Abstract

Fundo

Na nossa Institute, uma estratégia chemoradioselection foi usado para seleccionar pacientes para preservação de órgãos com base na resposta a um 30-40 Gy radioquimioterapia concomitante inicial (CCRT). Os pacientes com uma resposta favorável (ou seja, chemoradioselected; CRS) têm demonstrado melhores resultados do que aqueles com uma resposta desfavorável (isto é, nonchemoradioselected; N-CRS). Bem sucedida das moléculas de direccionamento que atenuam a eficácia de chmoradioselection pode melhorar os resultados. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a associação de um (CSC) marcador, variante CD44 9 (CD44v9) de células-tronco novela câncer, com refractoriness celular para chemoradioselection em avançado de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP).

Materiais e Métodos

Através de uma pesquisa de prontuários, 102 pacientes com carcinoma epidermóide avançado tratados com chemoradioselection 1997-2008 foram inscritos. De acordo com o nosso algoritmo, 30 pacientes foram CRC seguinte CCRT indução e 72 pacientes foram N-CRS. Usando a técnica de imunohistoquímica convencional, amostras de biópsia e amostras de tumores removidos cirurgicamente foram imunocoradas com os anticorpos específicos anti-CD44v9.

Resultados

Os níveis de expressão intrínsecas de CD44v9 nas amostras de biópsia não se relacionou com o chemoradioselection e sobrevida do paciente. No entanto, em pacientes N-CRS, o grupo CD44v9 positivo demonstraram significativamente (

P

= 0,008) pior prognóstico, que o grupo de CD44v9-negativo. A análise multivariada demonstrou que, entre quatro fatores candidatos (T, N, a resposta ao CCRT e CD44v9), CD44v9 positividade (HR: 3,145, IC 95%: 1,235-8,008,

P

= 0,0163) foi significativamente correlacionada com o mau prognóstico, juntamente com o avançado estágio N (HR: CI 3.525, 95%: 1,054-9,060,

P

= 0,0228). Além disso, a taxa de sobrevivência do grupo induzida CD44v9 foi significativamente (

P

= 0,04) pior do que o grupo não-induzida CD44v9.

Conclusões

induzida CCRT- CSCs CD44v9 expressam parece ser um grande obstáculo para chemoradioselection. CD44v9-targeting parece ser uma estratégia promissora para aumentar a eficácia de chemoradioselection e preservação de órgãos consequente e sobrevivência

Citation:. Aso T, Matsuo M, Kiyohara H, Taguchi K, Rikimaru F, Shimokawa M, et al . (2015) Indução de CD44 Variant 9 expressando células-tronco câncer pode atenuar a eficácia do Chemoradioselection e piora o prognóstico de pacientes com avançado de cabeça e pescoço do cancro. PLoS ONE 10 (3): e0116596. doi: 10.1371 /journal.pone.0116596

Editor do Academic: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, SUÉCIA

Recebido: 24 de setembro de 2014; Aceito: 12 de dezembro de 2014; Publicação: 09 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Aso et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:.. Grant-in -Aid de Pesquisa Científica (C) para Muneyuki Masuda

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar dos recentes avanços em tratamentos multidisciplinares, a sobrevida global e qualidade de vida de pacientes com avançado de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP) não melhoraram consideravelmente ao longo da última década [1, 2] . Assim, a criação de terapias clinicamente eficazes baseadas na biologia HNSCC é imperativo. No Departamento de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Universidade de Kyushu e sua institutos afiliados, uma estratégia chamada chemoradioselection tem sido usada como uma ferramenta para medir a agressividade biológica de um tumor individual desde 1972 [3-5]. Em resumo, as respostas dos tumores são avaliadas de acordo com 30-40 Gy de chemoradiothepapy concorrente (CCRT). Em seguida, os pacientes que demonstram respostas favoráveis ​​(ou seja, chemoradioselected; CRS), avance para as outras CCRT até 60-70Gy, enquanto aqueles com respostas desfavoráveis ​​(ou seja, não-chemoradioselected; N-CRS), submetido a uma cirurgia radical, que muitas vezes resulta em a perda de órgãos vitais (por exemplo, da laringe). Curiosamente, pacientes com RSC demonstram significativamente melhor sobrevivência e preservação da laringe, independentemente de seus estágios clínicos, sugerindo a precisão de chemoradioselection [3, 5]. Recentemente, um conceito semelhante de chemoselection foi postulado por um grupo da Universidade de Michigan, facilitar uma melhor conservação de órgãos e sobrevivência [6-8]. Assim, se a eficácia da quimioterapia /radioselection é reforçada, mais melhorado a sobrevivência e a preservação de órgãos em doentes, em particular, aqueles com HNSCC avançada pode ser viável [1]. Com base nesta especulações de que o objetivo deste estudo é elucidar os mecanismos que atenuem os efeitos da chemoradioselection para desenvolver terapias clínicas eficazes direcionadas.

