Abstract

Tradicionalmente, GRP78 tem sido considerada como um retículo endoplasmático: PLOS ONE (ER) proteína do lúmen devido à sua retenção de carboxilo motivo KDEL. Recentemente, uma subfracção de GRP78 é encontrado para localizar a superfície de tipos de células específicas, que serve como co-receptores de sinalização e regulação. No entanto, a relevância fisiológica da expressão de superfície celular GRP78 (sGRP78) no cancro e das suas interacções funcionais na superfície da célula são apenas emergente. Neste relatório, nós combinamos bioquímica, imagens e abordagens mutacionais para abordar estas questões. Para a detecção de sGRP78, utilizou-se um anticorpo monoclonal de ratinho altamente potente e específico para GRP78 ou GRP78 marcado com epitopo, juntamente com técnicas de imagiologia e bioquímicas que permitiu a detecção de sGRP78 mas não GRP78 intracelular. Os nossos estudos revelaram que as células da mama e cancro da próstata resistentes à terapia hormonal promover activamente GRP78 para a superfície celular, que podem ser ainda mais elevados por uma variedade de condições indutoras de stress ER. Mostrámos que sGRP78 formas complexas com PI3K, e a sobre-expressão de sGRP78 promove a formação de PIP3, indicativa da activação de PI3K. Nós ainda descoberto que um mutante de inserção de GRP78 no seu domínio N-terminal, mantendo a expressão estável e a capacidade de translocar a superfície da célula como a proteína de tipo selvagem, apresentaram redução da formação de complexos com p85 e produção de PIP3. Assim, nossos estudos fornecem uma explicação mecanicista para a regulação da sinalização PI3K /AKT por sGRP78. Nossos resultados sugerem que a segmentação sGRP78 pode suprimir a resistência terapêutica em células cancerosas e oferecer uma nova estratégia para suprimir a atividade PI3K

Citation:. Zhang Y, Tseng CC, Tsai YL, Fu X, Schiff R, Lee AS (2013 Cancer Cells) resistentes à terapia Promover relocalização superfície celular de GRP78 Complexos de que, com PI3K e aumenta PI (Produção 3,4,5) P3. PLoS ONE 8 (11): e80071. doi: 10.1371 /journal.pone.0080071

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de agosto de 2013; Aceito: 08 de outubro de 2013; Publicação: 11 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health (NIH) concede R01 CA027607 e AG034906 P01 à ASL; CA058183 P50 (SPORE cancro da mama), CA030195 P01, o programa SU2C /mama Breast Cancer Research Foundation e RS; CA014089 P30 (USC Norris Comprehensive Cancer do Centro de celular e tecidual Core) e DK048522 P30 (USC Centro de Pesquisas de Doenças do Fígado celular e tecidual Core). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a proteína regulada por glucose de 78 kDa (GRP78), também referido como BiP /HSPA5, é um acompanhante principal retículo endoplasmático (ER) com propriedades anti-apoptóticas [1] e um regulador de tensão mestre sinalização ER [2], [3]. As células tumorais são submetidos ao estresse ER devido a fatores intrínsecos de metabolismo alterado e extrínsecos do hipóxia e privação de nutrientes. indução de stress do ER de GRP78 em células cancerosas favorece a sobrevivência da célula, a progressão tumoral [4], [5] e confere resistência a drogas em ambas as células cancerígenas latentes em proliferação e, assim como as células endoteliais tumorais associadas [6] – [11]. Portanto, compreender como GRP78 exerce os seus efeitos sobre a proliferação de células pleiotrophic e sobrevivência é de grande importância.

Tradicionalmente GRP78 tem sido considerada como uma proteína lumenal do ER, devido ao seu motivo KDEL de retenção carboxilo [12]. Recentemente, uma subfracção de GRP78 foi encontrado para a localização da superfície de tipos específicos de células, particularmente em células cancerosas [13] – [16]. superfície celular proteoma de perfis de células tumorais revelaram uma abundância relativa de chaperonas de choque térmico e proteínas reguladas pela glicose, incluindo GRP78 [17]. Importante, expressão preferencial de GRP78 na superfície de células tumorais, mas não em órgãos normais permite direccionamento específico de tumor, levando à supressão do tumor sem efeitos prejudiciais em tecidos normais [18] – [21].

