] GlcNAc), sialil Lex (NeuAcα2,3Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc), sialil Lex-i (NeuAcα2,3Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAcβ1,3Galβ1,4GlcNAc), poli Lex ((Galβ1,4 [ ,,,0],Fucα1,3] GlcNAc)

n) e LeY (Fucα1,2Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc) antígenos [1, 22-24] (Fig 1).

Uma molécula de AGP possui cinco cadeias de glicano, incluindo diantennary, triantenário glicanos e tetraantenal, respectivamente. Todas as possibilidades são mostrados entre parêntesis e ‘*’. A estrutura núcleo comum consiste em [O homem]

3 [GlcNAc]

2. * repetida

N

estrutura acetilactosamina [(Galβ1,4GlcNAc)

n] anexado. Veja os detalhes no texto.

α

1-glicoproteína ácida (AGP) é uma grande glicoproteína de plasma com um peso molecular de 41-43 kD e com muito ramificado

N

glicanos -Conectado, que é sintetizada em e segregados a partir do fígado para o plasma [25]. O potencial de significância fisiológica de AGP foi investigado como uma proteína de fase aguda, e não apenas as alterações quantitativas da molécula, mas também alterações qualitativas das suas estruturas de glicano foram estudadas em associação com a inflamação, a gravidez, o tratamento com estrogénio, cancro, doenças do fígado e doenças auto-imunes como a artrite reumatóide [25-32]. análises estruturais de glicanos de AGP revelaram que eles consistem de cinco tipo complexo

N

cadeias de glicano -Conectado incluindo diantennary, triantenária e glicanos tetraanten�ia e sialilação ocorre a maior parte dos resíduos Gal terminais em cada quatro cadeias. O (sialil) LeX determinante está presente no lactosamina (Galβ1,4GlcNAc) estruturas em ambos os glicanos tri- e tetraantenal e aqueles com estruturas alongadas tetraantenal lactosamina repetindo como visto na Fig 1 [25,33]. Recentemente, nós investigamos glycoforms AGP em um grande número de amostras de soro de pacientes com câncer, bem como controles saudáveis ​​usando um affinoimmunoeleoctrophoresis cruzados (CAEI) com Con A lectina,

Aleuria aurantia

lectina (AAL) e anti-AGP anticorpo [34]. Assim, pacientes com neoplasias em estado avançado que tiveram glycoforms AGP contendo glicanos altamente ramificados e fucosilados por longos períodos após a intervenção cirúrgica foram encontrados para ter um prognóstico pobre. Em contraste, pacientes que tiveram glycoforms AGP sem tais mudanças eram esperados para ter um bom prognóstico independentemente dos seus estágios clínicos. Além disso, os níveis de AGP no soro em pacientes pré-operatórios foram significativamente elevados em comparação com o nível em controlos saudáveis. No entanto, nenhuma diferença óbvia foi observada entre os pacientes com relação aos níveis séricos de AGP e suas características clínico-patológicas, incluindo o seu prognóstico após a operação. Além disso, no nosso estudo recente [35], foi desenvolvido um novo sistema para a análise detalhada dos glicanos de AGP no soro com o auxílio de um espectrómetro de massa e de um software caseiro (AGPAS) permitindo muito rápida determinação das estruturas primárias de glicanos de AGP. Foi, em seguida, demonstrou que alterações na glicanos de AGP após a operação pode, efectivamente, ser utilizada como um biomarcador novo para monitorização e avaliação do prognóstico do paciente. Ou seja, abundância relativa de tri- fucosilado e glicanos tetraanten�ia em molécula AGP (FUCAGP) foi encontrado para ser significativamente maior em pacientes com câncer, em comparação com controles saudáveis. Além disso, os níveis altamente elevados de FUCAGP foram encontradas especificamente em pacientes com mau prognóstico, mas não em pacientes com bom prognóstico. Como os níveis de AGP foram encontrados para responder às mudanças em eventos clínicos, também focado em níveis séricos AGP, bem como FUCAGP nas amostras de soro mesmos de 30 pacientes com diversos tipos de câncer. Entre estes, 17 pacientes, incluindo 13 pacientes que se submeteram à quimioterapia foram seguidos por um longo período após a operação com base em seu estado clínico-patológico.