Durante a última década, tornou-se evidente que as células-tronco cancerosas (CSCs), que se caracterizam por um forte potencial de auto-renovação e propagação de tumor heterogêneo, pode ser a principal causa de refractoriness tumor às terapias convencionais quimioterapia /rádio [9]. Sobrevivência de um único CSC pode causar tumores re-crescimento e, mais importante CSCs têm sido propostos para constituir uma fonte de metástases distantes [9]. Em CECP, a forma padrão de CD44 (CD44s) foi identificado pela primeira vez como um marcador de superfície de CSCs pelo príncipe et al, e é expressa em 10% de células CECP [10]. No entanto, os resultados de um estudo imuno-histoquímico, que demonstrou que 60% -95% das células do epitélio normal da cabeça e pescoço e 60% -100% de células CECP CD44s expressas, lançaram dúvida sobre a credibilidade deste marcador [ ,,,0],11]. Além disso, a inoculação de um pequeno número de células CECP CD44s-negativos causados ​​desenvolvimento de um tumor no ratinho grandes quantidades imunocomprometidos [12, 13]. Por outro lado, através de uma série de

in vitro

e

in vivo

ensaios e experimentos com amostras clínicas, realizadas principalmente no laboratório do Prof. Saya na Universidade de Keio, variantes CD44 9 (CD44v9) , uma variante de splicing de CD44, emergiu como um novo marcador de stemness cancro numa variedade de tumores sólidos incluindo HNSCC [14-18]. Funcionalmente, CD44v9 aumenta os níveis intra-celulares de glutationa reduzida (GSH), quando acoplada com xCT, protegendo deste modo as células de ROS e stress oxidativo, que é uma das propriedades distintas das CSCs [14]. Este cenário bem explica o mecanismo pelo qual os CSCs pode sobreviver terapias quimio /rádio, porque estes agentes têm sido relatadas para exercer efeitos citotóxicos principalmente através da produção de ROS [14, 19]. Com efeito, em amostras de tumor CECP, imunomarcações duplos com involucrina, um marcador de diferenciação, e CD44v9 demonstrou claramente um padrão de coloração mutuamente exclusivos e a quimioterapia de indução, preferencialmente, matou-involucrina positiva células cancerosas, resultando na indução marcada de células-CD44v9 positivas. Os níveis de expressão de CD44v9 em linhas de células de carcinoma epidermóide foram associadas com o aumento dos níveis de GHS intracelular e resistência à cisplatina. Assim, os tratamentos de CD44v9 expressando linhas de células de carcinoma epidermóide com um inibidor da xCT, sulfassalazina, viabilidade celular significativamente inibido e o crescimento do tumor em ratinhos nus e maior sensibilidade à cisplatina [16].

Em vista destes achados, imunohistoquímica examinou os níveis de proteína CD44v9 expressão em amostras clínicas obtidas a partir de pacientes com CECP avançada tratados de acordo com a estratégia chemoradioselection à base de platina para determinar se CD44v9-expressando células CECP possuem stemness e causar refractoriness celular para chemoradioselection.

