Abstract

modulação Autophagy é agora reconhecida como uma potencial abordagem terapêutica para o câncer (incluindo câncer colorretal), mas os mecanismos moleculares que regulam a autofagia em resposta ao estresse celular ainda não são bem compreendidos. MicroRNAs (miARNs) foram encontrados para desempenhar papéis importantes no controle muitas funções celulares, incluindo crescimento, metabolismo e resposta ao estresse. A importância fisiológica da interligação miRNA-autofagia está apenas começando a ser elucidado. tecnologia de microarray miARN facilita a análise de expressão de miARN global em certas situações. Neste estudo, exploramos o perfil de miARNs expressão durante a resposta de células de cancro do cólon humano (HT29s) a 5-FU e tratamento de nutrientes inanição usando análise de microarray miARN. A alteração da expressão do miARN mostrou o mesmo padrão sob ambas as condições foi ainda testemunhado por qRT-PCR em três linhas celulares de cancro do cólon humano. Além disso, a previsão de bioinformática de genes alvo, análise de caminho e análise de redes de genes foram realizados para melhor compreender o papel destes miRNAs na regulação da autofagia. Foram identificados e seleccionados quatro miRNAs regulados negativamente incluindo HSA-miR-302a-3p e 27 miRNAs regulados positivamente sob estas duas condições como tendo potencial para atingir genes envolvidos na regulação da autofagia em células cancerígenas do cólon humano. Eles têm o potencial de modular a autofagia em quimioterapia à base de 5-FU no cancro colorectal

Citation:. Hou N, Han J, Li J, Liu Y, Qin Y, Ni L, et al. (2014) Profiling MicroRNA em células cancerígenas do cólon humano durante o 5-fluorouracil Induzida por autofagia. PLoS ONE 9 (12): e114779. doi: 10.1371 /journal.pone.0114779

editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 31 Julho, 2014; Aceito: 13 de novembro de 2014; Publicação: 19 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Hou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (concessão No. 31.100.969) e da Fundação de Pesquisa Científica para o Devolvido Overseas Estudiosos chineses, Ministério de Educação do Estado (2013-09) para Dr. Hou. Ele também foi apoiado por uma bolsa da National Natural Science Foundation da China (concessão No. 81172358) com o Dr. Li. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que nenhum interesse competindo existem

Introdução

5-fluorouracilo (5-FU) quimioterapia adjuvante baseado tem sido amplamente utilizada como o convencional, para o tratamento de cancro colo-rectal (CRC). No entanto, por causa da resistência ao 5-FU, em muitos pacientes, novas estratégias terapêuticas estão a ser exploradas [1]. A autofagia é um processo eucarióticas evolutivamente conservada que mantém a homeostase intracelular, eliminando proteínas desnecessárias e organelas danificadas ou envelhecidas [2]. Nas últimas décadas, tem evidências acumuladas mostram que autofagia é amplamente associados com o cancro [3]. Ao manter a homeostase celular em células saudáveis, autofagia impede a transformação tumoral. Autophagy também é importante para a progressão do tumor, permitindo que as células de tumor para sobreviver stress ou anoikis metabólico, manter a sua adaptação ao metabolismo reprogramado, apoiando o desenvolvimento do tumor por indução de dormência e manutenção da sobrevivência e auto-renovação das células estaminais do cancro. Além disso, porque autofagia desempenha um papel essencial na determinação de como as células tumorais respondem a terapia, a modulação autofagia é reconhecido como um potencial abordagem terapêutica do cancro em [4], [5]. Autophagy parece representar um mecanismo válido de resistência contra radioterapia e quimioterapia. Os nossos estudos anteriores mostraram que a inibição da autofagia por 3-metiladenina (3-MA) ​​ou ARN de interferência pequena segmentação Atg7 (Atg7 siARN) aumentada a eficácia de 5-FU por intensificar a apoptose no cancro do cólon humano [6], [7]. A autofagia é altamente conservado e bem regulamentado. No entanto, os mecanismos moleculares que regulam a autofagia em resposta ao estresse celular ainda não são bem compreendidos.