O objetivo do estudo foi avaliar FUCAGP como um novo biomarcador glicano à base de prever resultados clínicos, juntamente com a resposta dos pacientes à medicação incluindo várias quimioterapias.

Materiais e Métodos

Materiais

As amostras de sangue foram obtidas de pacientes com vários tipos de doenças malignas (n = 30 ), que foram internados no Hospital Universitário de Gunma (Maebashi, Japão), juntamente com a orientação de consentimento informado e aprovação do Comitê de Gunma University Graduate School of Medicine de Ética. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Gunma University Graduate School of Medicine de Ética e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os doadores. Todos os estágios clínicos foram determinados pela Classificação TNM de Tumores malignos [36]. Eles consistem em pacientes com gástrica (n = 9), cólon (n = 8), pulmão (n = 5), o esófago (n = 4), fígado (n = 2), recto (n = 1) e pâncreas (n = 1) câncer (Fig 2). Entre eles, 17 pacientes, dos quais 13 os que foram submetidos a várias quimioterapias foram acompanhados durante a pré-longa e pós-operatório e foram explorados em detalhe como descrito abaixo (Tabela 1). As amostras de sangue foram também obtidos a partir de voluntários saudáveis ​​como controlos (n = 21). As amostras de soro foram preparadas dentro de várias horas após a retirada de sangue e foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. HiTrap DEAE FF, de HiTrap SP FF e HiTrap Dessalinização foram adquiridos a partir de GE Healthcare (Amersham Place, Reino Unido). PNGase F foi de Roche Applied Science (Indianapolis, EUA). BlotGlyco foi obtido a partir de Sumitomo Bakelite, Co. (Tóquio, Japão). AGP humano e de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO, EUA). Tripsina, DTT, e outros agentes orgânicos para BlotGlyco foram obtidos a partir de Wako Puré Chemical Co. (Tóquio, Japão). AGP soro de coelho anti-humano foi obtido a partir de DAKO (Carpinteria, CA, EUA) e conjugado com peroxidase anti-humano de AGP foi Abcam (Cambridge, Reino Unido). antigénios associados a tumores em amostras de soro medidos neste estudo foram a CEA, cytokelatin 19 fragmentos (Cyfra), CA 19-9, enolase especifica neuronal (NSE), carcinoma de células escamosas (SCC) e SLX-i. Os níveis de cada antigénio foi determinada por um ensaio ELISA usando o sistema Cobas (Roche para o CEA, Cyfra, CA 19-9 e NSE), o sistema de arquitecto (Abbot para SCC) e por uma RIA (Otsuka para SLX-i) seguindo o fabricante de instruções. valores de corte padrão de cada antigénio foram de 5,0 ng /ml para o CEA, 2.8ng /ml para Cyfra, 37 U /ml de CA 19-9, 12 ng /ml para NSE, 1,5 ng /ml para o CCS e 38 U /ml para SLX-i, respectivamente.

FUCAGP, abundância relativa de tri- fucosilado e glicanos tetraanten�ia em AGP foi obtida a partir da análise MS. AGP concentrações foram determinadas com um ensaio ELISA. † foi excluída Um assunto (N paciente na figura 3). As amostras obtidas em um (*) e dois (◆) dias pós-operatórios. #Patients Foi submetido à quimioterapia neoadjuvante. estágios clínicos de cada paciente foram mostrados na parênteses. barra vertical indica o nível de corte de FUCAGP definido neste estudo.

Determinação dos níveis séricos AGP

Os níveis de AGP em amostras de soro foram medidos por um sanduíche do tipo ELISA utilizando anti-humano e anticorpo AGP AGP de rábano anti-humano conjugado com peroxidase, tal como descrito anteriormente [34]. Os resultados de ELISA de concentrações AGP no grupo controlo saudável indicou que o valor de cut-off foi 807μg /ml [34].