Materiais e Métodos

As características dos pacientes, sub-agrupamento e amostras de tecido

Através de uma pesquisa prontuário médico para os pacientes que foram tratados em nosso instituto de 1997-2008, foram selecionados 102 pacientes com este estudo que se reuniu os seguintes critérios: (1) aqueles com hipofaringe não tratado previamente, laringe ou pacientes orais câncer da cavidade com o estágio III ou IV tumor de acordo com a classificação UICC TNM (2002); (2) os doentes tratados com a estratégia chemoradioselection; (3) aqueles sem metástases à distância; e (4) aqueles com biópsia e /ou cirurgicamente os espécimes retirados que, aparentemente contidas frentes invasivas do tumor que eram adjacentes ou cercado por estroma associado ao tumor no nosso arquivo de tecido embebido em parafina fixado em formalina; Este último critério foi incluído porque pontuação de imunocoloração foi realizada nestas frentes de tumor, tal como descrito abaixo. Os HNSCCs relacionados a vírus (ou seja, nasofaringe e orofaringe) foram excluídos das análises de se concentrar sobre o papel biológico de CD44v9. Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Cancer Center Nacional Kyushu (Sem 2013-107). consentimento informado por escrito foi dado pelos participantes para os seus registos clínicos para ser utilizado neste estudo

As características dos pacientes são apresentados na Tabela 1. Todos os pacientes foram acompanhados por . 60 meses; o período médio de acompanhamento foi de 51,7 meses (variação: 2-151). A média de idade foi de 60,8 anos. Havia 27 pacientes com carcinoma de hipofaringe, 40 pacientes com carcinoma oral e 35 pacientes com carcinoma da laringe.

Os cursos de tratamento dos pacientes são mostradas na Fig. 1. Após 30-40 Gy de CCRT que compreende cisplatina (CDDP; 15 mg /m

2 /dia) ou parapalatin (ACBDC; AUC = 1 /dia) a partir de dia de 1 a 5 e irradiação com feixe externo (2,0 Gy /dia) 5 dias por semana, 30 pacientes foram classificados em grupo CRS (resposta clínica completa no sítio primário) e os restantes 72 pacientes foram classificados no grupo N-CRS

CCRT, quimioradioterapia concomitante.; CDDP, cisplatina; CBDCA, paraplatina; AUC, área sob a curva; e PND, planejado esvaziamento cervical.

Depois de um exame cuidadoso do arquivo de tecidos, foram selecionadas 30 amostras de biópsia de pacientes N-SIR e 30 de biópsia emparelhado e espécimes removidos cirurgicamente dos mesmos pacientes N-SIR. No entanto, os restantes 42 doentes no braço N-CRS não tinha amostras de biópsia próprios que preenchiam os critérios acima mencionados; portanto, apenas tecidos removidos cirurgicamente foram coletados a partir desta população. Consequentemente, um total de 132 (60 biópsia e 72 removidos cirurgicamente) amostras de tecidos foram processados ​​neste estudo.