Os microRNAs (miRNAs), 18-25 nucleótidos de comprimento, são endógenos RNAs pequenos, não codificantes que regulam a expressão de seus genes-alvo , inibindo a tradução ou a clivagem de ARN mensageiro (ARNm), principalmente através de interacção em regiões não traduzidas a 3 ‘(UTRs) dos mRNAs alvo [8]. MiRNAs pode, simultaneamente, regular uma multidão de metas e redes biológicas. Por outro lado, vários miARNs diferentes podem ligar-se cooperativamente e controlar um único ARNm alvo. MiRNAs foram encontrados para desempenhar papéis importantes no controle de diversas funções celulares, incluindo o crescimento, a diferenciação, o metabolismo e resposta ao stress e fornecida uma clara vantagem de um ponto de vista clínico [9] – [11]. Em anos recentes, alguns miARNs têm sido estudados como mediadores de regulação autofagia. MiRNA-30a pode sensibilizar células de hepatoma à cisplatina, visando a autofagia beclin-1-mediada [12]. MiARN-101 tem sido demonstrado ser como um potente inibidor da autofagia induzida por etoposido ou rapamicina em células de cancro da mama [13]. Jegga et ai. também proposto que miARN-130, miARN-98, miARN-124, miARN-204 e miARN-142 tem funções reguladoras potenciais no processo autophagic com base na análise computacional [14]. A importância fisiológica do interligação miARN-autofagia está apenas a começar a ser elucidados.

Devido ao grande número de miARN, a tecnologia de microarray miARN tem sido amplamente aplicada para determinar a expressão de miARN global em certas situações [15]. Neste estudo, exploramos o perfil de expressão miARNs na resposta de células humanas cancerígenas do cólon (HT29s) para o tratamento com 5-FU, utilizando análise de microarray miARN. Para dar prioridade às miARNs que se correlacionaram com autofagia, autofagia também foi induzido por um segundo meio nutriente (de fome), e a expressão de miARN também foi observada neste contexto. A expressão miRNA alterada mostrou um mesmo padrão em ambas as condições foi ainda testemunhado por qRT-PCR em três linhas celulares de cancro do cólon humano. Além disso, a previsão de bioinformática de genes alvo, análise de caminho e análise de rede ontologia gene também foram realizados para melhor compreender o papel destes miRNAs na regulação da autofagia. Foram identificados e seleccionados quatro miRNAs reprimidos e 27 miRNAs regulada mediante tratamento com 5-FU e fome em células cancerígenas do cólon humano. Estes 31 miRNAs têm os genes-alvo previstos no regulamento da autofagia, incluindo genes do núcleo autofagia e reguladores de autofagia e têm o potencial para modular a autofagia na quimioterapia 5-FU baseada no CRC.

Materiais e Métodos

Materiais

5-FU foi adquirido da Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). anticorpo policlonal LC3 foi comprado de MBL (MBL, Nagoya, Japão). Os anticorpos anti-p62 e anti-β-actina foram obtidos da Sigma, e o anticorpo foi de mTOR de Cell Signaling Technology (tecnologia de sinalização celular, Danvers, MA).

Cultura celular e tratamento

HT29, HCT116 e células do carcinoma colo-rectal DLD1 humana foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection, gentilmente cedido pelo Prof. Kuwano e cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%, a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2/95% de ar com meio muda a cada dois dias. As células em fase mid-log foram utilizados neste estudo. Para o tratamento com 5-FU, HT29s foram tratadas com 5 uM de 5-FU durante 24 h. Para inanição de nutrientes, HT29s foram incubadas em tampão de Krebs-Ringer [16] (120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, NaHCO 24 mM

3, glicose 5,6 mM, CaCl 2 mM de

2, pH 7,6) a 37 ° C durante 7 h.

Medição da viabilidade celular e a apoptose

a viabilidade celular foi determinada utilizando um kit de contagem celular 8 (CCK-8). As células foram semeadas em placas de 96 poços de microtitulação de fundo plano a uma densidade de 1 × 10

3 células por poço. Após o tratamento, 10 ul da solução de CCK-8 foi adicionado a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 1 h. A absorvância da solução foi lido espectrofotometricamente a 450 nm com uma referência a 650 nm utilizando um leitor de placas de microtitulação (BIO-TEK ELX800). A viabilidade celular foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: viabilidade celular (%) = A450 (amostra) /A450 (controlo) × 100

apoptose celular foi ensaiada utilizando o kit de detecção de apoptose.. Resumidamente, as células foram colhidas e coradas com anexina V -FITC (Anexina V) e iodeto de propídio (PI). A apoptose foi definido pela anexina V

