Sumário

Cetuximab é um anticorpo monoclonal quimérico ratinho-humano que tem como alvo o receptor humano do factor de crescimento epidérmico (EGFR). No entanto, a expressão do EGFR determinado por imuno-histoquímica não prever os resultados clínicos de cancro colorectal (CRC) dos pacientes tratados com cetuximab. Portanto, avaliamos a correlação entre os níveis de EGFR detectadas pelo cetuximab e drogas sensibilidades de linhas celulares (CRC Caco-2, WiDr, SW480 e HCT116) e a linha de células de carcinoma epidermoide A431. Utilizou-se citometria de fluxo (FCM) para detectar de cetuximab biotinilado na superfície celular de ligação a EGFR. linhas de células subclonadas mostrando os níveis de expressão mais elevados e os mais baixos EGFR foram escolhidos para um estudo mais aprofundado. ensaios citotóxicos foram usadas para determinar as respostas diferenciais aos cetuximab. modelos de xenoenxerto tratados com cetuximab intraperitonealmente para avaliar a sensibilidade ao cetuximab. respostas fortes para cetuximab foram especificamente exibido por células subclonadas com níveis de expressão de EGFR alta. Além disso, cetuximab inibiu o crescimento de tumores em modelos de xenoenxerto com os níveis de expressão de EGFR alto ou baixo em 35% e 10% -20%, respectivamente. Conclui-se que a detecção da expressão do EGFR cetuximab por promete proporcionar uma nova e sensível, e método específico para prever a sensibilidade de CRC para cetuximab

citação:. K Shigeta, Hayashida T, Y Hoshino, Okabayashi K, Endo T, Ishii Y, et al. (2013) Expressão do Fator de Crescimento Epidérmico Receptor detectado por Cetuximab Indica sua eficácia para inibir

In Vitro

e

In Vivo

proliferação de células de cancro colorrectal. PLoS ONE 8 (6): e66302. doi: 10.1371 /journal.pone.0066302

editor: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 23 de fevereiro de 2013; Aceito: 03 de maio de 2013; Publicação: 18 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Shigeta et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Ministério japonês da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia Grant-in-Aid para a Investigação científica (B) (# 23791559 KS, # 23791499 TH e # 25293292 YK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é um membro da família do EGFR humano do receptor de tirosina-quinases de proteína. É um importante alvo terapêutico no cancro colorectal metastático (mCRC), e aumento da expressão de EGFR é a marca de muitos tumores humanos [1], [2]. A activação da via resultados de sinalização de EGFR em proliferação aumentou de tumor, angiogénese, metástase e invasão de tumores por meio da ligação de um número de diferentes ligandos, incluindo moléculas semelhantes a EGF, factor de crescimento transformante-α (TGFa), e as neuregulinas para o ectodomínio do receptor de [3]. resultados da activação do EGFR na iniciação da potencialmente oncogénica intracelular cascatas de sinalização, incluindo o RAS activada por mitógeno proteína quinase (MAPK), fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt, fosfolipase C, transdutor de sinal e activador de transcrição (STAT), e vias SRC /FAK [4] – [6].

o desenvolvimento de anticorpos monoclonais tem melhorado as estratégias para inibir a actividade de inibição do EGFR em terapia do cancro. Cetuximab (Erbitux, Merck-Serono, Darmstadt, Alemanha) é um anticorpo monoclonal quimérico (IgG1) que se liga ao ectodomínio do EGFR humano e inibe competitivamente a ligação do ligando para suprimir a proliferação de tumores. A eficácia do cetuximab foi avaliado em combinação com irinotecan para tratar doentes cujos tumores são CCRm positivo para a expressão de EGFR (avaliada por imuno-histoquímica) e são resistentes a FOLFOX ou FOLFIRI regimes [7] – [10].