A imuno-histoquímica e marcando

Anti-humana de anticorpos IgG monoclonal CD44v9 rato (RV3), que reconhece especificamente CD44v9 humano, foi gerado e gentilmente cedido pelo Prof. Saya, Universidade de Keio. Este anticorpo foi utilizado em estudos anteriores [15, 16, 18]. A imunocoloração para CD44v9 foi realizada como descrito anteriormente [15]. Em resumo, a Elite ABC Kit Vectastain Padrão (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) com um passo induzida aquecida-, antígeno-recuperação foi utilizado para realizar coloração imuno-histoquímica para CD44v9. O xileno foi usada para Desparafinar as secções, que foram re-hidratadas numa série de etanóis. recuperação de epítopo induzida pelo calor foi realizada no alvo Retrieval Solution (S-1699, DAKO, Tóquio, Japão) numa autoclave a 121 ° C durante 15 min. Após arrefecimento à temperatura ambiente durante 20 minutos, as lâminas foram cuidadosamente lavados em solução salina tamponada com Tris (TBS), pH 7,6. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada à temperatura ambiente por tratamento com peróxido de hidrogénio a 0,3% em metanol durante 30 min. As secções foram lavadas em TBS e, em seguida, transferida para um sistema de coloração Shandon Sequenza numa câmara humidificada (Thermo Fisher Scientific K.K., Yokohama, Japão). A ligação não específica de anticorpos foi inibida por incubação das secções de soro de coelho normal a 10%. As lâminas foram incubadas com anticorpo monoclonal de ratinho contra CD44v9 (RV3) (diluído a 1: 12.500; 0,2 � /ml) a 4 ° C durante a noite. Estas secções foram lavadas três vezes com TBS e incubadas durante 30 minutos em coelho biotinilado anti-IgG de rato (Dako, Tóquio, Japão) diluído 1: 200 em diluente de anticorpo. O metal reforçada Kit DAB Substrato (Thermo Scientific) foi usada para visualizar a expressão de CD44v9. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina. controlos negativos e positivos apropriados foram usados ​​em cada processo de coloração. Foram 2 tipos de controlos negativos: 1) não-imune de rato de controlo do isotipo IgG2a-negativa (Millipore, Billerica, MA, EUA), com a mesma concentração que o anticorpo primário e 2) tampão de diluição sem o anticorpo primário. tecido do cancro da mama foi utilizado como controlo positivo,

Considerando-se que as células basais no epitélio normal da coloração positiva das vias aerodigestivas superiores para mostrar CD44v9 (Fig. 2A), a contagem de células CD44v9-positivas foi realizada a as frentes de tumores invasivos que estavam adjacentes ou rodeadas por um estroma associado a um tumor de contar exclusivamente células cancerosas. Esta abordagem baseou-se também a especulação de que CSCs, incluindo aqueles de HNSCC, frequentemente reside no nicho localizada no estroma associado ao tumor [9, 20]. A análise microscópica foi realizada por 2 observadores independentes, incluindo um histopatologista especializado (KT) e o valor médio foi adoptada para a pontuação.

A intensidade da coloração obtida em células basais de epitélio normal foi utilizado como um controlo (A) . amostras de tumor demonstraram forte (B), moderada (C) e fraco (D) intensidades relativas ao controlo (A). positiva respectiva (E) e colorações negativos (F). Bar indica 200 um.

A pontuação coloração CD44v9 foi determinada pela soma da pontuação quantidade (ou seja, a percentagem de células cancerosas positivas) e o índice de qualidade (ou seja, a intensidade da coloração em comparação com a coloração de células basais normais) utilizando um método originalmente proposto por Bankfalvi et al [21]. As pontuações foram de quantidade definida da seguinte forma: 0%, nenhuma célula positiva; 1, 1% -25%; 2, 26% -75%; e 3, 76% -100%. Os índices de qualidade foram definidos da seguinte forma: -1, coloração homogeneamente fraco; 0, ou heterogeneamente semelhante de coloração forte; e 1, de forma homogénea ou semelhante de coloração forte. Com base neste sistema de pontuação, as amostras com contagens de -1~1 foram categorizados como CD44v9-negativo e amostras com contagens de 2~5 foram categorizados como CD44v9-positivo.

A classificação das respostas tumorais para CCRT

os efeitos terapêuticos da CCRT sobre os espécimes cirúrgicos foram avaliados de acordo com os critérios definidos no Regulamento Geral de Estudos clínicos sobre Câncer de Cabeça e Pescoço (5

th edição) editado pela Sociedade Japonesa de Câncer de Cabeça e Pescoço. Em resumo, os efeitos são classificados em 4 graus: Grau 0, nenhum efeito; Grau 1, leve efeito com ≤1 /3 células cancerosas ainda viável; Grau 2, efeito forte, com 1/3 células cancerosas viáveis; e Grau 3, resposta completa sem células viáveis.