+ /PI

-. (Início de apoptose) e anexina V

+ /PI

+ (final de apoptose), conforme determinado por FACScan (Becton Dickinson)

Análise de autofagia

Análise de autofagia foi realizada principalmente por imunofluorescência e immunoblotting para cadeia de proteína 1B-luz associada a microtúbulos 3 (LC3), como descrito anteriormente [7], [16]. Para determinar a imunofluorescência de LC3, células na câmara de corrediça foram fixadas com paraformaldeído a 4% e permeabilizadas com 0,05% de Triton X-100. Após o bloqueio, as células foram incubadas com um anticorpo anti-LC3 (1:500 diluição) a 4 ° C durante a noite e, incubou-se com anticorpo anti-coelho conjugado 488-Alexa Fluor após a lavagem. As lâminas foram montadas e examinadas utilizando um microscópio de fluorescência (Eclipse TE2000-L, Nikon). A coloração com 0,1 ug /ml de 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) foi realizada para identificar núcleo. Para imunotransferência de LC3, 20 ^ g de ligado de células foi separado em um 5-20% de Tris-Tricina Pronto gel de SDS-PAGE (Bio-Rad) para drenagem de difluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana. A membrana foi manchada bloqueados e incubados com anticorpo anti-LC3 (1:1000 diluição). As bandas imunorreactivas foram visualizadas por quimioluminiscência avançada utilizando anticorpo anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (diluição 1:5000). p62 e imunotransferência mTOR (1:1000 diluições ambos) também foram realizados para avaliar o estado autofagia.

Isolamento de ARN e miARN microarray

O ARN celular total foi colhido utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ) e um mini-kit de miRNeasy (Qiagen, GmbH, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Exiqon LNA MicroRNA matriz humana, incluindo todos os miRNAs maduros humanos (banco de dados 18.0) foi utilizado para o perfil de expressão miRNA e executada por Kangcheng Bio-Tech Inc. (Xangai, China). Nós fizemos a apresentação de nossos dados de microarranjos de Gene Expression Omnibus, e o número de acesso é GSE61943. Em resumo, as amostras de ARN (1 ug) foram marcadas utilizando um kit de marcação de miRCURY Hy3 e hibridado na matriz miRCURY LNA (v.18.0). Após a lavagem, as lâminas foram digitalizados usando um scanner de microarray Axon GenePix 4000B, ea intensidade crua de que a imagem foi lido e analisado usando o software 6.0 pro GenePix (Axon). Quatro pontos replicados de cada sonda no mesmo slide foram em média. dados de miARN expressas foram normalizados utilizando a normalização mediana. Após a normalização, miRNAs diferencialmente expressos foram identificados através Fold Mudança de filtragem ( = 2)

análise em tempo real qRT-PCR para a expressão miRNA

quantitativa transcrição reversa da polimerase reação em cadeia (qRT-. PCR) foi realizada para validar os dados da matriz de miRNA. miARNs maduros foram transcrito reversamente em ADNc por haste-laçada de transcrição reversa utilizando o estojo de reagente PrimeScript RT (Takara Bio, Shiga, Japão) e iniciadores específicos de haste-laçada, como mostrado na Tabela 1. qRT-PCR para cada miARNs foi realizada utilizando FastStart Essencial ADN verde mestre (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha) em uma máquina lightcycle96 (Roche) segundo as instruções do fabricante. Os iniciadores utilizados são listados na Tabela 1. Cada amostra foi analisada em triplicado. Os níveis de expressão de miARN foram normalizados para e quantificado por U6 ARN. quantificação relativa foi calculada usando a 2

(- ΔΔCt). método

Alvo previsão e função de análise

Os genes alvo dos miRNAs foram previstas usando a interseção de duas grandes on-line de miRNA algoritmos de previsão alvo, TargetScan (https://www.targetscan.org) [17] e PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de) [18], ou TargetScan e miRDB (http: //mirdb .org) [19], se não havia dados para alguns miRNAs em PicTar.