Evidência de que está a emergir sGRP78 podem formar complexos com proteínas da superfície celular específicos e regulam a transdução de sinal [13], [14], [16], tais como um co-receptor para o inibidor de proteinase α2-macroglobulina (α2-H *) induzida a transdução de sinal para o cancro sobrevivência e metástases [22], [23]. Cripto, uma chave de proteína da superfície celular ancoradas a GPI para a progressão do tumor humano, e sGRP78 formar um complexo e colaboram para inibir a sinalização de TGF-β e aumentar o crescimento celular e a activação da via PI3K /AKT [24], [25]. Além disso, sGRP78 é necessária para a sobrevivência de caderina-T-dependente das células endoteliais [26], a activação da apoptose mediada por Kringle 5 [27], [28] e extracelular par-4 e TRAIL [29], bem como a entrada viral em hospedeiro células [30], [31]. Recentemente, demonstrou localização na superfície celular de GRP78 é regulada por máquinas de recuperação de ER e reforçada pela depleção de Ca

2+ do ER [32]. As células cancerosas são muitas vezes submetidos ao estresse ER, que são agravadas pela terapia citotóxica levando a resistência. No entanto, se o stress patológico, tal como o desenvolvimento de resistência terapêutica, leva a relocalização da GRP78 à superfície da célula não é conhecido.

A via PI3K /Akt é activado em uma ampla gama de cancros que conduz à proliferação e terapêutico resistência [33]. A PI3K tem duas subunidades, a subunidade reguladora p85 e a subunidade catalítica p110. Para a activação de PI3K, a fosforilação da tirosina da subunidade reguladora p85 de PI3K alivia a sua actividade inibidora da PI3K, que conduz à sua activação. Após a ligação ao receptor de factor de crescimento activados, PI3K é recrutada para a membrana plasmática. PI (4,5) P2 é fosforilada por PI3K para produzir PI (3,4,5) P3, o que promove a localização da membrana de PDK1, que, em seguida fosforila e activa AKT. Através knockdown de GRP78 por ARNsi, ligadura de GRP78 superfície celular com anticorpo e em modelos genéticos de cancro, GRP78 foi estabelecida como um novo regulador de PI3K tanto in vitro como in vivo [16], [25], [34], [35]. Embora possa haver vários mecanismos pelos quais GRP78 pode afectar de activação AKT, tem sido relatado que o anticorpo como alvo o terminal N de imita GRP78 as formas reconhecidas por receptores de α2-H * como um ligando e dirige a activação dependente de PI3K de AKT e subsequente a estimulação da proliferação celular in vitro [21], [36]. Por outro lado, um domínio do terminal carboxilo reactivos actos de anticorpo como um antagonista de α2-H * e suprime α2-H * induzida por AKT fosforilação [21]. Recentemente, um anticorpo monoclonal de segmentação GRP78 superfície da célula é mostrada para suprimir /AKT de sinalização, o desenvolvimento do tumor e a metástase de PI3K em vários modelos de cancro [37]. Apesar destes avanços, pouco se sabe sobre como sGRP78 regula a atividade PI3K. Neste relatório, analisamos a expressão sGRP78 em linhas de mama e de células de câncer de próstata resistente à terapia hormonal, e examinou a sua regulação da produção PIP3. Estes resultados expandir nosso conhecimento sobre sGRP78 e têm importantes implicações para a terapia do cancro.

Materiais e Métodos

Todos os protocolos para o uso de animais foram revistos e aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o USC Institucional. O número de garantia de animal é A3518-01. O número do protocolo é 9964.