Análise estatística

Um teste de Wilcoxon foi utilizado para analisar a relevância de expressão CD44v9 em amostras de biópsia para chemoradioselection (ie, CRS contra N -CRS). Foram analisadas as correlações entre os níveis de expressão de CD44v9 em amostras de biópsia e a indução CD44v9 e efeitos de tratamentos em espécimes retirados cirurgicamente empregando o teste exato de Fisher. Para comparar as taxas de doenças específicas de sobrevivência (DSS) entre os grupos específicos, curvas de Kaplan-Meier foram gerados, e um teste de Wilcoxon foi utilizado para analisar as diferenças estatísticas. modelo de riscos proporcionais de Cox univariada e multivariada foram utilizados para calcular os efeitos de fatores clinicopathlogical sobre as taxas de DSS. Os valores de

P Art 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todas as análises foram confirmados por um estatístico especializado (M.S.).

Resultados

colorações imunológicas

As fotos representativas de coloração CD44v9 são mostrados na Fig. 2. A distribuição das pontuações para as 60 amostras de biópsia foi o seguinte: marcar -1, 0; marcar 0, 13; marcar 1,15: escore 2, 24; marcar 3, 4; marcar 4, 4; e nota 5, 0. Por outro lado, os 72 espécimes cirúrgicos apresentou a seguinte distribuição: marcar -1,0; marcar 0, 11; pontuação, 1,30: marcou 2, 18; escore 3, 13; marcar 4, 0; e nota 5, 0. Consequentemente, a taxa de CD44v9-positivo foi de 53% (32/60) para as amostras de biópsia, e 43% (31/72) dos espécimes cirúrgicos. Três sítios primários, cavidade oral, faringe e laringe, demonstraram níveis de expressão semelhantes de CD44v9 na biópsia (

N

= 60,

P

= 0,39) e removido cirurgicamente (

N

= 72,

P

= 0,092) espécimes. Quando as pontuações de coloração foram comparados entre a biópsia emparelhados e espécimes cirúrgicos obtidos a partir dos 30 pacientes idênticos, 12 pacientes demonstraram um aumento na expressão de CD44v9 nas peças cirúrgicas (designado como o grupo induzida CD44v9), enquanto que nos restantes 18 doentes (designado como o grupo-CD44v9 não induzida), as pontuações foram diminuídas ou inalteradas. As amostras de biopsia foram emparelhados composto de tumores da hipofaringe (9), da cavidade oral (13), e laringe (9). De três em três locais demonstraram taxas similares de indução CD44v9 (38-44%).

cursos clínicos, respostas a CCRT e CCRT pós-operatória

curvas de Kaplan-Meier foram utilizadas (Fig. 3A) para analisar os resultados clínicos de pacientes com RSC e N-SIR (fig. 1). Consistente com os nossos resultados anteriores, os pacientes CRS demonstraram significativamente (

P Art 0,001) melhor sobrevida [3, 5]. Os 72 espécimes retirados cirurgicamente demonstrado G1 (

N

= 58) ou G2 (

N

= 14) respostas à indução CCRT. Entre os pacientes N-CRP 72, 54 foram submetidos pot-operatório CCRT. Não foi observada diferença significativa entre as curvas de Kaplan-Meier dos pacientes com ou sem CCRT pot-operatório (

P

= 0,507).

(B) Doença curvas de sobrevida específica com base no CD44 positividade v9 de amostras de biópsia (n = 60) obtidos de 30 pacientes chemoradioselected (CRS) e 30 pacientes não chemoradioselected (N-CRS). curvas de sobrevida específica (C) de doenças com base na CD44 v9 positividade das amostras de biópsia obtidos de 30 pacientes N-SRC.

