Abstract
mebutato de ingenol está aprovado para o tratamento tópico de queratoses actínicas e pode, em última análise também encontrar utilidade no tratamento de câncer de pele. Aqui nós mostramos que as taxas de recidiva de tumores de melanoma B16 subcutânea tratados topicamente com mebutate ingenol não foram significativamente diferentes em camundongos C57BL /6 e RAG1
– /- ratos, sugerindo B e células T não desempenham um papel importante no anti-câncer eficácia de mebutate ingenol. As taxas de recidiva foram, no entanto, aumentou significativamente em MyD88
– /- ratos e camundongos C57BL /6 tratados com o anti-IL-1 agente, anakinra. mebutato de ingenol tratamento induz uma infiltração acentuada de neutrófilos, os quais foram mostrados como tendo actividade anti-cancro em ratinhos. Aqui que fornecem evidências de que a IL-1 promove o recrutamento de neutrófilos para o tumor, diminui a apoptose de neutrófilos que se infiltram e aumenta a actividade de morte de tumores de neutrófilos. Estes estudos sugerem que a IL-1, através da sua acção em neutrófilos, promove a eficácia anti-cancro do mebutate ingenol, com tratamento mebutato de ingenol causar tanto a indução de IL-1β e IL-1α libertado de queratinócitos
citação:. Le TT, Skak K, Schroder K, Schroder WA, Boyle GM, Pierce CJ, et al. (2016) IL-1 Contribui para a Eficácia Anti-Câncer do mebutato de ingenol. PLoS ONE 11 (4): e0153975. doi: 10.1371 /journal.pone.0153975
editor: Irina V. Lebedeva, Universidade de Columbia, Estados Unidos
Recebido: 07 de outubro de 2015; Aceito: 06 de abril de 2016; Publicação: 21 de abril de 2016
Direitos de autor: © 2016 Le et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. a pesquisa foi conduzida principalmente a QIMR Berghofer Medical Research Institute e foi em grande parte financiada por Leo Pharma, e em parte por uma bolsa da Australian National Health Conselho de Investigação Médica (APP1043104). Leo deu apoio na forma de salários para TTL e consumíveis, foi envolvidas no projeto inicial de estudo, mas não estava envolvido na recolha e análise de dados. Leo estava envolvido na decisão de publicar, mas desde a entrada mínima para a redação do manuscrito. K. Schroder é suportado por um australiano Conselho de Pesquisa Futuro Fellowship (FT130100361), e do Fundo inteligentes Futuros Queensland. AS é um Principal Research Fellow com o Health Conselho de Investigação Médica, Austrália (APP1058391)
Conflito de interesses:. K. Skak é um funcionário da Leo Pharma. AS foi um consultor pago para Leo Pharma em 2011. Como é um inventor em uma série de patentes que cobrem mebutate ingenol (Picato), mas não recebe royalties ou benefícios financeiros (ou outros) como resultado. Essas instituições comerciais não alteram a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
mebutate ingenol (Picato
®) é uma droga tópica aprovado para tratamento de campo de queratoses actínicas (AKS) [1,2,3]. QA são lesões normalmente encontrados na pele exposta ao sol causada pela exposição à radiação UV e são caracterizados por queratinócitos proliferam atipicamente [4]. Em cerca de 8% dos casos, AKs pode progredir para carcinoma invasivo de células escamosas (CEC) [5], a segunda forma mais comum de câncer de pele. Remoção de AKs e queratinócitos mutada por tratamento mebutate ingenol pretende, assim, reduzir o risco subsequente de CCEs em desenvolvimento [1,6,7,8]. Mebutato de ingenol pode vir também encontrar utilidade no tratamento de outros tipos de câncer de pele [9,10], com eficácia demonstrada em estudos humanos para SCCs e carcinomas basocelulares [11,12,13]. Mebutato de ingenol é derivado da seiva da
Euphorbia peplus Comprar e ativa a proteína quinase C (PKC) [14,15].