DIANA-miRPath v2.0 (https://www.microrna.gr/miRPathv2) foi aplicado para analisar as principais funções do miARNs [20]. Geralmente, miARN e informações relacionadas com a via foi obtido a partir miRBase e a Enciclopédia de Quioto de genes e genomas v58.1 (KEGG), respectivamente. Um teste exato de Fisher unilateral foi utilizada para identificar os caminhos KEGG enriquecido com alvos de miRNAs específicos, e foi calculado a taxa de descoberta de falsas (FDR) para corrigir o valor p. Enriquecimento fornece uma medida da importância da função; como o enriquecimento aumenta, a função correspondente é mais significativa.

Gene ontologia (GO) análise de rede também foi utilizado para analisar a função principal dos genes alvo para descobrir e a rede reguladora miARN-gene com base nas processos biológicos e funções moleculares. O plugin CyTargetLinker em Cytoscape (https://projects.bigcat.unimaas.nl/cytargetlinker) foi usado para construir uma rede integradora das interações miRNA-alvo para os seis miRNAs identificados em nosso estudo [21], [22]. Os alvos validados para cada miRNA foram obtidos a partir mirTarBase, e as metas previstas foram obtidos a partir TargetScan.

A análise estatística

Todos os dados foram expressos em média ± desvio padrão (SD). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS versão 17.0 do software. p . 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

5-FU diminuiu a viabilidade das células cancerígenas do cólon humano HT29,

O efeito da quimioterapia principal CRC, 5-FU, em células de cancro do cólon humano HT29 foi confirmada por um ensaio de CCK-8. 5-FU (0~500 uM) produziu uma inibição dose-dependente do tempo e da viabilidade das células que atingiu 64,20% e 42,20% depois de 5 uM de tratamento com 5-FU durante 24 h e 48 h, respectivamente (Fig. 1). 5-FU pode ter muitos efeitos nas células HT29. A citometria de fluxo de anexina V e coloração de PI foi utilizada para detectar a apoptose na nossa experiência. Não têm pouca apoptose nas células HT29 pelo tratamento 5 uM de 5-FU durante 24 h (S1 Fig.).

HT29 células foram incubadas com diferentes concentrações (5 uM e 25 uM) de 5-FU por 12, 24 e 48 h. A viabilidade celular foi medida por ensaio de CCK-8. Os dados são apresentados como a média ± DP.

5-FU induziu a activação de autofagia em células HT29

Activação de autofagia por 5-FU em células HT29 foi detectada por imunofluorescência LC3 . Nas células de controlo, a distribuição de LC3 apresentou um padrão difuso (citoplasma, LC3- I). o tratamento com 5-FU a distribuição alterada LC3 para muitos pontos grossos e coloração pontilhada (Fig. 2A), e como o tempo aumentado, os pontos tornou-se mais intensa. Os pontua LC3-positivas (LC3-II) representam autofagossomas. imunotransferência LC3 também foi usado para observar a autofagia (Fig. 2C). LC3-II (16 kDa) foi induzida por 5 uM tratamento com 5-FU durante 24 h. Como um mecanismo de indução característica de induzir autofagia, inanição nutriente também foi realizada (Fig. 2B). A inanição feita a coloração mais intensa LC3, e em 7 h, havia alguma coloração pontuada. Além disso, a intensidade de LC3 foi aumentada por inanição durante 7 h. À medida que o indicador de fluxo autofagia, p62 foi reduzida tanto por tratamento com 5-FU e fome (Fig. 2C). Depois de 5 uM de tratamento com 5-FU durante 24 horas, a viabilidade celular das células HT29 foi inibida, autofagia foi activado, e praticamente não houve apoptose. Em seguida, foi realizada perfil de expressão global, por meio de ensaios de microarranjos de miARN em ambas as células HT29 em jejum durante 7 h e HT29 células tratadas com 5 uM de 5-FU durante 24 h.

HT29 células foram tratadas com 5 uM de 5-FU ou não. A activação de autofagia foi observada por imunofluorescência LC3 (A). células HT29 foram privadas em tampão de Krebs-Ringer ou não. A activação de autofagia foi observada por imunofluorescência LC3 (B). Coloração DAPI foi realizada para identificar núcleo. LC3, p62 e imunotransferência mTOR foi realizada utilizando os lisados ​​de células HT29 tratados por 5? M de 5-FU durante 24 h ou não, e fome durante 7 h ou não (C). Os dados são a representativos de três experiências independentes. Bar, 20 mm.