As linhas celulares e células de cultura

fibroblastos de rato embrionárias (MEF) [38], linhas de células humanas, HEK293T [32] e HeLa [32], foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina /estreptomicina. linhas de células humanas, células LNCaP (ATCC, Manassas, VA) e C4-2B (Viromed Lab, Minneapolis, MN), foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina /estreptomicina. As células parentais MCF7L [39] foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS inactivado por calor e 1% de penicilina /estreptomicina /glutamina; as células MCF7L-Tamr estavam no mesmo meio, excepto para o vermelho de fenol livre de dextrano (PRF) de RPMI 1640 e 10% de carvão despojado (CS) -FBS. O MCF7 parental /HER2-18 células [40] foram cultivadas em DMEM contendo 10% de FBS, 1% de penicilina /estreptomicina, 0,4% de geneticina (Life Technologies, Grand Island, NY) e 15 ug /ml de insulina (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO); as células MCF7 /HER2-18-Tamr estavam no mesmo meio, excepto para a PRF de DMEM e 10% de CS-FBS. As células de ambos os modelos Tamr MCF7L e MCF7-HER2-18 foram mantidas em meio contendo 100 nM de 4-hidroxitamoxifeno (Sigma-Aldrich) como a concentração final. A linha celular dependente de estrogénios, as células MCF-7 /autocarro, foi gentilmente cedido por A. M. Soto (Tufts University, Medford, MA) e tem sido descrita [41], [42]. O isolamento e cultura de condições para a fome estrogênio clone resistente MCF-7 /BUS-10 foram descritos [43]. Todas as células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2, 95% de ar. Para o tratamento de stress, as células foram tratadas com tapsigargina (Tg) a 300 nm, a tunicamicina (TU) a 1,5 ug /ml durante 16 h, ou 2-desoxiglucose (2DG) a 10 mM durante 24 h.

plasmídeos

a construção de FLAG-GRP78 com uma tag-FLAG inserido após o peptídeo sinal ER (aa 1-18) de comprimento total GRP78 humana (aa 1-654) tem sido descrita [32]. GRP78-103F contendo um identificador FLAG inserido logo após AA 103 de GRP78 humana foi construído como se segue: de comprimento completo GRP78 humano em pcDNA3 (Life Technologies) espinha dorsal foi usado como molde com QuikChange mutagénese dirigida ao local (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). O comprimento completo da subunidade reguladora humana de PI3K, o ADNc p85 alfa, foi amplificado por RT-PCR a partir de ARN humano HEK293 e subclonados em pcDNA3 em sítios BamHI e XbaI.

Condições de Transfecção

As células foram cultivadas para 60-80% de confluência e transfectadas com Biot (Bioland Scientific, Paramount, CA) seguindo as instruções do fabricante, conforme descrito [32].

Immunoblot análise

as células foram lisadas em radioimunoprecipita�o (RIPA) tampão suplementado com inibidor de protease competente (Thermo Scientific, Rockford, IL). Os lisados ​​celulares foram sujeitos a 10% de gel SDS e análise de mancha de Western, como descrito [32]. Os anticorpos utilizados foram: anticorpo de ratinho anti-FLAG (Sigma-Aldrich), 1:1000; rato anti-GRP78 anticorpo MAb159 (presente de P. Gill, USC), 1:2000; anticorpo anti-p85 PI3K de coelho (# 4292, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 1:1000; anticorpo de coelho anti-PI3K p110α (# 4249, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 1:1000; rato anticorpo anti-EphB4 (presente de P. Gill, USC), 1:1000; coelho anti NKA-α1 (Na, K-ATPase α1) anticorpo (Cell Signaling Technology), 1:1000; de murganho anti-actina-β anticorpo (Sigma-Aldrich), 1:5000. As experiências foram repetidas 2-3 vezes. Os níveis de proteína foram detectadas quer por quimioluminescência aumentada (ECL) ou coloração por fluorescência, e visualizada e quantificada com imagem Laboratório (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ou por LiCor Odyssey.

imunofluorescência e microscopia confocal

para a detecção de sGRP78 endógena, as células foram semeadas a C4-2B 5 × 10

3 por poço numa corrediça câmara de 8 poços (Millipore, Billerica, MA) durante 24 h e, em seguida, tratada com Tg durante 8 h . As células foram então fixadas em paraformaldeído a 4% frio durante 10 min, lavadas com PBS frio, e em seguida, bloqueadas com 5% de BSA em PBS (BSA /PBS) em gelo durante 30 min. As células foram coradas com anticorpo de rato anti-GRP78 monoclonal (MAb159) em 1% de BSA /PBS a 10 ug /ml a 4 ° C durante a noite sem permeabilização. As células foram lavadas com PBS frio e coradas com AlexaFluor-488 anticorpo anti-ratinho de cabra (Life Technologies) em 1% de BSA /PBS a 4 ° C durante 1 h. Para imunocoloração subsequente de p85 que é intracelular, as células foram permeabilizadas com saponina a 0,5% em PBS, à temperatura ambiente (TA) durante 15 min (v /w). As células foram lavadas com PBS contendo 0,01% de saponina (PBS /SAP), e, em seguida, bloqueadas com 5% de BSA em PBS /SAP à TA durante 1 h. As células foram coradas com anticorpo de coelho anti-p85 (1:50, Cell Signaling Technology), em 1% de BSA em PBS /SAP à TA durante 2 h, seguido por coloração com AlexaFluor-594 de anticorpo anti-coelho de cabra (Life Technologies) em 1% de BSA em PBS /SAP à TA durante 1 h.