Muitos estudos têm sido realizados para identificar os fatores que podem predizer a resposta ao tratamento e CRC com mutado

KRAS

foi identificado como uma regra não responde à terapia anti-EGFR. [11], [12]. Em contraste, os factores, tais como o EGFR sobre-expressão, amplificação do seu gene e mutações de p53 correlaciona com a resposta ao cetuximab; No entanto, eles não são totalmente eficazes em prever a resposta a terapia com cetuximab [13], [14]. Estudos experimentais têm sugerido uma correlação entre o nível de expressão do EGFR e a eficácia do cetuximab [15]. No entanto, esta correlação parece ser especulativa no ambiente clínico, e alguns estudos relatam que nenhuma relação foi encontrada entre a intensidade da coloração imuno-histoquímica para EGFR ea taxa de resposta [avaliação foi realizada utilizando os Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos (RECIST) ], a sobrevida livre progressiva ou sobrevida global em ensaios clínicos [8], [16] – [18].

um relatório recente mostrou que uma mutação dentro do ectodomínio de EGFR confere resistência ao cetuximab, impedindo a sua ligação [ ,,,0],19]. Portanto, especulamos que a detecção de EGFR usando coloração imuno-histoquímica utilizando anticorpos IgG1 não específico difere de detecção por cetuximab. Nós ainda mais a hipótese de que os níveis de expressão específica de EGFR-membrana celular, que podem ser detectados por cetuximab, podem influenciar a inibição da proliferação celular. Neste estudo, que desenvolveu um método, em que se utilizou o cetuximab biotinilado como anticorpo primário por citometria de fluxo (FCM) para detectar directamente a expressão do EGFR por linhas celulares de CRC. Usando esta técnica foi avaliada a relação entre os níveis de EGFR detectadas pelo cetuximab-sensibilidades de linhas celulares de CRC.

Materiais e Métodos

Preparação de Biotinylated Cetuximab

O mecanismo pelo qual biotinilado cetuximab se liga a EGFR é mostrada na Figura 1a. A biotina foi conjugada com o cetuximab usando uma adaptação do método descrito por Medical Biological Laboratories Co., Ltd.

(A) cetuximab biotinilado é utilizado como anticorpo primário, para detectar o EGFR, e um anticorpo secundário de avidina-FITC é utilizado durante FCM para detectar os complexos antigénio-anticorpo. (B: biotina, A: avidina) (B) Análise de expressão de EGFR FCM por células A431. Controlos com anti-humana anticorpo IgG1, não específica marcada com FITC são descritos no anticorpo vermelho e biotylated-cetuximab em azul. A intensidade da fluorescência é de aproximadamente 5 vezes maior em relação ao anticorpo controle.

do cancro do cólon linhas celulares e Identificação de EGFR ectodom�io Mutações,

KRAS

,

BRAF

, e

PIK3CA

Quatro linhas de células humanas CRC, Caco-2, WiDr, SW480, HCT116, e carcinoma epidermóide linha de células A431 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA , EUA) e foram cultivadas como recomendado. Autenticação de todas as linhas de células foi realizada por meio da investigação do estado da mutação de cada linha celular utilizando os CRC-Scorpion braços ou métodos de sequência directa (conduzido por SRS Co., Japão).

KRAS

(códons 12 e 13),

BRAF

(exão 15), PIK3CA (exons 9 e 20), e ectodomínio de EGFR (S492) mutações foram determinados em um subconjunto de linhas celulares e os resultados estão resumidos na Tabela 1.

Caco-2, WiDr, SW480, A431 e foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 5% de 0,1 penicilina-estreptomicina mM, e HCT116 foi cultivado em Roswell Park Memorial Institute meio (RPMI), suplementado com 10% de FBS e 5% de penicilina-estreptomicina a 0,1 mM. Todas as linhas celulares foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2.

biotinilado de Cetuximab e Avaliação dos níveis de expressão de EGFR usando FCM

de ligação a EGFR

usada cetuximab biotinilado como anticorpo primário por FCM. Para confirmar a ligação a EGFR cetuximab, FCM foi realizada utilizando a linha celular A431, que expressa elevados níveis de EGFR. As células A431 foram ajustadas para 1 x 10

6 células /tubo e lavadas duas vezes com 2 mL de soluto salino tamponado com fosfato gelado (PBS), e o bloqueio foi efectuado durante 30 min, utilizando reagentes de bloqueio N102 (NOF Co., Tóquio , Japão). As células foram novamente lavadas e, em seguida, cetuximab biotinilado foi adicionado durante 1 h para as células que foram mantidas em gelo. Um anticorpo IgG1 anti-humano, não específica marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) foi utilizada como controlo. Após lavagem das células com PBS gelado, um anticorpo de avidina-FITC (Estreptavidina, Alexa 488 Fluor® conjugado, Molecular Probes®), um anticorpo secundário, adicionou-se durante 15 min em gelo. Finalmente, iodeto de propídio (PI) foi usado para determinar a viabilidade celular.