Purificação de AGP no soro

AGP foi purificado a partir de 0,5 ml das amostras de soro com base no método anterior [35] com uma ligeira modificação, permitindo um processo de purificação rápida e conveniente. Assim, um dispositivo recém-desenvolvido (AGP-prep-DOCA), constituído por conectado diretamente cinco colunas, ou seja, um HiTrap dessalinização, um HiTrap DEAE FF, dois HiTrap dessalinização e um colunas HiTrap SP, foi criado. Foi fluido com um conjunto de soluções tampão diferentes [35] por meio de uma bomba programado através da torneira de três vias conectada a respectivas colunas. Ao utilizar a AGP-prep-DOCA, solução AGP purificada foi obtida a partir da coluna final HiTrap SP dentro de um curto período de tempo, e no mesmo grau de pureza, como descrito anteriormente [35]. A AGP purificada foi utilizada para a preparação de rotulado

N-glicanos

seguido de análise espectrométrica de massa.

Preparação e rotulados

N-glicanos de AGP

N

glicanos e rotulado

N

glicanos de AGP foram preparados de acordo com o protocolo do kit de glicosilação (BlotGlyco) com uma ligeira modificação, como descrito anteriormente [35]. Resumidamente, as amostras foram digeridas com tripsina e PNGase F e a resultante

N

-glicanos foram marcados por meio de BlotGlyco. Após a marcação com o reagente aoWR, um MS exata de cada glicano foi alterado da seguinte forma: MW de glicanos = [um MS exatas] rotulados – [H

2O (18,0105)] + [aoWR (447,223)] + [CH

3 (14.0156) xn] + [H (1,0078)], onde n indica o número de

N

resíduos de ácido acetilneuramínico.

análise por espectrometria de massa de

N

-glicanos de AGP

um ul da solução da amostra foi misturado com 1 ul da solução de matriz (10 mg de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico em 300 ul de uma mistura de acetonitrilo e água destilada 700μl). Em seguida, um mL da solução misturada foi depositado sobre uma placa alvo de MALDI (massa de aço aC, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha) e deixados a secar. Dados de espectrometria de massa foram obtidos utilizando um MALDI-TOF /TOF ultrafleXtreme (Bruker) no reflector, modo ião positivo tipicamente soma 20000 tiros. Todos os espectros na faixa de massa de m /z 1000 a 5000 foram obtidos e massas deisotopic para cada pico colhidos foram exportados como uma lista pico de massa com cada valor de tanto a massa centróide e a área correspondente ao, software operação feita em casa, AGPAS desenvolveu recentemente [35].

Identificação

N

glicanos de AGP

Cada molécula glicano foi abreviado por meio de um número de quatro dígitos que indica o número de galactose ( Gal),

N

acetilglicosamina (GlcNAc), fucose (Fuc) e

N

ácido acetilneuramínico (NeuAc) resíduos que consistem em cada glicano excepto a estrutura do núcleo comum ([manose (Man) ]

3 [GlcNAc]

2) (fig 1). Quatrocentos e cinquenta e três glicanos teoricamente previstos e 154 glicanos metilados máximo previsto para ser produzido através do processo de rotulagem foram extraídos para a constituição da base de dados do AGPAS [35]. Todas as estruturas primárias de glicanos de AGP foram, por conseguinte, atribuído rapidamente, e, além disso, não só a abundância relativa de cada glicano, mas também a de tri- fucosilado e tetraantenal glicanos (FUCAGP) foram calculados utilizando simultaneamente a sua área correspondente. O valor de corte de FUCAGP foi conjunto arbitrário em média + DP de controlos saudáveis ​​(= 25,01), conforme descrito anteriormente [35]. Uma versão melhor com alguma melhoria para a atribuição de glicanos em AGPAS foi usado neste estudo, e a abundância relativa de glicanos totalmente atingidos foi 76,18 ± 8,27% (n = 298).