para a detecção de GRP78 marcado com FLAG ectopicamente expressa na superfície da célula, as células HeLa foram semeadas a 5 x 10

3 por poço em 8- bem câmara desliza 24 h antes da transfecção. A transfecção foi realizada utilizando Biot. Quarenta e oito horas após a transfecção as células, não-permeabilizadas foram fixadas e bloqueadas como descrito acima e, em seguida, incubadas com anticorpo de ratinho anti-FLAG (Sigma-Aldrich) em 1% de BSA /PBS a 4 ° C durante 1 h seguido de incubação com AlexaFluor anticorpo anti-ratinho de cabra -488 (Life Technologies) em 1% de BSA /PBS a 4 ° C durante 30 min. Para a detecção de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PI (3,4,5) P3), as células foram então tratadas com Ig de ratinho MOM ™ reagente bloqueador (Vector Laboratories, Burlingame, CA) à temperatura ambiente durante 1 h para bloquear imunoglobulina de rato de anticorpo anti-FLAG principal do mouse. As células foram permeabilizadas subsequentemente, tal como descrito acima e coloração intracelular PI (3,4,5) P3 foi realizada como descrito [35]. Para a detecção de p85 em células HeLa, as células foram permeabilizadas e coradas com o anticorpo primário a 37 ° C durante 1 h e o anticorpo secundário, a 37 ° C durante 30 min.

Todas as células imunocoradas foram montadas com Vectashield médio anti-fade contendo DAPI (Vector Laboratories), e analisadas por um microscópio confocal Zeiss LSM510 equipado com software LSM 510 Versão 4.2 SP1 aquisição (Carl Zeiss). Imagens representativas foram tomadas com um EC Plan-Neofluar 40 × /1.30 óleo objetiva ou um Plano de-Apochromat 100 × /1,4 óleo objectivo DIC. imagens Z-stack foram tiradas com uma objectiva Plan-Apochromat 100 × /1,4 óleo DIC.

biotinilação proteína da superfície celular e isolamento

A célula de proteínas de superfície foram biotinilados com biotina não permeável, lisadas em tampão RIPA e purificado por neutravidina esferas de agarose, como previamente descrito [32].

Co-imunoprecipitação de ensaio

As células transfectadas foram biotinilados e lisadas com tampão de imunoprecipitação (IP) (Tris 25 mM Cl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1% de NP40). Os lisados ​​celulares foram sujeitos a avidina monomérica coluna (Thermo Scientific) e eluiu-se com mM de D-biotina 2 em PBS seguindo as instruções do fabricante. O eluato foi concentrado com Vivaspin 6 concentradores (10 kDa MWCO, Sartorius Stedim Biotech, Concord, CA), pré-aclarados com 50 Dynabeads ul de proteína G (Life Technologies) e submetidas a incubação com o anticorpo de ratinho 1 ug de anti-FLAG (Sigma-Aldrich) ou IgG de rato normal, durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com 50 ul de Dynabeads proteína G durante 1 h a 4 ° C. Após lavagem, as pérolas foram fervidas durante 5 min em 2 x tampão de amostra de SDS, as amostras foram submetidas a 10% de electroforese SDS-PAGE e Western blot.

de células activadas por fluorescência (FACS) ensaio

As células foram descoladas com não-enzimática solução de dissociação de células (Sigma-Aldrich) a 37 ° C durante 15 minutos e dividido em alíquotas de 1 × 10

6 células /tubo e incubou-se com 10% de soro humano normal em PBS durante 20 min em gelo para bloquear os receptores Fc na superfície da célula. As células foram incubadas com uma quantidade saturante de rato anticorpo anti-GRP78 (MAb159) (1 ug) durante 40 min em gelo em 100 ul de tampão de coloração (PBS de Dulbecco, 2% de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor, 0,09% de azida de sódio) , seguido por anticorpo AlexaFluor-488-conjugado de cabra anti-ratinho secundário (0,5 ug, Life Technologies) e suspensas em PBS gelado contendo 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, 1 ug /mL, Sigma-Aldrich) e submetidos a FACS. Os dados foram adquiridos pelo fluxo LSR II citômetro (Becton Dickinson, San Jose, CA) e analisados ​​utilizando software FlowJo.