Identificação de expressão miRNA alterada por 5-FU e fome em células HT29

Após a digitalização microarray e normalização, 124 de 1900 miRNAs humanos maduros foram identificados como regulada por inanição durante 7 h em células HT29, e 56 miRNAs foram reprimidos. Com 5 uM de tratamento com 5-FU por 24 h, havia 302 miARNs regulados positivamente e 86 miARNs regulados negativamente em células HT29. Para priorizar os miRNAs correlacionados com as mudanças na autofagia, os miRNAs que mostram o mesmo padrão alterada sob tratamento com 5-FU e fome (um segundo meio padrão de indução de autofagia) foram considerados mais propensos a ser envolvido na regulação da autofagia. Os miRNAs que mostram o mesmo padrão alterada sob estas duas condições foram 94 miRNAs regulada e 22 miRNAs regulados negativamente (S1 tabela). A previsão de genes alvos regulados por miRNA é um passo necessário para entender as funções de um determinado miRNA. A interseção de dois programas diferentes (algoritmos) foi relatado o aumento da sensibilidade de previsão. TargetScan identifica alvos com complementaridade conservada à semente (nucleótidos 2-7) da miARN [23]. Utilizou-se o cruzamento de TargetScan e PicTar para prever os genes-alvo dos miARNs alterados. Se não havia nenhum dado na PicTar, miRDB foi usada no lugar de PicTar. No geral, nós identificados e seleccionados quatro miRNAs reprimidos, hsa-miR-302a-3P, hsa-miR-548ah-5p, hsa-miR-133b e hsa-miR-323a-3P e 27 miRNAs regulada, hsa-miR-203a , hsa-miR-99b-5p, hsa-miR-195-5p, HSA-deixou-7c-5p, hsa-miR-320d, hsa-miR-301a-3p, vmiR-30e-5p, hsa-miR-374c -5p, hsa-miR-181.º-5p, HSA-let-7G-5p, hsa-miR-513b-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-19a-3P , hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-582-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-30a-5p, HSA -miR-23a-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-98-5p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-93-5p e hsa-miR -320c, como tendo os genes-alvo previstos envolvidas na regulação da autofagia, que incluem genes do núcleo autofagia e reguladores de autofagia (Tabela 2).

Validação de dados de microarranjos utilizando qRT-PCR em HT29, HCT11 e as células DLD1

Para validar os dados de microarrays, foi realizada qRT-PCR em dois subregulado (HSA-miR-302a-3p e tem-miR-548ah-5p) e quatro miRNAs regulada (HSA-miR- 30a-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-195-5p e HSA-deixou-7c-5p) no 5-FU tratadas ou células HT29 esfomeados. Uma vez que o cancro do cólon é heterogénea, a expressão alterada destes miARNs foi também determinado em outras linhas de células derivadas de dois cancerosas do cólon humano HCT116 e, DLD1. Verificou-se que de acordo com os resultados de análise de microarray miARN a expressão destes miARNs alterou significativamente com base nas suas leituras de qRT-PCR (Fig. 3).

Três tipos de linhas celulares de cancro do cólon humano, HT29 (A ), DLD1 (B) e HCT116 (C), foram tratadas como descrito na Fig. 2. qRT-PCR foi realizada para validar a alteração da expressão de HSA-miR-302a-3p, HSA-miR-548ah-5p, HSA-miR-30a-5p, HSA-miR-23-3p, HSA-miR -195-5p e HSA-deixou-7c-5p menores de 5-FU tratamento (5-FU) e fome. Os dados são apresentados como a média ± DP. * P 0,05. As experiências foram repetidas três vezes com resultados reprodutíveis.

Análise de Caminho e GO análise de rede revelou a miRNAs-autofagia interligação

Para obter insights sobre as funções desses miRNAs, DIANA-miRPath foi usado para analisar vias KEGG influenciadas por estes 31 miRNAs (Fig. 4). Como resultado, os elevados vias enriquecimento significativo dos quatro miARNs downregulated incluiu a via de sinalização MAPK, que é relatado para participar de forma positiva na regulação da autofagia [24] (Fig. 4A). Mais interessantemente, entre os altos vias enriquecimento significativo dos 27 miARNs regulada positivamente, a via de sinalização de mTOR foi significativamente identificado por estes miARNs (Fig. 4B, 4C e 4D). Consistentemente, o nível de proteína de mTOR foi diminuída sob estas duas condições (Fig. 2C). Além disso, o miRNA-mRNA análise de rede gene integrado estes miRNAs e GOs descrevendo as interações de miRNA e genes go-relacionados que utilizam software Cytoscape (Fig. 5).