In vivo
droga aplicação tópica induz necrose primária de (i) queratinócitos, incluindo manchas de queratinócitos rolamento p53 mutações e (ii) células tumorais subcutâneos que crescem abaixo do local de tratamento [16,17]. O tratamento tópico em humanos [7,18,19] e ratos [16] resulta em um eritema transitório rápido início e uma de recrutamento pronunciada de neutrófilos [17,20,21]. Neutrófilos, recrutados e estimuladas por mebutate ingenol também parecem mediar a atividade anti-câncer, reduzindo significativamente as taxas de tumor-recaída em modelos de tumor de rato, incluindo o modelo de melanoma B16 [21].
Para investigar o papel da adaptativa e inata respostas imunitárias com a eficácia anti-cancro do mebutate ingenol, investigou as taxas de recorrência após o tratamento tópico de tumores subcutâneos com B16 mebutate ingenol de uma série de ratinhos geneticamente modificados. Apesar de as respostas de células T e B não pareceu desempenhar um papel importante, que fornecem evidências de que a IL-1 desempenha um papel significativo na eficácia anti-cancro do mebutate ingenol.
Materiais e Métodos
ética animal declaração
Todo o trabalho do rato foi conduzido de acordo com as boas práticas de animais, conforme definido pelo National Health and Medical Research Council da Austrália. O trabalho mouse foi aprovado pelo comitê de ética animal QIMR Berghofer Medical Research Institute. Os ratos foram sacrificados quando os tumores atingiram 100 mm
2, um tamanho de tumor que não causa sofrimento excessivo aos animais.
Rato, a inoculação do tumor e mebutate ingenol tratamento
ratos fêmeas, 8 -12 semanas de idade foram injectados com células de melanoma B16 (4-5×10
5 células /rato em 50 � de meio) por sc rasa injecção. células B16 foram obtidas da ATCC (CRL-6322) passadas não mais do que 10 vezes e mostraram ser micoplasma negativas por MycoAlert
™ Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Basileia, Suíça) e coloração de Hoechst [22]. Quando o tamanho médio do tumor atingiu 10-20 mm
2 (2-4 dias pós-injecção) ratinhos foram escolhidos de modo a que cada grupo tivesse uma distribuição de tamanho de tumor e o tamanho médio do tumor semelhante; ratinhos com tamanhos de tumores que não podem ser adequadamente emparelhados foram removidos. Os locais do tumor foram então tratados por via tópica uma vez com 10 ul de placebo ou 0,1% de gel de mebutato de ingenol por dia durante 2 dias consecutivos (o início do tratamento considerado dia 0). Quando os tumores atingiram 100 mm
2 ratos foram sacrificados utilizando gás de dióxido de carbono. O gel compreende 0,1% a 1 mg /g de ingenol 3-angelato num excipiente contendo álcool isopropílico, hidroxietilcelulose, mono-hidrato de ácido cítrico, citrato de sódio, álcool benzílico e água purificada. Esta dose e horário foi escolhido como o trabalho anterior havia mostrado que forneceu uma taxa de regressão 50-100% no modelo de ratinho B16 [16,21].
camundongos C57BL /6 foram adquiridos da ARC, Perth, Austrália. MyD88
– /- (B6.129P2 (SJL) –
MyD88
TM1
1Defr
/J.), RAG1
– /- (B6.129S7-
RAG1
tm1Mom
/J) e μMT (B6.129S2-
Igh
-6
tm1Cgn
/J) ratos em um C57BL /6 fundo foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EUA), e foram criados em casa em ratos com deficiência de cadeia gama QIMR B. FcR-comum (FcyR
– /-.) (B6.129P2-
Fcer1g
tm1Rav
N12) em um fundo C57 /BL6 foram adquiridos da Taconic (Hudson, Nova Iorque, EUA)
anacinra tratamento
Kineret (anakinra) SOBI (Swedish Orphan Biovitrum) foi dado ip a 1 mg /rato (em 100 ul em PBS) por dia, dia 0 (3-4 horas antes do início ingenol tratamento mebutate) até o dia 7. foi dado o mesmo volume de PBS para controlar ratos.