Associação de local do tumor primário, com chemoradioselection e prognóstico

Em seguida, examinou se o local do tumor primário afetado a sobrevivência chemoradioselection e pacientes. Os cânceres da cavidade oral demonstrou taxa significativamente menor de chemoradioselection (1/40, 3%) do que orofaringe (14/27, 52%) e laringe (15/35, 42%), de acordo com um consenso geral de que o câncer de cavidade oral é relativamente resistente à quimioterapia /radiação entre HNSCCs [22]. No entanto, no método de Kaplan-Meier do espécime removidos cirurgicamente (

N

= 72), a taxa de DSS-5 anos de cancro da cavidade oral (50%) foi semelhante (P = 0,80) para aqueles da hipofaringe (65%) e laringe (55%).

a expressão de CD44v9 nas amostras de biópsia

Para avaliar o significado clínico do efeito da expressão CD44v9 intrínseca em chemoradioselection e os pacientes de sobrevivência, comparamos os níveis de expressão de CD44v9 em 60 amostras de biópsia não tratados obtidos a partir de CRS (

N

= 30) e N-CRS (

N

= 30) pacientes. Não houve diferença significativa nos níveis de expressão de CD44v9 entre a CRS e as amostras N-CRS (

P

= 0.8289). Além disso, a positividade CD44v9 não afetou as curvas de Kaplan-Meier DSS quer no SIR mais N-SRC coorte (

P

= 0,64; Fig. 3B) ou na coorte de N-CRS (

P

= 0,97; Fig. 3C). Resultados semelhantes foram obtidos com o modelo de risco univariada Cox proporcional (HR: CI 1.086, 95%: 0,68-1,72;

P

= 0,72). Estes resultados sugerem que os níveis de expressão de CD44v9 intrínseca nas amostras de biópsia não são úteis como um preditor de chemoradioselection ea sobrevida do paciente.

A expressão de CD44v9 nos espécimes retirados cirurgicamente

Tendo em conta as conclusões anteriores, analisamos se os níveis de CD44v9 induzida CCRT expressão foram correlacionados com os resultados desfavoráveis ​​nos espécimes retirados cirurgicamente obtidas de pacientes N-SIR. A base para esta análise foi a observação prévia de que a indução quimioterapia aparentemente melhorada o subconjunto de células que expressam CD44v9-nos tumores CECP [16]. Em pacientes N-CRS, o grupo CD44v9-positivo (

N

= 31) demonstraram significativamente (

P

= 0,008) pior DSS que o grupo CD44v9-negativas (

N

= 41) (Fig. 4A). Uma vez que foi confirmado que o local do tumor primário não afectou o DSS como mencionado acima, foram examinados os efeitos de quatro factores, isto é, T, N, respostas tumorais para CCRT, e CD44v9 positividade na taxa de pacientes por DSS tanto univariada e multivariada com um modelo de riscos proporcionais de Cox (Tabela 2). As análises univariada aumentou significativamente riscos de morte específica da doença em pacientes CD44v9-positivo (HR: 2.033, IC 95%: 1,071-3,859;

P

= 0,03) e com o avançado N (HR: 3.091, 95 CI%: 1,045-9,060;

P

= 0,0397). Em análises multivariadas, CD44v9 positividade (HR: 3,145, IC 95%: 1,235-8,008,

P

= 0,0163) e avançado estágio N (HR: 3,525, IC 95%: 1,054-9,060,

P

= 0,0228) foram significativamente correlacionados com mau prognóstico (HR: CI 3.140, 95%: 1,230-8,017;

P

= 0,0167), o que sugere que entre esses quatro fatores, o nível de expressão de CD44v9 é um biomarcador útil na população N-CRS, juntamente com estágio avançado N.

(B) as curvas de sobrevida Diseasespecific de 30 pacientes N-CRS que tinha emparelhado biópsia e cirurgicamente removidos amostras. Os pacientes foram divididos em 2 grupos de acordo com seus níveis de expressão CD44v9 antes e após quimioradioterapia concomitante.

Comparação de amostras pareadas

Em seguida, analisamos se o CD44v9-positividade na amostra de biópsia correlacionaram com a indução de CD44v9 em espécimes removidos cirurgicamente. Curiosamente, foram observados aumentos de pontuação CD44v9 predominantemente (

P

= 0,0236) em pacientes com amostras de biópsia CD44v9-negativos (64%, 14/09) do que pacientes CD44v9-positivo (19%, 16/03) . Os níveis de expressão de CD44v9 nas amostras de biópsia não se correlacionou com a graduação da resposta do tumor ao CCRT avaliadas nos espécimes retirados cirurgicamente emparelhados (

P

= 0.3992). Nós ainda comparado curvas DSS entre o grupo induzida CD44v9 (

N

= 12) e grupo não-induzida CD44v9 (

N

= 18) e descobriu que o ex tinha uma forma significativa (p = 0,04) pior taxa de DSS (Fig. 4B).

em conjunto, estes resultados indicam fortemente que a expressão induzida por CCRT CD44v9 em vez de expressão intrínseca é um obstáculo terapêutica para chemoradioselection.