Os pacientes e tratamentos

amostras de soro de 30 pacientes com várias doenças malignas e em diferentes estágios clínicos observados na figura 2 foram coletadas antes e após intervenções cirúrgicas. Entre estes, 17 pacientes com adenocarcinoma gástrico, esôfago, pulmão e cólon foram seguidos por longos dias de pós-operatório (vagens). A quimioterapia adjuvante padrão e várias quimioterapias, incluindo a quimioterapia neoadjuvante (quimioterapia sistêmica primária, PSC) foram conduzidas em 13 dos 17 pacientes de acordo com os seus regimes individuais com até a quarta linha de tratamento (Tabela 1). Estes 17 pacientes foram classificados em 5 subgrupos com base no seu estado de prognóstico da seguinte forma. Os pacientes que receberam quimioterapia (Chemo /+) ou sem quimioterapia (Chemo /-) de tratamento e morreram com uma baixa sobrevida após operação (sobrevivência Short); pacientes que morreram com uma sobrevida prolongada após tratamentos repetidos de quimioterapia (sobrevivência Long); pacientes submetidos a quimioterapia, respondeu bem e sobreviveu durante o período de acompanhamento (Alive, Chemo /+); pacientes que sobreviveram sem tratamento de quimioterapia durante o período de acompanhamento (Alive, Chemo /-).

Determinação de um

FUT6

gene paciente deficiente

DNA genômico foi extraído a partir de amostras de sangue periférico por o método padrão de extracção com fenol-clorofórmio. O

FUT6

locus do gene foi amplificado por PCR com ty-1 e ty-2 primers [37]. As sequências de nucleótidos dos produtos de PCR foram determinadas por uma sequência direta utilizando primers específicos para o alvo.

Resultados

Níveis de FUCAGP e AGP em amostras de soro de pacientes com câncer e controles saudáveis ​​

N-glicanos de AGP

em amostras de soro de pacientes com várias doenças malignas pré-operatórios e em diferentes estágios clínicos (n = 30) e de controlos saudáveis ​​(n = 21) foram analisadas por um espectrómetro de massa. Com o auxílio do software AGPAS, abundância relativa de cada glicano foi determinada em simultâneo e em seguida, a abundância relativa de glicanos tri- e tetraantenal fucosilados na AGP (FUCAGP) obteve-se (figura 2). Níveis relativamente baixos de FUCAGP foram encontrados em quatro dos oito pacientes cujas amostras foram obtidas no dia um após a operação (POD). Além disso, um dos dois pacientes (E paciente na Tabela 1) que foram submetidos a quimioterapia neoadjuvante (OSP) mostrou o menor nível de FUCAGP (18,17%). No entanto, os níveis de FUCAGP em pacientes com câncer foram ainda significativamente elevado em comparação com aqueles em controles saudáveis ​​(média ± D.P. .: 32,25 ± 6,89 vs. 20,70 ± 6,61;

P Art 0,05). Os níveis de concentração de AGP no soro nas mesmas amostras também foram comparados em ambos os pacientes e controles saudáveis, e níveis elevados significativas foram encontradas nos pacientes (média ± SD 2.507,33 ± 1.093,14 vs. 1119,75 ± 456,65;.

P 0,05). Nenhuma correlação estava presente entre os níveis FUCAGP e AGP, tanto em pacientes (

r

= 0,117) e controles saudáveis ​​(

r

= -0,067), respectivamente.

Níveis de FUCAGP e AGP em pacientes com câncer seguido por um longo período

pós-operatório

Entre acima mencionados 30 pacientes, 17 pacientes classificados com base em seus status de prognóstico (Tabela 1) foram seguidos por um pós-operatório muito tempo para analisar a sua FUCAGP e os níveis de AGP . Treze dos 17 pacientes foram submetidos a várias quimioterapias de acordo com os seus regimes individuais, eo resto não recebeu tais terapias. Os pacientes que morreram dentro de 463 POD (sobrevivência Short) possuía FUCAGP elevada em seus períodos mais recentes, e níveis surpreendentemente elevados de FUCAGP foram encontrados em quatro dos seis pacientes no período (Fig 3). Além disso, pacientes que morreram com prolongados tratamentos sobreviver depois de repetidos de quimioterapia (sobrevivência Long) também possuía níveis elevados de FUCAGP em seus períodos mais recentes. No entanto, como observado em pacientes que tinham sobrevivido com quimioterapias repetidas (, Chemo /+ Vivo) e sem tratamento de quimioterapia (Alive, Chemo /-), os doentes com bom prognóstico mostraram níveis FUCAGP relativamente mais baixos em cerca de três anos após a operação. Ao todo, os níveis mais altos e mais baixos foram determinados em pacientes A (75,59%) e N (6,98%), respectivamente. Considerando que, os níveis de AGP também foram determinados nas mesmas amostras de 17 pacientes. Não houve diferença significativa das concentrações de AGP foi encontrado em associação com seus status de prognóstico, apesar de níveis elevados foram frequentemente observados em pacientes com câncer quando comparados com aqueles em controles saudáveis, como mostrado anteriormente [34]. Nenhuma correlação clara estava presente entre os níveis de FUCAGP e concentração AGP nestes pacientes.