Resultados

A promoção activa de expressão GRP78 superfície celular em células cancerosas resistentes à hormonal terapia

para testar se o desenvolvimento de resistência ao tratamento terapêutico altera a expressão de sGRP78 em células cancerosas, que utilizou três conjuntos de linhas de células de cancro e os seus derivados que tenham adquirido resistência ao regime de tratamento. A linha celular de cancro da mama humano MCF7L linha parental (MCF7L-P) e uma linha resistente a tamoxifeno derivado (MCF7L-Tamr) foram gerados por cultura a longo termo de células MCF7L-P em PRF-meio contendo 10% de CS-FBS e 100 nM tamoxifeno (Tam) até que o crescimento celular retomou (depois de 4 meses). Em contraste com as células MCF7L-P que cresceram em meio contendo E2, mas não em meio contendo Tam, células MCF7L-Tamr mostraram taxas de crescimento equivalentes quando submetidos a um estrogénio (E2) ou Tam (Figura 1A). A linha celular de cancro da mama humano MCF7 /HER2-18-P, que é um clone que sobre-expressam HER2 e o seu derivado Tam-R foi isolado após a exposição a longo prazo a Tam durante cerca de 11 meses. O terceiro par de células são as células de adenocarcinoma da próstata humano sensível ao andrógeno bem estabelecidos, LNCaP, e o seu derivado, linha celular independente de androgénios, C4-2B.

(A) Validação do fenótipo resistente Tam do células MCF7L-Tamr. MCF7L-parental (P) e células -TamR foram pré-fome em fenol vermelho-free (PRF) contendo 5% de CS-FBS durante 5 dias antes de submetida ao estrogênio (E2) (1 nM) ou Tam (100 nM) de tratamento para 8 d. As células foram semeadas em quadruplicados em placas e números de células de 96 poços foram contadas por um citómetro situ na célula. No dia 8, as células foram coradas por azul de metileno como se mostra no painel inferior. As barras de erro representam o desvio padrão; * P 0,001, teste t de duas faces, crescimento celular sob Tam vs. E2. (B) imunoblots de células MEF usando MAb159, com β-actina como controlo de carga. faixa da esquerda mostrou lisados ​​MEF de

Grp78 floxed /floxed

ratos. pista da direita mostrou abolição da banda GRP78 após a infecção com adenovírus expressando a Cre-recombinase para nocautear o

Grp78 floxed /floxed

alelos. (C) Western blot representativos para nível sGRP78 reforçada em células cancerosas resistentes. Parental (P) e Tamr derivados dos modelos celulares de cancro da mama humano MCF7 e de MCF7L /HER2-18, bem como a linha celular de LNCaP sensíveis androgénio parental e as células C4-2B independente de androgénios foram submetidos a biotinilação e NeutrAvidin tração de agarose -doWn para enriquecer para a proteína da superfície celular. GRP78 superfície celular (sGRP78) e total GRP78 intracelular (tGRP78) no lisado celular foram sondadas por Western blot. A quantidade de lisado total foi de 10% da quantidade utilizada para a avidina suspenso. β-actina serviram como controlo de carga para tGRP78, enquanto a proteína de membrana, EphB4, ou Na, K-ATPase α1 (NKA α1) serviu como controlo de carga de proteínas de superfície celular em células cancerosas da mama ou da próstata (CaP), respectivamente. As experiências foram repetidas duas vezes. As bandas de proteína foram quantificadas e os níveis relativos de tGRP78 nas linhas celulares parentais e resistentes foram normalizados contra β-actina e o nível de sGRP78 são normalizados contra EphB4 ou NKA α1, respectivamente, os quais são apresentados por média ± desvio padrão (SD) em o gráfico abaixo. Os níveis em linhas celulares parentais e na linha celular sensível androgénio, LNCaP são definidos como 1.