Histologia e imuno-histoquímica
hematoxilina e eosina (H e), ApoTag coloração (ApoTag Além disso peroxidase
In situ
Apoptosis Detection Kit, Millipore) e Ly6G-anti coloração (usando rato anti-Ly6G; número de catálogo NMP-R14; Abcam, Cambridge, MA, EUA) foram realizadas como descrito anteriormente [23,24]. As lâminas foram digitalizados usando um scanner de slides de digitalização ScopeXTdigital (Aperio, Vista, CA) e análise de imagens de seções em duplicado foram realizadas utilizando software Aperio ImageScope (v10) eo Pixel positiva Contagem algoritmo v9 usando as configurações padrão.
ensaios de morte
B16 células (5×10
3) foram semeadas em placas de 96 poços planas em 100 ul de DMEM suplementado com 5% de soro de vitelo fetal e HEPES 10 mM, pH 7,2. No dia seguinte (dia 1), as células da medula óssea foram recolhidas, lavadas uma vez, e adicionado dentro de 45 minutos de recolha em as proporções indicadas entre efector e alvo, com 6 repetições. A anakinra (100 ug /ml final) ou IL-1β (Shenandoah Biotechnology Inc., Warwick, PA, EUA) (40 ng /mL de concentração final), em seguida, foi adicionado, seguido por mebutate ingenol (40 ng /mL final). As células em suspensão dia seguinte (dia dois) foram removidos por inversão das placas sobre papel de tecido e meio fresco foi adicionado. Após mais 2 dias de incubação (dia 4), o meio foi removido invertendo as placas num lenço de papel e a célula foram fixadas e coradas com violeta de cristal. As placas foram secas, metanol 100 pi por poço e a absorvância medida a 595 nm. Matar foi calculada em relação à B16 sem células efectoras, após subtracção de background. Medições de proteína
IL-1 e IL-1p
Os ratinhos com tumores B16 foram tratados com mebutato de ingenol dia 0 e 1, o tratamento locais foram excisadas nos tempos indicados, homogeneizados (usando Precellys24 homogeneizador de tecidos e os grânulos de cerâmica) em PBS suplementado com 0,1% de Igepal CA-630 detergente não iónico (Sigma) e cocktail de inibidor de protease (Roche). os níveis de IL-1 e IL-1 foram medidos nos sobrenadantes usando BD ™ Citometria Bead matriz Flex Set reagentes (BD Biosciences).
culturas de queratinócitos e anti-IL-1α immunoblotting
adulto humano queratinócitos epidérmicos (Heka-APF, Cascade Biologics, OR, EUA) foram cultivadas de acordo com as recomendações do fornecedor na matriz de revestimento e em meio pobre em cálcio (EpiLife com S7) sem soro (Gibco). As células que cresceram até à confluência em placas de 6 cavidades, de cálcio foi então adicionada a uma concentração final de 1 mM e as células cultivadas durante 48 horas. As células foram então tratadas com as concentrações indicadas de mebutate ingenol durante 16 horas em 1 ml de meio EpiLife contendo cálcio 1 mM. Os sobrenadantes foram colhidos, centrifugados a 1000 g durante 5 min, e as proteínas presentes no sobrenadante precipitado utilizando metanol como descrito [25]. Os precipitados foram então analisados por transferência de Western utilizando um anticorpo anti-IL-1α (Abcam; número de catálogo 9614) e anti-coelho de cabra HRP anticorpo secundário (Merck Millipore). As manchas foram digitalizados usando ImageQuant LAS 500.