Os doentes (A a Q) foram classificados de acordo com seus status de prognóstico. Consulte a Tabela 1 para os detalhes do estado de prognóstico de cada paciente. barra vertical indica o nível de corte de FUCAGP definido neste estudo. bares fechados e abertos indicam pacientes foram submetidos a quimioterapia e nenhum tratamento de quimioterapia, respectivamente.

Estudos de acompanhamento dos níveis de FUCAGP e AGP em pacientes com câncer com um prognóstico pobre

Os pacientes A e B quimioterapias foram submetidos com até a terceira linha, incluindo a quimioterapia neoadjuvante tratados em paciente B, mas eles morreram dentro de um ano após a operação. Níveis elevados de FUCAGP nestes pacientes caiu abaixo do nível de corte imediatamente após a operação, mas foi fluiu que os seus níveis elevados logo novamente e chegou à anormalmente elevada gama (Fig 4a). É importante ressaltar que o nível parecia ser mantida durante o período de acompanhamento, independentemente de tratamentos repetidos em quimioterapias até a terceira linha, e, posteriormente, eles morreram devido à recorrência de doenças. Foi de particular interesse que tais níveis extremamente elevados de FUCAGP foram observadas em avanço antes da recorrência das doenças foi detectada por meio de tomografia computadorizada ou suspeita de diagnóstico marcador tumoral. Os outros pacientes com uma curta sobrevivência (pacientes C, D, e E na Tabela 1) também mostrou a mesma mudança de níveis FUCAGP durante o período de observação, indicando que nenhuma queda significativa de níveis elevados de FUCAGP foi encontrada mesmo que recebeu vários quimioterapias-se a quarta linha e morreram dentro de 500 POD (dados não mostrados). níveis FUCAGP altamente elevados em paciente F que tinham recebido nenhuma quimioterapia adjuvante também mostrados a ser retido antes e depois da operação. O paciente que morreu pouco depois da recorrência da doença foi detectada pela tomografia computadorizada e suspeita de diagnóstico com quatro marcadores tumorais.

pacientes com má (a) e bom (b) o prognóstico. POD, dias pós-operatórios. quadrados sólidos indicar o POD, quando recidiva e /ou metástase de tumores foram clinicamente determinado. quadrados abertos indicam a POD, quando foi observada livre de tumor através da tomografia computadorizada (TC). † indica quando o paciente morreu. Cada valor de marcadores tumorais foi medida na POD indicado com uma seta e os números com uma letra de cor vermelha ‘H’ revelam sobre os valores-limite indicados nas respectivas instruções. telas cinzentas na figura mostram a duração da quimioterapia com cada linha de tratamento (Ct1-CT4). As barras horizontais indicam o nível de corte de FUCAGP definido neste estudo. Consulte a Tabela 1 para os detalhes do estado de prognóstico de cada paciente.

Em contraste, os pacientes I e J com uma longa sobrevivência receberam quimioterapia repetidos por períodos mais longos e sobreviveram até 1284 e 1639 POD, respectivamente . níveis FUCAGP que caíram uma vez após a operação, mas elevados novamente em 111 POD (paciente I) e 1030 POD (J paciente) antes da detecção de recorrência por meio de exames de diagnóstico ou com marcadores tumorais TC. Curiosamente, os níveis elevados de FUCAGP, em seguida, caiu em torno do nível de corte logo após receber quimioterapia com a primeira e terceira linha de tratamento, respectivamente, contra a recorrência. No entanto, foram observados os mesmos subindo e descendo níveis de FUCAGP em ambos os pacientes provenientes do tratamento da próxima linha da quimioterapia e, posteriormente, eles morreram devido ao progresso da doença que o acompanha por uma elevação contínua do nível FUCAGP. Os mesmos subindo e descendo as mudanças de níveis FUCAGP também foram encontradas pelo menos duas vezes correspondente a cada linha de quimioterapia em outros dois pacientes (pacientes G e H), mas de qualquer recidiva e /ou metástase de tumores ou nenhuma experiência de remissão completa ocorreu nestes pacientes e subsequentemente morreram (dados não mostrados). Assim, os doentes com uma longa sobrevivência parecia responder a certas linhas de quimioterapia incompleta de acompanhamento por uma queda temporária do nível de FUCAGP durante alguns meses no período.