Para a detecção de GRP78, utilizou-se uma elevada afinidade MAb159 anticorpo monoclonal dirigido contra GRP78 humano que reconhece somente o GRP78 banda de proteína (Figura 1B). No momento do nocaute da

GRP78

alelos floxed nas MEFs por infecção com o adenovírus expressando a Cre-recombinase, a banda GRP78 foi abolida, confirmando que MAb159 reconhece especificamente GRP78. Para a detecção de sGRP78, as células foram biotinilados e as proteínas da superfície celular foram purificados por NeutrAvidin de agarose suspenso. A partir da análise de Western blot das proteínas biotiniladas e o lisado total, foram determinados os níveis de sGRP78 e GRP78 intracelular total de cada linha celular, com EphB4 e NKA α1 servindo como controlos de carga para proteínas da superfície celular de cancro da mama e linhas celulares de cancro da próstata, respectivamente. β-actina, uma proteína citosólica, serviu como controlo de carga para os lisados ​​de células totais. análises de Western blot representativo para detecção de sGRP78 e GRP78 são os apresentados, com os níveis de GRP78 após quantificação e normalização aos respectivos controles de carga representadas graficamente abaixo e mostrados com desvios-padrão (Figura 1C). A ausência de β-actina nas proteínas suspenso por NeutrAvidin confirmou a ausência de contaminação de proteína intracelular nas fracções de proteína da superfície celular. Para as células MCF7L-P que expressaram um nível moderado de GRP78 basal, houve um aumento de 3 vezes no total, mas GRP78 um aumento de 7 vezes na sGRP78 nas células Tamr. Para células /HER2-18-P MCF7 que expressam um nível basal mais elevado de GRP78, as células Tamr mostrou apenas um aumento mínimo da GRP78 total, mas um aumento de 4 vezes em sGRP78. Para as células C4-2B independente de androgénios, o aumento total GRP78 sobre as células LNCaP sensíveis-andrógenos era menor, mas houve um aumento de cerca de 7 vezes na sGRP78. Colectivamente, estes resultados sugerem que o aumento em sGRP78 em linhas de células resistentes, simplesmente não paralelo ao aumento da quantidade total de GRP78, em vez do desenvolvimento de resistência promove mecanismo especial (s) para melhorar a localização GRP78 para a superfície celular.

ER stress eleva ainda mais o nível GRP78 superfície celular em células cancerosas resistentes

Anteriormente, relatou que Tg, que inibe a ER ATPase causando Ca

2 + efluxo do ER, promove a translocação de GRP78 do ER para a superfície celular em células 293T de rim embrionário humano [32]. No entanto, se se aplica a linhas celulares de cancro que já exibem níveis moderados a elevados de GRP78 não é conhecido. Como as células cancerosas são rotineiramente expostas ao stress do ER no microambiente tumoral, é importante para determinar se as células cancerosas que tenham desenvolvido resistência à terapia é capaz de expressão mais elevação sGRP78 em resposta ao stress ER. Para testar estas, células resistentes tratados com diferentes indutores de stress ER e medido por FACS sGRP78, bem como através de abordagens bioquímicas. Na primeira abordagem, as linhas de células P-MCF7L Tamr e foram tratados com Tg. GRP78 superfície celular foi detectado por análise de FACS (Figura 2A). Para a linha de células MCF7L-P, o tratamento com Tg levou a um aumento de 4,8 vezes em sGRP78. Para a linha de células MCF7L-Tamr que já apresenta 12 vezes maior nível de sGRP78 em comparação com as células parentais MCF7L-P, de tratamento mais eleva da Tg sGRP78 expressão de 20 vezes (Figura 2A).

(A) MCF7L células parentais e tamoxifeno-resistentes foram ou não tratados (Ctrl) ou tratadas com 300 nM de tapsigargina (Tg) durante 16 h. GRP78 de superfície celular foram medidos por FACS. perfis de FACS representativos são mostrados e percentagens de células positivas estão indicados no canto superior direito. Linha tracejada azul, controle isotipo; linha sólida vermelho, anti-GRP78 Ab. A linha (B) Estrogen inanição sensível humana do cancro da mama celular, MCF7 /autocarro, e o seu derivado resistente à clone, MCF7 /BUS-10, foram ou não tratados (Ctrl) ou tratados com 10 mM de 2-desoxiglucose (2DG) durante 24 h. As células foram biotinilados e proteínas da superfície celular purificado por NeutrAvidin de agarose suspenso. sGRP78 e tGRP78 foram detectados por Western Blot. β-actina serviu como controlo de carga. As alterações de dobragem em sGRP78 tGRP78 e são mostrados abaixo e a condição de controle em células /autocarro MCF7 foi definido como 1. (C) O mesmo que (B), excepto as células C4-2B tratados com Tg, Tu (tunicamicina) ou 2DG. NKA α1 serviu como controlo de carga de proteína da superfície da célula. Os níveis relativos de tGRP78 sGRP78 e são normalizados contra β-actina ou NKA α1, respectivamente, e expressos como a média ± S.D. a partir de dois experimentos independentes em gráfico (direita).