Estatísticas
A análise estatística foi realizada utilizando IBM SPSS Statistics (version19). As taxas de sobrevivência e de recaída são representados como gráficos de Kaplan-Meier, com significância estatística determinada pela Log-Rank testes (Mantel-Cox). Para outros conjuntos de dados do teste t foi utilizado se a diferença nas variâncias foi 4, assimetria foi -2, e curtose foi 2; em que os dados não paramétrico era ea diferença de variâncias foi 4, foi utilizado o teste U de Mann Whitney, se o 4 foi utilizado o teste de Kolmogorov-Smirnov. A 2 way ANOVA foi utilizado para a coloração ApoTag, com dados que mostram uma distribuição paramétrica e as diferenças de variância. 4
Resultados
As taxas de recidiva em ratinhos deficientes em T e respostas de células B
Tanto as células T anti-cancro e anticorpos anti-cancro são induzidos após o tratamento ingenol tópica mebutate (e regressão) de um número de tumores por via subcutânea crescido em murganhos [9,10,21]. Experimentos usando a linha de carcinoma de células escamosas LK2 crescido em
Foxn1
nu
ratos também sugerindo um papel para anticorpos e citotoxicidade celular dependente (ADCC) na prevenção da recaída [21]. Para investigar ainda mais a contribuição de respostas imunitárias adaptativas para a actividade anti-cancro de mebutate ingenol, tumores B16 foram cultivadas por via subcutânea a 10-20 mm
2 em RAG1
– /- ratinhos (C57BL /6, fundo), que são incapazes de gerar adaptativa B ou respostas de células T, e no controle camundongos C57BL /6. Os locais do tumor foram então tratados por via tópica duas vezes (dia 0 e dia 1) com mebutate ingenol ou gel placebo, e o crescimento do tumor foi monitorizado ao longo do tempo. As taxas de recidiva não foram significativamente diferentes entre RAG1
– /- e de ratinhos C57BL /6 (Figura A no ficheiro S1), sugerindo que nem as células B e T, nem desempenham um papel importante na eficácia anti-tumoral de mebutate ingenol no modelo B16 .
Outros experimentos para investigar o papel de (i) ADCC [21] usando receptor Fc da cadeia gama comum camundongos deficientes (FcyR
– /-) ratos (Figura B no Arquivo S1) e (ii) anticorpos utilizando camundongos μMT deficiência de células B (Figura C em Arquivo S1), não foram conclusivos quanto as taxas de crescimento de B16 (na ausência de tratamento mebutato de ingenol) eram diferentes nesses camundongos.
taxas de recaída Aumento em MyD88
– /- ratos
para investigar mais a contribuição de respostas imunitárias inatas [21] para a eficácia anti-câncer do tratamento mebutato de ingenol, as células B16 foram cultivadas por via subcutânea a 10-20 mm
2 em MyD88
– /-. e camundongos C57BL /6 e foram então tratados duas vezes (dias 0 e 1) com mebutate ingenol ou gel placebo, e o crescimento do tumor monitorado ao longo do tempo
As taxas de recaída em MyD88
– /- ratos foram significativamente mais elevada (84%) do que em ratinhos C57BL /6 (50%) de tratamento pós mebutato de ingenol (Figura 1A), com uma significativa redução subsequente na sobrevivência de 50% em murganhos C57BL /6 a 16% em MyD88
– /- ratos (Fig 1B)
(a) As taxas de recidiva seguintes (i) o tratamento mebutato de ingenol de B16 tumores cultivados em MyD88
-. /- ratos (n = 25), ( ii) tratamento mebutato de ingenol de B16 tumores cultivados em camundongos C57BL /6 (n = 21), (iii) tratamento com placebo de B16 tumores cultivados em MyD88
– /- ratos (n = 18) e (iv) o tratamento com placebo de tumores B16 crescidos em ratinhos C57BL 6 /(n = 19). Os ratos foram marcados positivos quando um tumor era claramente visível (≥1-2 mm de diâmetro). Os dados de dois experimentos independentes. Ingenol grupos de tratamento mebutate foram significativamente diferentes p = 0,021, log-rank (Mantel-Cox) teste. (B) As taxas de sobrevivência dos mesmos ratos descritas no A; os ratinhos foram sacrificados quando os tumores atingiram 100 mm
2. grupos de tratamento mebutato de ingenol foram significativamente diferentes p = 0,018, teste log-rank (Mantel-Cox).