níveis AGP em amostras de soro de pacientes que morreram durante o foram observados períodos de acompanhamento para mudar de forma diferente, excepto que os aumentos notáveis ​​foram encontrados no momento da operação, na maioria dos pacientes. Nenhuma correlação significativa estava presente entre as concentrações AGP e níveis FUCAGP e /ou entre as concentrações AGP e os níveis de marcadores tumorais.

Estudos de acompanhamento dos níveis de FUCAGP e AGP em pacientes com câncer de bom prognóstico

pacientes K e M tinham sido seguidos por mais de 3 anos durante a eles recebido repetidos quimioterapias até a terceira linha de tratamentos (Fig 4b). Eles tinham níveis relativamente baixos de FUCAGP em torno do nível de corte após a operação e quimioterapia adjuvante. Em seguida, verificou-se que os níveis de FUCAGP levantada gradualmente seguinte por detecção da recorrência das doenças ou resultados positivos de diagnóstico marcador tumoral. No entanto, depois de receber a próxima linha de tratamento de quimioterapia contra a recorrência de doença, os níveis elevados de FUCAGP foram encontrados para descer correspondentemente. Ele apareceu de forma destacada que os níveis altamente elevados caiu drasticamente abaixo do nível de corte no paciente M seguido de resultados negativos obtidos nas duas tomografias e diagnóstico marcador tumoral, e não houve recorrência clínica foi observado durante o período de acompanhamento. Foi também interessante notar que os níveis de FUCAGP gradualmente caiu em torno do nível de corte após a detecção de recorrência da doença e a segunda e terceira linha tratamentos de quimioterapia, em portadores de tumor do paciente K, embora os resultados positivos da CEA surgiu durante o período mais recente. Ele continua a ser visto se os níveis FUCAGP vai mudar de acordo com o status de prognóstico seguinte consiste com com níveis de CEA. O paciente L que foram submetidos os primeiro e segundo tratamentos linha de quimioterapia após a operação também sobreviveu durante o período de observação até 1641 POD. Os níveis FUCAGP retidos na gama normal para mais de 4 anos após a operação e tomografias condutoras 8 vezes indicado periodicamente sem recorrência de tumores ou metástases ocorreu no paciente (dados não mostrados). O paciente N que foram submetidos a tratamento de primeira linha de quimioterapia mostrou surpreendentemente baixos níveis de FUCAGP e sem resultados positivos obtidos a partir de tomografias computadorizadas durante o período de observação, embora concentrações AGP e CEA nas amostras de soro mesmos retidos nos níveis de corte. Portanto, os níveis FUCAGP de pacientes com bom prognóstico e sobreviveu durante os períodos de acompanhamento encontrados para manter em torno do nível de corte em resposta à mais recente linha de tratamento de quimioterapia. Considerando que, tal como mostrado na paciente S (Fig 4b), os níveis de FUCAGP em três pacientes (pacientes O, P e Q na Tabela 1) que não tinham recebido quimioterapia durante o período de observação mostrou a reter em torno do nível de corte após a operação . Estes pacientes não tinham observações especiais nem resultados positivos de tomografia computadorizada ou marcadores tumorais de diagnóstico. Portanto, os níveis FUCAGP em pacientes que sobreviveram durante o período de observação, sem ocorrência de recorrência ou metástase de tumores pareceu reter tão baixo quanto os controlos saudáveis. concentrações AGP mudou de maneira diferente em relação aos níveis FUCAGP e nenhuma correlação foi visto com os seus níveis em tudo. Um aumento repentino das concentrações AGP no soro ocorreu em associação com a intervenção cirúrgica também foi visto em todos os pacientes com bom prognóstico, seguido pela queda do nível em breve. As concentrações de AGP no soro, em seguida, parecia ser mantida em níveis relativamente baixos, exceto quando elevação transitória ocorreu em função das suas eventos clínicos.