Na segunda abordagem, utilizou a linha celular dependente de estrogénio MCF-7 /BUS e seu derivado MCF-7 /BUS-10 linha de células que adquiriu resistência ao jejum de estrogênio [43]. As células foram biotinilados e proteínas da superfície celular submetido a NEUTRAVIDIN contas de agarose suspenso. Os níveis de sGRP78 totais e GRP78 intracelulares foram determinados por Western Blot (Figura 2B). De acordo com MCF7L e as linhas de células MCF7 /HER2-18, o desenvolvimento de resistência no /autocarro 10-modelo MCF-7 aumentaram substancialmente a quantidade de sGRP78 (9 vezes), enquanto que a quantidade total de intracelular foi moderadamente aumentado (por de 1,3 vezes). Para ambas as linhas celulares parentais e resistentes, o tratamento de células com 2DG, um indutor do stress ER através da inibição da glicólise e glicosilação, expressão sGRP78 mais elevada em cerca de 5,2 vezes na linha parental e 3,5 vezes na linha resistente (figura 2B).

próxima examinou o nível de sGRP78 e GRP78 total na linha celular de cancro de próstata independente de androgénios C4-2B, com ou sem o stress ER (Figura 2C). Nestes estudos, além de Tg e 2DG tratamento, adicionamos outro indutor ER estresse, tunicamicina (TU), a qual cria o esforço de bloqueio do ER por glicosilação de proteínas N-ligadas, fazendo assim com que a acumulação de proteínas underglycosylated no ER. Na análise de transferência de Western, β-actina e NKA α1 serviram como controlos de carga para as proteínas totais e da superfície celular, respectivamente. Tal como no caso para as células de cancro da mama resistentes, ER stress provocado um aumento moderado de GRP78 total (em cerca de 2 vezes) uma vez que estas células já expressa elevado nível basal de GRP78 em comparação com as suas células parentais sensíveis. Sob todas as condições de stress três ER, nível sGRP78 aumentou de 5 a 6 vezes, em comparação com células não-esforçado. Colectivamente, estes resultados mostram que os estímulos de stress diverso de ER são capazes de promover activamente sGRP78 expressão tanto em células cancerosas sensíveis e resistentes a drogas, e que o desenvolvimento da resistência à terapêutica em associação com a expressão de ER de tensão melhora ainda mais sGRP78.

superfície celular GRP78 formas complexas com as PI3K

estudos recentes sugerem que a perturbação de sGRP78 altera a via PI3K /AKT, no entanto, como isso é conseguido não é bem compreendida [14], [16]. Para lidar com isto, verificou-se se sGRP78 co-localizada com a PI3K na superfície da célula. C4-2B, com alta sGRP78 endógena ea relativa facilidade de cultura, apresenta um sistema de modelo de célula adequado. Para maximizar a expressão sGRP78, as células foram tratadas com Tg. Em células não-permeabilizadas, coloração do anticorpo irá detectar GRP78 principalmente na superfície da célula, em vez de o GRP78 intracelular altamente abundante, que se localiza na região majoritariamente ER perinuclear. Após 8 h de tratamento Tg, sGRP78 endógeno, como visualizado por coloração por imunofluorescência, com o anticorpo monoclonal MAb159, foi detectada dispersa sobre a superfície da célula de células C4-2B (Figura 3A). Para detectar a subunidade reguladora p85 de PI3K que é intracelular, as células foram permeabilizadas MAb159 imunocoradas seguido por coloração com anticorpo contra p85. Como se mostra nas imagens representativas, a co-localização de sGRP78 endógena e p85 em múltiplos locais foram observados por um subfracção de sGRP78 e p85 (Figura 3A, setas).