Um sistema de separação de células BD FACS Aria ™ III (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA), foi utilizado para a CFM. Os níveis de expressão de EGFR foram avaliados através do cálculo da intensidade do sinal de FITC. Depois de avaliar a ligação de cetuximab biotinilado a células A431, os níveis das quatro linhas celulares de CRC restantes expressão do EGFR foram avaliados pelo mesmo método. Além disso, citogramas (comparação de sinal de FITC e PE) e os histogramas para cada linha de células de CRC foram comparados aos de células A431 usando um BD FACSDiva 6,0 (BD Biosciences).

O estabelecimento de subclones com alta e baixos níveis de expressão de EGFR

diluição limitante de culturas de células foi conduzida em placas de 96 poços de cultura de tecidos semeadas a 0,8 células /cavidade em meio condicionado (DMEM suplementado com 10% de FBS e 5% de 0,1 mM de penicilina-estreptomicina) colhidos a partir de sadio ( 1 × 10

6 células /mL e 95% de viabilidade) as culturas de células de CRC. Vinte e subclones de linhas celulares de CRC cada foram isolados, e os níveis de expressão de EGFR foram determinadas usando o cetuximab biotinilado como descrito acima. As células com a maior ou seja os níveis mais baixos de expressão de EGFR foram escolhidos e cultivados para os ensaios de proliferação e utilizado no modelo de xenoenxerto. O estado de mutação de cada um subclonados linhas celulares de CRC foram investigados novamente para determinar se existe alguma diferença entre as células selvagens e subclones.

supressão do crescimento Ensaio

Células (1.000 e 3.000 células /poço) foram semeadas imediatamente após a avaliação de FCM em poços de uma placa de 96 poços no meio DMEM ou RPMI como acima mencionado suplementado com 0,5% de FBS e 5% de penicilina-estreptomicina. As células foram tratadas com várias concentrações de cetuximab após 24 h e incubou-se durante 6 dias. A viabilidade celular foi determinada utilizando o 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, ensaio de brometo de 5-difeniltetrazólio, e a formação de formazano foi medido pela sua absorvância a 550 nm. A taxa relativa de crescimento de células para cada linha de células foi calculado na análise por subtracção da absorvância no tempo 0 daqueles dos grupos de controlo e de tratamento.

modelos de xenoenxerto e tratamento com cetuximab

Todos os animais experimentos deste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso animal da Universidade Keio. linhas celulares subclonados derivados de WiDr e SW480 (2,0 × 10

6 células) foram injectados por via subcutânea na direita e lados das costas de camundongos nus femininos 5 semanas de idade esquerda. O nível de EGFR destas células subclonadas expressão foi avaliada por FCM em tempo de cada experiência e as células foram imediatamente injectados. O tamanho do tumor foi medido utilizando um compasso de calibre, e o volume foi calculado utilizando a seguinte fórmula: Volume = comprimento x largura x altura. Os ratinhos foram tratados com 30 mg /kg cetuximab administrados intraperitonealmente nos dias 0, 7, 14, e 21 ou com o controlo de veículo PBS (mesma quantidade como cetuximab). O tratamento foi iniciado quando o tamanho do tumor era de aproximadamente 100 milímetros

3. Os tamanhos dos tumores foram medidos duas vezes por semana até ao dia 28, e foi calculada a razão entre os volumes dos tumores com os valores determinados no dia 0.