expressão reprimida de glicanos fucosilados em AGP

Como mostrado acima, o paciente N tinha níveis extremamente baixos de FUCAGP durante o período de observação, embora as concentrações séricas de AGP mostrou sobre o nível de corte. glicanos fucosilados em AGP mal foram detectados por análise de espectrometria de massa de glicanos durante o período, apesar de glicanos afuco-tri- e tetraanten�ia como [Gal]

3 [GlcNAc]

3 [NeuAc]

3 (3303 ), [Gal]

3 [GlcNAc]

3 [NeuAc]

2 (3302), [Gal]

3 [GlcNAc]

3 [NeuAc]

1 (3301 ), [Gal]

4 [GlcNAc]

4 [NeuAc]

3 (4403), [Gal]

4 [GlcNAc]

4 [NeuAc]

4 (4404 ), [Gal]

4 [GlcNAc]

4 [NeuAc]

2 (4402) e [Gal]

4 [GlcNAc]

4 [NeuAc]

1 (4401 ) foram afectadas (Figura 5b). Estes glicanos são comummente presentes em glicanos de AGP e frequentemente fucosilado em doentes com cancro, como mostrado na Figura 5a. O paciente foi, portanto, sugeriu a possuir a mutação letal do

gene FUT6

e falta de atividade α1,3fucosyltransferase soro [38]. Na verdade, o paciente estava determinado a possuir o

pf

gene homozigoticamente (

pf

/

pf

), indicando ocorrência de mutação letal no

FUT6

gens que resultou na ausência de glicanos fucosilados na AGP [37]. No entanto, um par de glicanos fucosilados ainda foram detectado como menos de vários% do total de glicanos em AGP (Fig 4b). Assim, ele continua a ser examinada uma significância de glicanos fucosilados mal expressas em tal paciente com câncer com FUT6 por deficiência (detalhes de estudos moleculares e enzimáticos sobre fucosila�o de AGP no paciente N com FUT6 por deficiência será publicado em outro lugar).

os espectros de massa obtidos a partir de um paciente com um prognóstico pobre (a), (M paciente na Tabela 1) e o paciente N (b). triângulos brancos indicam glicanos defucosylated e pretos indicam fucosilado tri e glicanos tetraanten�ia atribuído. triângulos cinza mostram grandes subpeaks de formas metiladas de glicanos fucosilados derivados de esterificação metílico de sialiladas, fucosilado glicanos [35] atribuídos nos espectros. Quatro dígitos (FD) números significam o número de cada um dos resíduos, a fim de [Gal], [GlcNAc], [Fuc] e [NeuAc] que consiste em cada cadeias de glicano de cinco queridos por uma molécula de AGP, com excepção da estrutura do núcleo comum. Assim, 3303 indica [Gal]

3 [GlcNAc]

3 [Fuc]

0 [NeuAc]

3 + [O homem]

3 [GlcNAc]

2 [35] . FD números de grandes glicanos fucosilados atribuídos em (a) foram como se segue; 3313 (a), 3312 (b), 4413 (C), 4414 (d), 4424 (E), 4412 (f), 4423 (G) e 3323 (H). Veja os detalhes no texto.

Discussão

As proteínas são frequentemente alteradas após a tradução e mais da metade de todas as proteínas na natureza são glicosiladas [39], resultando em estar presentes como glicoproteínas com covalentemente ligados glicanos que possuem estruturas muito heterogéneas e diversas. Deve, portanto, ser plausível que estes glicanos têm implicação e responsabilidade para a estrutura e função dessas glicoproteínas significativo. Tem sido amplamente reconhecido que glicanos desempenham papéis importantes em não só o dobramento de proteínas e de apuramento, mas também uma célula para outra interação, reconhecimento e de ligação juntamente com ocorrências frequentes de modificações em glicanos si [40-42].