DIANA-miRPath v2.0 foi aplicado para analisar a principais funções dos selecionados 31 miRNAs (a, os quatro miRNAs reprimidos; B, miRNAs regulada mais de quatro vezes menores de 5-FU tratamento e fome; C, miRNAs regulados positivamente entre duas e quatro vezes em duas condições; D, miRNAs regulada mais de quatro vezes e entre dois e quatro vezes). O eixo vertical é a categoria via KEGG, eo eixo horizontal é o logaritmo negativo da

p

valor (-log

p

), que representa o significado das vias.

As redes de integração foram criados usando software Cytoscape. Cada rede inclui dois tipos de nós, miRNAs individuais (círculos vermelhos) e os seus alvos de mRNA previstas (hexágono rosa), obtidos a partir de duas bases de dados públicas diferentes (miRTarBase e TargetScan). O gráfico mostra que os alvos de mRNA aparecer em dois bancos de dados, que são identificados pela cor das setas de ligação, miRTarBase (vermelho) e TargetScan (preto).

Discussão

5 quimioterapia à base de -FU é o mainstream do tratamento adjuvante do CRC. Autophagy modulação tem sido considerada como uma estratégia potencial para implementar a quimioterapia na terapia de tumores [4]. MiRNAs desempenham papéis importantes no controle de funções celulares e tem sido referida como estando envolvida na regulação da autofagia nos últimos anos [25]. Na nossa experiência, a indução de autofagia foi confirmada em células HT29 por tanto o tratamento com 5-FU e fome nutriente. Usando a análise de miRNA microarray, qRT-PCR, e bioinformática, foram identificados e selecionados quatro miRNAs regulados negativamente incluindo HSA-miR-302a-3p e 27 miRNAs regulados positivamente incluindo HSA-miR-30a-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa- miR-195a-5p, hsa-miR-99b-5p e HSA-deixou-7c-5p sob estas duas condições como tendo potencial para atingir genes envolvidos na regulação da autofagia (Tabela 2). Outras análises funcionais destes miARNs necessita de ser realizada.

evidências acumuladas sugerem que a autofagia desempenha papéis importantes na terapia de tumores tumorigénese e [3]. É tanto pode inibir ou promover a tumorigénese, dependendo da fase do tumor. Como para a terapia de tumores, autofagia parece mediar o efeito de agentes anti-cancro, como a inibição da autofagia suprime a sua eficácia terapêutica. Autophagy também pode ser activada como uma resposta pro-sobrevivência para promover a resistência à terapêutica para a terapia citotóxica. E a inibição da morte celular aumenta autofagia droga ou radiação induzida como já relatado [6], [7]. Moléculas envolvidas na regulação do processo de autofagia surgiram como alvos promissores para terapias anticâncer inovadoras [4].

A autofagia (principalmente macroautofagia) é um processo catabólico conservada estreitamente regulada. Após a indução, as partes do citoplasma são sequestradas em vesículas de característica dupla de membrana conhecidas como autofagossomas (nucleação vesícula, o alongamento da vesícula e recuperação). Posteriormente, autofagossomas fundir-se com endossomas ou lisossomas atrasados, que formam o autolysosome (fusão). Exposição do compartimento interior para hidrolases lisossomais provoca a degradação da carga citoplasmática, e os produtos de degradação resultantes são então libertados para o citosol, para reciclagem. rígido controle da autofagia é essencial para a homeostase celular e resposta ao estresse celular. Uma grande família de reguladores autophagy núcleo, o Autophagy (ATG) relacionados com genes, serve para regular de forma coordenada a progressão passo a passo a partir de autofagia autofagia indução de nucleação vesícula, o alongamento da vesícula, de recuperação e de fusão [26]. Além disso, uma rede diversa e complexa de vias de sinalização a montante contribui para a regulação autofagia incluindo o fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), a proteína cinase de AMP-activated vias (AMPK) RAS-proto-oncogene e, muitas das quais convergem para o alvo de mamífero de complexo rapamicina 1 (mTORC1), um regulador chave negativa de autofagia sinalização [27].