Foi avaliada a expressão de EGFR nos tumores de pós-tratamento por coloração imuno-histoquímica utilizando anticorpos anti-humano , do tipo selvagem anticorpo EGFR e não cetuximab. O processamento das amostras de tecido foi feito usando o processador de tecidos (Sakura RH-12DM-II, Japão). Resumidamente as amostras de tecido foram fixadas em formalina a 10% durante 24 h, e, em seguida, processados ​​através de uma série ascendente de etanol e subsequentemente libertadas com xileno e embebidos em parafina. As amostras de tecido embebidos em parafina foram seccionados a uma espessura de 4 mm utilizando um micrótomo (Yamato-ROM 380, Japão). As secções foram montadas em starfrost /silano revestida slides (Muto Pure Chemicals NewSilane II, Japão) e secou-se ao ar. No dia da coloração das lâminas foram imersas em xilol durante 10 minutos antes de re-hidratação em série de etanol. As secções foram incubadas em peróxido de hidrogénio durante 10 minutos para bloquear a actividade da peroxidase endógena. Pré-tratamento de secções de tecido com a recuperação de epítopo deparaffiinized induzida pelo calor é necessária. os melhores resultados são obtidos por tecidos pré-tratamento com com a recuperação epitopo induzida pelo calor, utilizando tampão TE, pH 9.0. Após o qual, as secções foram incubadas com de Tipo Selvagem Anti-Humano de EGFR (Dako, EUA) anticorpo primário (1:50) para a 4 graus durante a noite. Para confirmar a especificidade da ligação, IgG de soro normal de ratinho foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo primário. Após lavagem extensiva, as secções foram incubadas durante 1 h em anticorpo secundário biotinilado seguido de DAB cromogénio (Sistema de Detecção EnVision Dako REAL, EUA) durante 8 min. Os cortes foram, em seguida, contra-coradas com hematoxilina de Mayer e desidratados em ascendente graus de etanol antes de limpar em xilol e montagem sob uma lamela. EGFR positividade membrana citoplasmática coloração foi considerada positiva EGFR. intensidade da coloração foi classificada como 0 (sem coloração), 1+ (fraca), 2+ (moderada) e 3+ (forte).

Análises Estatísticas

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Stata Versão de software 11.0. As diferenças entre dois grupos foram analisados ​​utilizando

t

de teste e de um Student não pareado

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Detecção de EGFR. por Biotinylated cetuximab

a capacidade do cetuximab biotinilado para detectar EGFR utilizando FCM foi avaliada utilizando a linha de células A431, que expressa níveis elevados de EGFR [20]. cetuximab biotinilado era usado como o anticorpo primário e da CCF foi realizada para detectar o sinal de FITC. intensidade forte FITC foi detectado em comparação com o controlo de IgG marcado com FITC (Fig. 1B). Esta descoberta sugere que EGFR expresso pela linha celular A431 pode ser avaliada utilizando cetuximab biotinilado.

Mutation Estado de

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

e EGFR S492 ectodom�io

o estado de mutação de cada linha de células CRC é mostrada na Tabela 1.

KRAS

mutações nos códons 12 e 13, que prevêem a eficácia do tratamento com cetuximab, não foram detectadas em Caco-2 e WiDr. Em contraste, a mutação de codões G13D foi detectada em SW480 e HCT116. A mutação de codões 12 não foi detectado nas quatro linhas celulares de CRC. A mutação exon 15 em

BRAF

só foi detectado em WiDr. Além disso,

PIK3CA

mutações nos exões 9 ou 20, foram detectados em SW480 e HCT116, respectivamente. Finalmente, o EGFR S492 mutação ectodomínio não foi detectado em todas as linhas celulares.

A partir destes resultados, nós escolhemos Caco-2 como a linha celular porque não tem nenhuma mutação em qualquer um dos três genes e se espera que seja sensível ao cetuximab. HCT116 foi utilizado como controlo negativo porque não tem a mutação no exão 20 PIK3CA, que já tem sido mostrado para ser resistente ao cetuximab [21], [22]. Por outro lado, SW480 com uma mutação no KRAS p.G13D foi seleccionado, uma vez que é conhecido que os tumores mutada-p.G13D são mais sensíveis ao cetuximab em comparação com outros tumores mutado KRAS-[23]. Tivemos um forte interesse em esta mutação e queria avaliar se a nossa hipótese e modelo experimental poderia ser aplicada a tumores com mutação p.G13D. Além disso, também estavam interessados ​​no efeito do cetuximab com a mutação BRAF, porque a sensibilidade à cetuximab foi previamente observado no modelo de xenoenxerto de tumores com mutação BRAF [24].