Discussão

durante a última década, o pilar do tratamento para HNSCC avançado deslocou-se a ressecção cirúrgica radical inicial combinado com radioterapia pós-operatória a dose intensificação de tratamento, que são destinadas principalmente a preservação de órgãos [23, 24]. Esta tendência tem sido marcadamente avançou pela recente introdução de CCRT (por exemplo, os ensaios clínicos conduzidos pelo Radiation Therapy Oncology Group (RTOG)) e terapia sequencial compreendendo a quimioterapia de indução e CCRT (por exemplo, Imposto 324 protocolos), que resultaram em novas melhorias na preservação de órgãos, o controle loco-regional, e sobrevivência [25-28]. No entanto, como indicado por estudos recentes ou comentários, estes protocolos parecem ter atingido o limite superior de tolerância humana de toxicidade aguda e sub-aguda, que causaram disfunção laryngoesophageal frequente e possíveis mortes relacionadas com o tratamento [29-31]. Assim, afigura-se necessário diminuir a intensidade excessiva atual de tratamento para HNSCC avançada, otimizando a relação terapêutica. Por outro lado, temos utilizado uma estratégia chemoradioselection para aproveitar as vantagens completas de ressecção radical e CCRT, evitando as toxicidades agudas e tardias graves. Em nossos estudos anteriores, os pacientes CRS demonstraram significativamente melhor sobrevida com uma laringe funcional do que pacientes N-CRS [3, 5], de acordo com os resultados do presente estudo. Estes resultados sugerem que a estratégia chemoradioselection pode ser uma abordagem promissora para HNSCC avançado, que pode optimizar a razão terapêutica. No entanto, é óbvio que a percentagem de pacientes CRS deve ser aumentado para melhorar ainda mais as taxas de conservação de órgãos e a sobrevivência do paciente. Detectar e alvejar moléculas que contornar os efeitos da chemoradioselection parece ser uma estratégia altamente eficaz para atingir esse objetivo [1]. Como mencionado acima, dentro do quadro conceitual atual da biologia do câncer, CSCs são provavelmente as principais causas de refractoriness celular para CCRT; Portanto, espera-se que os CSCs estar relacionado com o mecanismo que atenua a eficácia de chemoradioselection [1, 9].

Neste contexto, a hipótese de que em HNSCC avançada a expressão de um marcador de CSC putativo, CD44v9, pode ser responsável pela resistência celular a chemoradioselection. Os nossos dados demonstram claramente que a expressão de CD44v9 estava correlacionada com resultados pobres de doentes tratados com a estratégia chemoradioselection, que confirmaram a nossa hipótese. Além disso, forneceu a primeira evidência clínica de que CD44v9 pode ser um biomarcador útil e, consequentemente, um alvo molecular explorável no tratamento de HNSCC avançado. Além disso, entre outros factores clinicopatológicas que foram utilizados como marcadores de prognóstico convencionais de HNSCC, a expressão do CD44v9 estava significativamente relacionada com o mau prognóstico de doentes nas análises multivariadas, juntamente com fase avançada N (Tabela 2). É de notar que CD44v9 demonstrou a menor