Em nosso experimento, 27 miRNAs que potencialmente têm como alvo genes que regulam a autofagia foram encontrados para ser upregulated após o tratamento com 5-FU ou inanição. análise de caminho sugerido que a via de sinalização de mTOR foi significativamente identificado por estes miARNs. Foi previamente demonstrado em células de cancro da mama que nutriente resultados de fome num aumento da autofagia através da inibição da mTOR [28]. Nossos resultados também apoiou fortemente este efeito durante a autofagia induzida por 5-FU em células de câncer de cólon. Entre estes miARNs, os genes alvo previstos de HSA-miR-99b-5p incluídos mTOR. E o aumento desse miRNA-se em dois tipos de indução de autofagia (tratamento de 5-FU e fome) foi significativa, 5.624 e 6.243 vezes maior do que o controle. warrants HSA-miR-99b-5p uma investigação mais aprofundada na regulação da autofagia no tratamento com 5-FU no câncer de cólon humano. Em adição à rede de mTOR, a rede beclin1 também foi relatado para regular autofagia no cancro da mama [29]. A família Bcl-2 blocos autofagia induzida pela inanição de interagir com o domínio BH3 dos Beclin1 e são reguladores negativos da autofagia. Em nosso experimento, HSA-deixou-7c-5p, hsa-miR-195-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-98-5p e hsa-miR-181.º -5p estão previstas para alvejar genes na família Bcl-2 e também justificar uma investigação mais aprofundada. Embora estes 27 miRNAs mostraram expressão regulada positivamente ao abrigo destes dois métodos de induções autofagia, elas são previstas para alvejar genes do núcleo autofagia; HSA-miR-30a-5p alvo de BECN1 e Atg5 foi demonstrada nos relatórios anteriores [30]. A função destes miRNAs precisa ser mais investigada. Além disso, havia apenas quatro miRNAs reprimidos com metas previstas envolvidos na regulação autofagia, menos do que a quantidade de miRNAs regulada. Ele também demonstrou a importância da via de sinalização mTOR na regulação da autofagia. Além disso, previu genes-alvo incluídas genes do núcleo autofagia; HSA-miR-302a-3p alvos ULK1 e HSA-miR-548ah-5p alvo ATG16L1, sugerindo que estes quatro miARNs participar no processo de autofagia em 5-FU tratamento e têm o potencial de ser utilizado para manipular autofagia em 5-FU baseado quimioterapia em CRC.

os papéis da autofagia no cancro são dependentes do tipo de câncer, o contexto ea localização [4]. Neste estudo, nós nos concentramos em autofagia induzida por 5-FU no câncer de cólon humano com base em nossas e de outros relatórios anteriores. Não tinha 4 miRNAs regulados negativamente incluindo HSA-miR-302a-3p e hsa-miR-548ah-5p; e 27 miRNAs up-regulamentados, incluindo HSA-deixou-7c-5p e hsa-miR-30a-5p após tratamento com 5-FU e fome em células cancerígenas do cólon humano. Estes 31 miRNAs têm os genes-alvo previstos no regulamento da autofagia, incluindo genes do núcleo autofagia e reguladores de autofagia e são promissores alvos para modulação de autofagia em quimioterapia à base de 5-FU no CRC. Estes dados também poderiam lançar luz sobre miRNAs-autofagia interações em outros tipos de câncer, bem como fornecer um mecanismo para regular a autofagia potencialmente na prática clínica.

Informações de Apoio

S1 Fig.

5-FU induz pouca apoptose nas células HT29. células HT29 foram incubadas com 5-FU por 24 h. A citometria de fluxo utilizando anexina V e PI foi realizada para detectar a apoptose na nossa experiência. Houve pouca apoptose de células HT29 após o tratamento com 5-FU por 24 h

doi:. 10.1371 /journal.pone.0114779.s001

(TIF)

S1 Table. expressão

miRNA diferencial em inanição (Starv) vs. controle (Ctrl) e 5-FU vs. controlo (DMSO) em HT29

doi:. 10.1371 /journal.pone.0114779.s002

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos Prof. Kuwano H e Prof. Torii S (pós-graduação de medicina da Universidade Gunma, Maebashi, Japão) por sua gentil assistência. Agradecemos também Aiying Wang e Lin Yu por seu apoio técnico.