Avaliação dos Níveis EGFR expressão em linhas celulares de CRC

Os níveis de expressão de EGFR em cada linha de células CRC foram avaliados utilizando FCM com cetuximab biotinilado. Intensidade de FITC e PE são mostrados no citograma, e fluorescência de FITC foi prontamente detectado em todas as quatro linhas celulares de CRC (Fig. 2a). Este resultado sugere que estas linhas celulares expressam o EGFR de CRC, a que se liga o cetuximab na superfície da célula). Como indicado pelos dados apresentados na Figura. 2B, as linhas celulares WiDr e SW480 expressa os mais altos níveis de EGFR.

(A) Cada linha celular foi avaliada pela FCM com cetuximab biotinilado. Todas as quatro linhas celulares de CRC diferiam nos níveis de expressão de EGFR. (B) Histograma de cada linhas celulares de CRC. O nível de expressão de EGFR foi medida pela intensidade da fluorescência FITC.

estabelecimento de linhas celulares que expressam o EGFR diferencialmente

EGFR pode ser um dos genes mais importantes para a determinação do fenótipo de as células. Por conseguinte, o método para obter várias linhas celulares que tinham menos impacto no fundo genético e que demonstraram uma variedade de expressão do EGFR era desejável. Limitando-diluição subclonagem método é a técnica principal para derivar diferentes tipos de células com o mesmo fundo genético [25]. Fomos capazes de isolar os subclones das linhas celulares de CRC, utilizando a técnica de diluição limitante e determinados os níveis de expressão de EGFR em cada. Na Figura 3A, o resultado de FACS com células WiDr subclonadas, bem como várias expressões EGFR são mostrados. então nós células seleccionado a partir das linhas de células subclonados que expressaram as maiores e menores níveis de EGFR (Fig. 3B). O estado de mutação do

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

e EGFR S492 ectodom�io não se alterou em cada linhas celulares subclonados.

(A) histograma de WiDr subclonado linhas de células que apresentam diferenças de expressão do EGFR. Várias expressões EGFR foram vistos em linhas celulares subclonadas. (B) subclones de alta e baixa expressão do EGFR com alta ou baixa EGFR foram seleccionados com base nos resultados da CCF. Subclones derivados das quatro linhas celulares de CRC foram analisados, e os subclones expositoras mais alto (azul) e menores (verde) níveis de expressão do EGFR foram selecionados para estudos posteriores. Controles são descritos na linha vermelha.

Sensibilidade do CRC celular Lines para Cetuximab

Realizamos ensaios para determinar se o cetuximab inibe a proliferação de linhas celulares de CRC. O crescimento de células Caco-2 e SW480 foram fortemente inibidos, enquanto que a inibição intermédia de WiDr e nenhuma inibição das linhas de células HCT116 na dose máxima de cetuximab foram observadas. Para avaliar se o nível de expressão do EGFR correlacionados com os efeitos de inibição da proliferação de cetuximab, utilizámos linhas celulares subclonados com os níveis de expressão de EGFR, altas ou baixas. Para inibir a proliferação, subclones de células Caco-2, SW480 e WiDr, que expressa os mais elevados níveis de EGFR, foram os mais susceptíveis aos efeitos de cetuximab (Fig. 4). No entanto, a resposta ao cetuximab não foi observada em subclones destas linhas de células que tinham baixos níveis de expressão de EGFR. Subclones de HCT116, que na cultura de massa mostrou resposta mínima para cetuximab, não respondeu ao cetuximab se eles tinham níveis de expressão elevados ou baixos de EGFR.

Quando o cetuximab foi administrado aos baixos subclones CRC com baixa expressão EGFR, fraco foi observada inibição do crescimento celular. No entanto, o crescimento de subclones com alta EGFR foi fortemente inibida em comparação.