Em contraste com um relatório anterior [26], não observamos diferenças significativas no crescimento de B16 em MyD88
– /- e C57BL /6 em ratinhos tratados com placebo (Figura D no arquivo S1). As taxas de sobrevivência foram realmente marginalmente (mas não de forma significativa) aumentou em MyD88
– /-, quando comparado com ratinhos C57BL /6, na ausência de mebutate ingenol (Fig 1B, comparando os grupos tratados com placebo). As duas últimas observações indicam que o aumento das taxas de recaída em MyD88
– /- ratos postar ingenol tratamento mebutate não eram devido ao crescimento inerentemente mais robusto de B16 tumores em MyD88
– /-. Camundongos
tratamento anakinra reincidência aumentada
MyD88 está envolvido na transdução de sinal para ambos os receptores de tipo Toll e o receptor da IL-1, e IL-1β ARNm é induzida em ratos após tratamento mebutato de ingenol tópica [21]. Os queratinócitos expressam níveis elevados de IL-1α constitutiva, que é libertado após a aplicação tópica de éster de forbol [27]; éster de forbol, como mebutate ingenol, activa PKC [14]. A utilização de IL-1 ratinhos deficientes é complicada pelas taxas de crescimento muito diferentes de B16 nestes animais, quando comparados com ratinhos de tipo selvagem [28]. Assim, para investigar o papel da IL-1, os ratinhos foram tratados com anakinra, um antagonista do receptor recombinante de IL-1 utilizado no tratamento de artrite reumatóide. A anakinra tratamento aumentou de forma significativa as taxas de recidiva de 0% a 50% (figura 2A) e diminuiu a sobrevivência de 100% a 0% (Figura 2B), sugerindo que a IL-1 desempenha um papel na eficácia anti-tumoral de mebutate ingenol. tratamento anakinra não afetou o crescimento de tumores B16 estabelecidos
in vivo
(Figura E no Arquivo S1), consistente com os resultados anteriores [29,30,31].
As taxas de recidiva (A) depois de ratinhos C57BL /6 portadores de tumores B16 foram tratados com mebuate ingenol ou placebo, e receberam injecções diárias de PBS ou anakinra, dias 1-7. (N = 9-12 ratinhos por grupo). Os ratos foram marcados positivos quando um tumor era claramente visível (≥1-2 mm de diâmetro). Estatísticas comparação + anakinra com + PBS nos grupos tratados mebutato de ingenol usando o teste log-rank (Mantel-Cox). (B) A sobrevivência dos ratos descrito em A; os ratinhos foram sacrificados quando os tumores atingiram 100 mm
2. Estatística como em A.
Anacinra e neutrófilos recrutamento e apoptose
tratamento mebutato de ingenol tópicos resulta em um recrutamento pronunciada de neutrófilos para o local de tratamento [9,17,20,21] , que aqui foi quantificada utilizando coloração de anticorpos anti-Ly6G, imuno-histoquímica e análise de imagem (contagem Aperio positiva Pixel). Como esperado, observou-se significativa do recrutamento dos neutrófilos para o local de tratamento (com um pico no dia 2, o início do tratamento pós) (Fig 3A, local de tratamento, comparar o dia 0 o dia 2 com PBS). Embora a IL-1 tem sido mostrado para promover o recrutamento de neutrófilos em várias configurações [32,33,34] anakinra tratamento não afectou significativamente o recrutamento para o local de tratamento (Figura 3A, local de tratamento, comparar dois dias, contra PBS anakinra). No entanto, nas secções em que o tumor pode ser claramente visto, a densidade de neutrófilos dentro ≈200 uM da massa tumoral era marginalmente ( 2 vezes), mas significativamente, menor nos animais tratados anakinra (Fig 3A, no prazo de ≈200 uM tumor, compare dia 2, PBS contra anakinra). Exemplos destes últimos são mostrados na Figura 3B, com coloração castanha neutrófilos e a massa do tumor prontamente identificável pelos melanossomas preto (Fig 3B, ovais brancas). A anakinra, assim, parece reduzir o recrutamento de neutrófilos para o tumor, com IL-1β derivado de tumor previamente relatado para recrutar neutrófilos anti-cancro para o tumor [35].