(A) Microscopia Confocal de detecção de co-localização de sGRP78 endógeno com p85 em células C4-2B tratados com Tg durante 8 h. células não permeabilizadas foram primeiramente coradas com anticorpo anti-GRP78 (MAb159) para detectar sGRP78 (

verde

) (à esquerda). As células foram depois permeabilizadas e depois coradas com anticorpo anti-p85 (

vermelho e). (B) co-localização de superfície de células M-GRP78 com p85 em células HeLa. As células não-permeabilizadas HeLa transfectadas com o vector de expressão de F-GRP78 foram primeiramente coradas com anticorpo anti-FLAG para detectar superfície F-GRP78 (

verde) (esquerda), em seguida, permeabilizadas e coradas com anticorpo anti-p85 (

vermelho). Em ambos (A) e (B), o núcleo foi corado por DAPI (

azul e) e as regiões enquadradas (quadrado branco) das imagens Z-stack compactados (painéis da esquerda) foram ampliados e mostrado na painéis da direita em planos de corte confocal individuais (espessura de 0,38 mm) .A fundiu imagens mostraram co-localizações (

amarelo) de GRP78 superfície celular e p85 detectados em vários correspondentes locais (

setas brancas

) . barras de escala representam 2 m. (C) Esquema para detecção de interação entre a superfície celular F-GRP78 e p85. proteínas da superfície celular biotiniladas foram purificadas por coluna de avidina monomérica, seguido de imunoprecipitação (IP) e Western blot. (D) As células 293T foram transfectadas com vector de expressão de F-GRP78. proteínas de superfície celular eluídas a partir da coluna de avidina monomérica (entrada) como descrito em (C) foram sujeitos a imunoprecipitação (IP) quer com anticorpo anti-FLAG ou isotipo IgG que serve como controlo negativo. F-GRP78, os níveis de p85 e p110α no complexo imunoprecipitado foram medidos por Western blot com anticorpos anti-FLAG, anti-p85 e anti-p110α.

Para estender essas observações, nós transfectadas células HeLa com a vector de expressão para FLAG-GRP78 (F-GRP78). O uso de GRP78 marcada com o epitopo FLAG permitiu o uso do anticorpo anti-FLAG altamente específico para detectar a expressão GRP78 superfície celular em células não-permeabilizadas. As células HeLa foram usados, uma vez que aderem mais fortemente a slides microscópicos, que é crítico para as múltiplas etapas de manipulações experimentais das células transfectadas. Os nossos resultados mostraram co-localização abundante de superfície de células M-GRP78 com p85 (Figura 3B).

A seguir, para determinar se bioquimicamente sGRP78 complexo formado com PI3K, células 293T foram transfectadas com o F-GRP78. As células 293T foram utilizados devido à sua elevada eficiência de transfecção. A utilização de M-GRP78 permitiu-nos para imunoprecipitar GRP78 com elevada especificidade e afinidade. A concepção experimental é mostrado na Figura 3C. Após a transfecção, as células foram biotinilados e os lisados ​​celulares foram incubados com esferas de agarose avidina monomérica que permitem o isolamento de proteínas de superfície celular biotiniladas por eluição condição suave, devido à sua fraca afinidade a proteína biotinilada. As proteínas de superfície de células eluídas foram imunoprecipitados com anticorpo anti-FLAG ou o controlo do isotipo IgG. Os imunoprecipitados foram então sujeitas a transferência de Western e sondadas com anticorpos contra p85 e p110α, bem como o anticorpo anti-FLAG. Observou-se que a superfície de células M-GRP78 complexo formado com tanto a subunidades de PI3K reguladora (p85) e catalisador (p110α), em contraste com o controlo de IgG, que não mostrou qualquer ligação (figura 3D). Colectivamente, estes resultados sugerem que sGRP78 directamente ou indirectamente interactua com p85 e p110α.

GRP78 superfície celular superexpressão estimula PI (3,4,5) P3 e produção de co-localização

A formação do complexo entre sGRP78 PI3K e sugere que ela pode conduzir à modulação de actividade de PI3K. Após a activação, a PI3K localiza à superfície da célula e fosforila PI que conduz à PI (3,4,5) P3 (4,5) P2 (referido abaixo como PIP3) produção.