Sensibilidade ao cetuximab em xenoenxertos de linhas celulares de CRC subclonado

Cada uma das linhas de células subclonados derivados de WiDr e SW480 foram inoculadas subcutaneamente em ratinhos nus (cetuximab, 30 mg /kg por semana durante 4 semanas), e a diferença de sensibilidade para o cetuximab foi avaliada

in vivo

. Cetuximab inibiu o crescimento das células WiDr que expressavam níveis elevados de EGFR em 35% em comparação com ratinhos não tratados. Em contraste, o tratamento com cetuximab de um subclone WiDr que expressa níveis baixos de EGFR foi inibida em 20% em comparação com ratinhos não tratados (Fig. 5A).

Xenoenxertos (A) derivados de células WiDr subclone tratados com cetuximab. inibição do crescimento forte foi observada em tumores derivados a partir dos subclones com expressão de EGFR alto em comparação com os ratos não tratados; No entanto, observou-se apenas uma ligeira inibição do crescimento do tumor induzido por xenoenxertos de subclones com baixa expressão do EGFR. (B) tratamento com cetuximab de tumores derivados de xenoenxertos de células SW480 subclones. Resultados semelhantes foram também observados em tumores derivados de xenoenxertos SW480 isto é, inibição do crescimento forte de tumores derivados a partir dos subclones com expressão elevada de EGFR em comparação com subclones com baixa expressão do EGFR. (C) Comparação do tamanho do tumor no dia 28. Os tumores derivados a partir dos subclones com expressão elevada de EGFR foram significativamente menores em ratinhos tratados com cetuximab em comparação com os tumores derivados a partir dos subclones com baixa expressão do EGFR. (D) representativas coloração imuno-histoquímica de expressão 3+ EGF-R (i; A431), 2+ expressão de EGF-R (II; WiDr alta e III; SW480 alta) e 1+ expressão de EGF-R. (Iv; WiDr baixo e V; SW480 Baixa). No tumor transplante subcutâneo das linhas celulares de cancro do cólon

xenoenxertos SW480 derivadas a partir dos subclones, que expressavam níveis elevados de EGFR foram inibidos em 35% em comparação com o não tratado ratos. No entanto, xenotransplantes derivados de sublcones SW480 que expressam níveis baixos de EGFR foram inibidos em apenas 7% em comparação com ratinhos não tratados (Fig. 5B).

Para tumores induzidos por subclones derivados de WiDr ou culturas SW480, o volume tumoral dos grupos tratados com o cetuximab foi comparada com a dos grupos não tratados após 28 dias (Fig. 5c). O volume do tumor foi significativamente menor nos grupos tratados com cetuximab que foram enxertados com células que expressam níveis elevados do EGFR. Em contraste, o tratamento com cetuximab não provocou qualquer diferença significativa nos volumes dos tumores induzidos por subclones que expressam níveis baixos de EGFR.

Com base na coloração imuno-histoquímica, transplante do tumor subcutâneo de A431, o controlo positivo, mostrou 3+ expressões EGFR , enquanto alta WiDr e SW480 tinha 2+ expressões EGFR. Em contraste, tumores de baixo WiDr e SW480 apresentaram menor expressão de EGF-R (Fig. 5D). Estes resultados indicaram que os tumores pós-tratamento ainda expressam EGFR.

Discussão

O cetuximab, um anticorpo IgG1 quimérico que tem como alvo EGFR, foi introduzida para tratar mCRC. Para identificar os pacientes que poderiam se beneficiar ao máximo desta terapia biológica, a detecção de

KRAS

mutações foi proposto como o biomarcador principais [11], [26], [27]. mutações oncogênicas do

KRAS

são observados em cerca de 40% (20% -50%) do CRC esporádica [28] – [31]. Mutações causam activação constitutiva da via de sinalização de Ras /Raf /MAPK, que é independente da activação do EGFR por ligação do ligando [32]. Karapetis

et al

. relataram uma melhora significativa em pacientes com o tipo selvagem

KRAS

em resposta ao tratamento com cetuximab [12].

status de EGFR avaliada utilizando coloração imuno-histoquímica é considerado outro biomarcador para a eficácia de terapias anti-EGFR . Assim, era esperado nível de expressão de EGFR para correlacionar com a sensibilidade e a eficácia do cetuximab. Apesar desta hipótese, os resultados de uma série de estudos sugere que o status de EGFR e o seu nível de expressão determinado por coloração imuno-histoquímica pode não corresponder à eficácia da terapia anti-EGFR [8], [16] – [18]. Assim, uma resposta para o cetuximab foi detectada em doentes com expressão de EGFR específico de tumores indetectável, levando à conclusão de que a resposta ao cetuximab é independente da expressão do EGFR em tecido de tumor [18].