(A) Neutrófilos recrutamento para locais de tratamentos (barra da esquerda gráfico) e para dentro ≈200 mm de tumor (gráfico de barras à direita). locais de tratamento; dia 2 pós início do tratamento mebutato de ingenol, locais de tratamento foram excisadas e processados para imuno-histoquímica e coradas com o marcador de neutrófilos, anti-Ly6G. As lâminas foram digitalizadas e analisadas por Aperio software contagem de pixels para a coloração marrom (configurações padrão), excluindo áreas que contêm tumor (como melanossomas fornecer um sinal falso positivo). Duas seções por rato, 6 ratos por grupo. Estatísticas por testes de Kolmogorov-Smirnov (diferenças de variância entre os grupos foi 4). Dentro ≈200 uM de tumor; nas secções onde a massa do tumor poderia ser facilmente identificado (pela presença de melanossomas preto), coloração castanha em torno do tumor (dentro ≈200 uM) foi quantificada como acima. Uma seção por rato, 4-5 ratinhos por grupo. Estatísticas de Mann Whitney U (distribuição de dados não-paramétrico e diferenças na variância 4). (B) As imagens que ilustram a densidade reduzida de neutrófilos de coloração anti-Ly6G (mancha castanha) dentro ≈200 uM da massa tumoral em anakinra contra ratinhos tratados com PBS. Os tumores são delineados por linhas brancas e identificados pela presença de melanossomas preto. As secções são orientadas com a pele (não mostrada) na parte superior, com os tumores localizados na derme. (C) ApoTag coloração das seções descritas em A. Seis ratos por grupo, 2/3 seções por rato, estatísticas por 2 way ANOVA (distribuição e diferenças na variância 4) p = 0,005 e teste Mann Whitney U (distribuição não-paramétrica ea diferença de variância 4) p = 0,002. mebutate ingenol (40 ng /mL final) e /ou anacinra (100 ug /ml final) estava presente durante o ensaio. (B) Como para A, excepto uma grande gama de efector para alvo (isto é, 15: 1 a 250: 1) foram utilizados e foi adicionada IL-1β (40 ng /mL final). Estatísticas de Kolmogorov-Smirnov (para conjuntos de dados onde a diferença na variância foi 4) e testes t (para conjuntos de dados com distribuição paramétrica e as diferenças de variância 4).
IL-1 de proteína níveis nos locais de tratamento mebutato de ingenol
os dados até agora apoia a ideia de que a IL-1 promove a eficácia anti-câncer do mebutate ingenol através da promoção da actividade anti-cancro de neutrófilos, com MyD88 necessário para sinal do receptor IL-1 transdução [42]. Para obter mais insights sobre IL-1 produção, tecido níveis de proteína IL-1 a IL-1α e nos locais de tratamento foram quantificados antes e após o tratamento mebutato de ingenol. os níveis de proteína IL-1 nos locais de tratamento foram elevado antes do tratamento (Figura 5A), com a expressão de IL-1α restrito a pele, em vez de o tumor B16 (Figura G no ficheiro S1). Esta observação é consistente com a expressão constitutiva conhecido alta pró-IL-1α proteína nos queratinócitos [27]. os níveis de proteína IL-1 diminuiu significativamente (≈3 vezes) pós tratamento (Figura 5A), provavelmente associado com extensa necrose de queratinócitos induzida dentro de 6-24 horas de tratamento mebutato de ingenol [17]. Este padrão de expressão da proteína IL-1α foi semelhante em MyD88
– /- ratos (Figura 5A, MyD88
– /-; Figura G no ficheiro S1).
(A, B) C57BL /6 e MyD88
– /- ratos com B16 tumores foram tratados topicamente com mebutato de ingenol dia 0 e 1, locais de tratamento foram excisadas e os níveis de IL-1 a e IL-1 foram medidos em extractos utilizando BD BD ™ Citometria grânulo array ( n = 6 ratinhos por grupo e tempo de ponto). Estatísticas por testes de Kolmogorov-Smirnov (diferenças na variância 4). (C) queratinócitos humanos adultos cultivadas foram tratadas com a concentração indicada de mebutate ingenol durante 16 horas e os sobrenadantes analisados por Western utilizando um anticorpo anti-IL-1α. A seta indica a posição da forma bioactiva de 18 kDa da IL-1α.