P

-valor de estágio N. No entanto, nossas descobertas que CCRT induzidas expressão CD44v9 em vez de expressão intrínseca teve valor prognóstico devem ser interpretados com cuidado. Presumivelmente, expressão CD44v9 por si só não é suficiente para indicar a propriedade de stemness em células cancerosas; CD44v9-expressando células de cancro são susceptíveis de ser composto por CSCs e não-CSCs. Deste modo, o significado clínico da expressão CD44v9 na estratégia chemoradioselection poderia ser explicada por, pelo menos, 3 cenários, tal como representado na Fig. 5. Quando os tumores não contêm CD44v9 expressando CSCs, morte celular total em CCRT é viável (isto é, CRS; A Fig. 5A). Por outro lado, quando os tumores contêm CSCs CD44v9 expressam eles podem sobreviver CCRT (isto é, N-CRS; A Fig. 5B). Além disso, existe uma possibilidade de que CCRT, funcionando como uma pressão selectiva, pode induzir em stemness CD44v9-expressando não CSCs e levar a sobrevivência de células do cancro (isto é, N-CRS; A Fig. 5C). Estes sobreviventes seletivos de CSCs são consideradas fontes de invasão local, bem como metástases regionais e à distância, que depois pioram os desfechos dos pacientes N-SIR. As descobertas anteriores de que a indução quimioterapia aumenta a população de células CD44v9 expressando no câncer oral [16], quando tomados em conjunto com a nossa constatação de que a expressão CD44v9 induzida por CCRT correlaciona-se significativamente com mau prognóstico, apoiar a nossa teoria de que a quimioterapia /radioterapia, em um determinado circunstâncias, pode funcionar como uma força de limpeza seletiva ou pressão seletiva que impulsiona a evolução HNSCC, levando ao surgimento de CSCs pluripotentes [1]. Estes cenários (Fig. 5) parecem explicar a razão por que não o intrínseco, mas a expressão CD44v9 induzida por CCRT foi útil como um biomarcador na nossa estratégia chemoradioselection. Nas amostras de biopsia, que não é possível detectar especificamente a população CD44v9-expressar ou CSC-CD44v9 não expressando CSC que, eventualmente, depois de adquirir stemness CCRT: ou seja, para distinguir o padrão B e C a partir de A. Por outro lado, no amostras removidos cirurgicamente dos pacientes N-CRS submetidos CCRT, as células CD44v9 expressam é suposto ser altamente enriquecido por CSCs, aumentando o valor da expressão CD44v9 como um biomarcador.

(a) CD44v9 expressando não -CSCs são sensíveis a CCRT. Intrínsecas CSCs CD44v9 expressando (B) ou CSCs CD44v9 expressam induzida por CCRT (C) pode sobreviver CCRT. Estes CSCs CD44v9-expressam são considerados altamente invasivo e metastático. CSC, células-tronco do câncer; CCRT, quimioradioterapia concomitante; CRS, chemoradioselected; e N-CRS, não chemoradioselected.

A sulfasalazina é um inibidor específico bem caracterizado de transporte cistina xCT mediada [17] e, por conseguinte, espera-se privar CD44v9-expressando células de cancro a partir do mecanismo de defesa contra ROS. De fato, a administração de sulfassalazina reforçada a actividade intracelular de ROS em

in vivo

ensaios [17] e linhas de células de CECP sensibilizados a CDDP [16]. Portanto, espera-se que a terapia de combinação de sulfassalazina e CCRT pode aumentar significativamente os efeitos da chemoradioselection sensibilizando ambos os CSCs CD44v9-expressam intrínsecas e induziu-CCRT (Fig. 5A e 5B) para CCRT, e melhorar os resultados dos doentes com doença avançada HNSCC. Dado que a sulfassalazina é uma droga disponível no mercado que tem sido muito utilizado para tratar pacientes com colite ulcerosa e artrite reumatóide, os ensaios clínicos deste protocolo estão agora sob contemplação.

Em conclusão, CD44v9 segmentação pode fornecer uma nova abordagem para terapia para HNSCC que podem potenciar a eficácia de chemoradioselection e melhorar a preservação de órgãos e sobrevivência clinicamente viável CSC-alvo.

Agradecimentos

os autores agradecem Prof. Hideyuki Saya por nos fornecer com o anticorpo CD44v9 ( RV3) e por seus comentários construtivos sobre este estudo.