A identificação de genética adicional determinantes da resistência primária a terapias alvo-EGFR em CRC é claramente uma prioridade. Os resultados apresentados neste estudo sugerem que o nível de expressão do EGFR, a qual é detectada por cetuximab correlaciona com a eficácia do tratamento com cetuximab. Além disso, a avaliação da expressão do EGFR utilizando o método de cetuximab biotinilado pode prever o benefício clínico do tratamento com cetuximab. Aqui, demonstramos que a proliferação de linhas celulares de CRC foi altamente inibido em células que expressaram o EGFR em níveis elevados, o que sugere que os níveis de expressão de EGFR detectadas por cetuximab correlaciona com a sensibilidade de células para o tratamento com cetuximab. A eficácia do cetuximab num modelo de xenoenxerto também foi examinada por meio da comparação xenoenxertos de CRC linhas celulares subclones que expressavam níveis elevados ou baixos de EGFR. inibição maior crescimento dos tumores foi observada em tumores induzidos por subclones com alta expressão de EGFR em comparação com aqueles com baixa expressão EGFR. No entanto, não temos conhecimento de quaisquer relatórios que indicam que a detecção de EGFR por cetuximab está associada com a sensibilidade do CRC para tratamento com cetuximab. Embora serão necessários mais estudos para definir a associação entre a expressão de EGFR e sensibilidade das células tumorais ao cetuximab, nossos resultados atuais sugerem que o nosso método para detectar a expressão de EGFR com cetuximab pode fornecer um novo biomarcador.

Foram selecionados quatro CRC linhas celulares, Caco-2, WiDr, SW480 e HCT116 para o nosso estudo. Estas linhas de células têm sido usados ​​em muitos outros estudos anteriores para avaliar a eficácia do tratamento com cetuximab. Também foi investigada a presença de mutações no

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

e ectodomínio de EGFR (Tabela 1). Observou-se uma resposta forte ao cetuximab nas células Caco-2, que não tinham mutações detectáveis ​​em três destes genes; no entanto, a resposta também foi detectado em SW480 células, que abriga um

KRAS

e mutação PIK3CA. Primeiro, em relação

KRAS

mutação, a eficácia do cetuximab está associada com maior sobrevida global e livre de progressão em pacientes com câncer colorretal quimioterapia refratária com tumores mutado-p.G13D do que com outros tumores com mutação KRAS [23 ]. Em segundo lugar, acerca das mutações PIK3CA, Ogino

et al.

Informou que

PIK3CA

mutações foram associados à sobrevida específica por câncer mais curto em pacientes com KRAS tumores do tipo selvagem em uma série de estágio I-III colorectal cancros [21]. No entanto, De Roock

et al.

Relatado pela primeira vez que PIK3CA exon 20 mutações estão associadas com piores resultados em comparação com os tipos selvagens, ao passo que o exão 9 mutação foi encontrada para não ter nenhum efeito [22]. A partir destes relatórios anteriores, nossos resultados foram consistentes com os de outro estudo que mostra que cetuximab foi eficaz em SW480, que tem KRAS códon 13 mutação e PIK3CA exon 9 mutação, enquanto nenhum efeito positivo foi visto na HCT116 com PIK3CA exon 20 mutações.

Nós também estudou as células de WiDr e SW480 CRC para avaliar a eficácia de eficácia cetuximab utilizando um modelo de murganho de xenoenxerto. Um ensaio de proliferação demonstrado que uma resposta forte ou leve a cetuximab em ratinhos enxertados com qualquer WiDr ou SW480. Caco-2, que mostrou forte resposta ao cetuximab, também foi usada para estabelecer o modelo de xenoenxerto; no entanto, o enxerto falhou os ratinhos. O crescimento de tumores derivados de xenoenxertos SW480 e WiDr era altamente inibido quando subclones apresentaram expressão elevada de EGFR em comparação com aqueles com baixa expressão de EGFR. Isto sugere que a diferença na quantidade de EGFR cetuximab correlaciona com a sensibilidade. No entanto, uma limitação deste estudo é que existe a possibilidade de alterações no nível de expressão de EGFR durante a progressão tumoral. Embora o nosso novo método para quantificar a expressão de EGFR utilizando cetuximab requer uma validação adicional como um biomarcador da eficácia da terapia anti-EGFR, nossos resultados sugerem que os níveis de expressão de EGFR correlacionam-se com a sensibilidade da CRC ao cetuximab.