os níveis de proteína IL-1β em murganhos C57BL /6 foram baixos antes do tratamento mebutato de ingenol e aumentada (≈3 vezes) depois de ingenol mebutate tratamento, com esse aumento atingiu significância no dia 6 (Figura 5B, C57BL /6) consistente com os dados anteriores de ARNm [21]. No dia 6 os níveis de proteína IL-1β também foram significativamente mais elevados em mebutate ingenol tratados ratos C57BL /6, quando comparado com MyD88 tratada mebutato de ingenol
– /- ratos (Figura 5B, dia 6). Assim MyD88
– /-. Ratos têm um defeito na indução da proteína IL-1β após o tratamento mebutato de ingenol, consistente com a indução de IL-1β dependente de MyD88 visto em várias configurações [43,44]
A grânulo baseado IL-1 ensaios, aqui usados em lisados de tecido, são capazes de diferenciar entre inactivos (pro-IL-1) e clivada-activo IL 1-espécies, com dados recentes que sugerem pró-IL-1α também tem de ser clivada para a forma de 18 kDa ser ativo em concentrações fisiológicas [45]. Assim, IL-1α liberado de queratinócitos [27] e /ou indução de IL-1β pode fornecer IL-1 após o tratamento mebutato de ingenol.
mebutato de ingenol provoca a liberação de IL-1α de queratinócitos
in vitro
Os níveis consideravelmente mais altos de IL-1α, quando comparado com IL-1β (Fig 5A vs 5B), pode-se argumentar que a IL-1α é um jogador importante neste cenário. A queda nos níveis totais de IL-1α após o tratamento mebutato de ingenol (Figura 5A) (contemporânea com necrose de queratinócitos [17]) sugere queratinócitos IL-1α pode ser libertado, uma vez que a outra aplicada topicamente activadores de PKC causar a libertação de IL-1α de queratinócitos [27 ]. Queratinócitos constitutivamente expressam altos níveis de intracelulares pro-IL-1α [27], que é obrigado a IL-1 receptor 2 (IL1R2) [46], com IL1R2 realmente up-regulamentado após mebutato de ingenol treament [15]. A produção de f isiologicamente activa da IL-1α Acredita-se que requerem (i) a libertação de pró-IL-1α de IL-1R2, um processo mediado por clivagem de caspase-1 mediada por IL-1R2, e (ii) a clivagem subsequente da Autorização Pro-IL-1α por calpaina para gerar fisiologicamente bioactivo de 18 kDa da IL-1α [45].
para determinar se o tratamento ingenol mebutate de queratinócitos provoca a libertação de IL-1α, cultivados queratinócitos humanos primários foram tratados com ingenol mebutate
in vitro
durante 16 horas e o sobrenadante analisado para a presença de espécies 18 kDa da IL-1α por Western. Tratamento com mebutate ingenol a 50 ug /ml, mas não a 20 ou 5 ug /ml, resultou na libertação de 18 kDa da IL-1α (Figura 5C, seta). A concentração de 50 ug /ml provoca aumento do cálcio intracelular, mas apenas é inferior à concentração que provoca citotóxica evidente afecta em queratinócitos [47]; (Também observamos nenhuma morte celular manifesta nestas culturas).
Discussão
Aqui nós fornecemos evidências de que a eficácia anti-câncer do tratamento mebutato de ingenol tópica requer tanto MyD88 e IL-1. Aumento das taxas de recidiva do tumor foram observados em MyD88
– /- ratos e em ratinhos C57BL /6 seguinte anacinra (-IL-1 anti) de tratamento, com MyD88 necessária para o receptor de IL-1 de sinalização [42]. tratamento mebutato de ingenol tópica é conhecido por causar uma pronunciada recrutamento dos neutrófilos para o local de tratamento [9,17,20,21], com IL-1, mostrado anteriormente para promover a actividade anti-cancro de neutrófilos no modelo B16 [35,48 ]. (IL-1β não tem efeito direto sobre o crescimento B16 [35]). Os neutrófilos também são conhecidos para mediar actividades anti-cancro em outros sistemas [49,50]. Mostramos aqui que a IL-1 afeta três aspectos do comportamento de neutrófilos após a administração mebutato de ingenol; (I) aumento do recrutamento para o tumor (Fig 3B), consistente com o papel amplamente relatado de IL-1 na promoção de recrutamento de neutrófilos [32,33,34,35,51,52,53], (ii) redução de neutrófilos apoptose ( Fig 3C), com IL-1 previamente relatado para inibir a apoptose de neutrófilos [36,37,38], e (iii) aumento de morte tumoral, consistente com o papel relatado de IL-1 para promover a activação dos neutrófilos [40,41]. IL-1 e do receptor da IL-1 sinalizando, portanto, parecem desempenhar um papel na redução das taxas de recaída após o tratamento mebutato de ingenol através da promoção de actividades anti-câncer de neutrófilos.
O tratamento de queratinócitos
in vitro
, com uma dose de mebutate ingenol que é capaz de elevar o cálcio intracelular [47], resultou na libertação da forma bioactiva de 18 kDa da IL-1α. derivada de queratinócitos-IL-1α pode, assim, (pelo menos inicialmente) ser uma fonte principal de IL-1 após tratamento mebutato de ingenol. Menores doses mebutato de ingenol não induziu a libertação de IL-1α, sugerindo activação de PKC (que ocorre a concentrações tão baixas como 10 ng /ml [21]) não é suficiente para a libertação de IL-1α. O aumento intracelular de cálcio [16] pode ser esperado para activar a calpaína [54], com a calpaina activa necessária para a clivagem de pró-IL-1α às espécies de 18 kDa, IL-1 [45]. No entanto, pró-IL-1α deve primeiro ser libertado a partir de IL-1R2, um processo que se acredita ser mediada por clivagem de IL-1R2 [45] caspase-1-mediada. A libertação de 18 kDa a libertação de IL-1α pode sugerir activação de queratinócitos da caspase-1, caspase e uma indução e activação pode ser detectado na pele após o tratamento mebutato de ingenol (Figura H no ficheiro S1). Além disso, a permeabilização da membrana do plasma pode ser suficiente para inflamassoma (e, portanto, a caspase 1) activação [55], com mebutato de ingenol capaz de induzir a permeabilização da membrana do plasma [16,47]. No entanto, a activação de queratinócitos da caspase-1 (e talvez pyroptosis [56]) após o tratamento mebutato de ingenol tópica continua a ser formalmente demonstrada, e é complicado devido à abundância de neutrófilos, que também expressam caspase 1.
O queratinócitos -derived IL-1α podem estar envolvidos na indução (dependente de MyD88) de IL-1β (Figura 5B), com a indução de IL-1β por IL-1 previamente relatado [57,58] e derivada de tumor de IL-1β também mostrado recrutar neutrófilos ao tumor [35]. Como células B16 não produzir IL-1 [35], células não malignas na /em torno do tumor (por exemplo, células do estroma, os fibroblastos e /ou macrófagos) podem representar a fonte de IL-1β. Após o tratamento mebutato de ingenol
In vivo
(i) o tecido do tumor B16 mostram uma indução ≈1.5 vezes de IL-1β ARNm [21] e (ii) os locais de tratamento de tumor mostram um aumento ≈2.5 vezes na proteína IL-1β níveis (Fig 5B). neutrófilos estimulados também pode fazer IL-1β [39,59]. engajamento receptor Toll-like, também poderiam estar envolvidos na indução de IL-1β [43,44], com a indução de necrose primário e hemorragia no tumor, (evidente após ingenol tratamento mebutate em ratos [60], ver também a Figura I no arquivo S1) potencialmente fornecer agonistas dos receptores Toll-like auto-derivado [61].
dados anteriores mostram aumento da recidiva de tumores LK2 em ratinhos SCID (que fazem pouco ou nenhum imunoglobulina) versus
Foxn1
nu
ratos (que retêm a capacidade de fazer IgM), sugere um papel para detecção de anticorpos anti-câncer e ADCC neutrófilos na redução das taxas de recaída [21]. No entanto, os dados aqui apresentados usando B16 tumores cultivados em RAG1
– /- ratos, sugere nem anticorpos (ou células T) desempenham um papel importante na redução da recaída.