As aparentes discrepâncias entre os resultados do nosso estudo e aqueles previamente relatados pode ser explicado da seguinte forma: em primeiro lugar, EGFR é expresso em 40% -70% dos cânceres colorretais, e as evidências sugerem uma associação com a sobrevivência [33] – [35]. Os métodos usados ​​para avaliar a quantidade de EGFR em cancros colo-rectais incluem imuno-histoquímica, de ligação ao ligando, immunoblotting, a fluorescência na análise de hibridação in situ e uma variedade de técnicas moleculares [36]. No entanto, a avaliação da expressão do EGFR pode ser afectada por imunorreactividade de tecidos normais, a reactividade diferencial de EGFR de neoplasias de diferentes áreas do intestino, e a heterogeneidade de reactividade dentro do carcinoma colorrectal em si [17], [37]. Em segundo lugar, Scartozzi

et ai. Relatou que

estado de EGFR em tumores colorectais primários difere daquela de metástases [38]. Em terceiro lugar, Montagut

et al.

Informou que EGFR S492R mutação ectodom�io previne a ligação cetuximab e confere resistência ao cetuximab [19]. Esta constatação sugere que a quantificação EGFR utilizando a coloração imuno-histoquímica detecta qualquer tipo selvagem ou EGFR mutado que não se ligam cetuximab. Portanto, o nosso novo método pode resolver este problema, pois depende da capacidade do cetuximab para detectar a expressão de EGFR.

Muitos ensaios clínicos têm demonstrado a eficácia da adição de cetuximab ao tratamento para CCRm [7], [8], [39]. Van Cutsem

et al

. realizado um estudo de fase III de tratamento de primeira linha, em que o cetuximab foi adicionado a Folfiri e poliquimioterapia com base em 5-FU com irinotecano [40]. A adição de cetuximab foi associado com um aumento significativo na sobrevivência livre de progressão média em comparação com nenhuma cetuximab. Jonker

et al

., Em outro estudo de fase III, em comparação a terapia de anticorpos anti-EGFR aos cuidados de suporte em pacientes [10]. Neste estudo, o cetuximab foi adicionado juntamente com melhores cuidados de suporte e foi associada com melhorias significativas em relação aos cuidados de suporte sozinho. No entanto, os resultados da maioria dos estudos mostram uma tendência de melhor sobrevida se a quimioterapia foi combinado com cetuximab, mas não revelou um impacto significativo no tratamento CRC.

A taxa de resposta do tratamento com cetuximab para CRC é de 30% -40 % [10]. As evidências sugerem que

KRAS

mutações são os preditores mais eficazes para a seleção de pacientes que se beneficiarão do tratamento; no entanto, estas mutações, por si só, não identificam as melhores respondedores. Os nossos resultados actuais sugere que este novo método de detecção da EGFR cetuximab usando biotinilado pode proporcionar um meio para detectar pacientes altamente sensíveis com o tipo selvagem

KRAS

. Embora mais estudos são necessários para avaliar a nossa hipótese, a técnica descrita aqui pode fornecer uma indicação mais específica para a implementação de tratamento de CRC com cetuximab.

Em conclusão, os resultados do presente estudo demonstram que os níveis de expressão de EGFR, que foram detectados por cetuximab, pode estar correlacionada com a sensibilidade à inibição mediada por cetuximab de crescimento de células tumorais. Portanto, acreditamos que estes resultados podem fornecer um novo método para quantificar a expressão de EGFR, permitindo assim uma selecção mais eficaz dos pacientes CRC que irá beneficiar da terapia com cetuximab.

Reconhecimentos

Os autores agradecem H.