Abstract

Fundo

A somatostatina (SST) tem efeitos anti-proliferativa e pró-apoptóticos. Nossos objetivos foram analisar e comparar a expressão SST durante o envelhecimento normal e carcinogênese colorretal em níveis de mRNA e proteína. Além disso, testamos o estado de metilação de

SST

em amostras de biópsia, e o efeito inibidor do crescimento celular da octreotide analógico SST na linha de células de adenocarcinoma colorretal humano.

Métodos

amostras de cólon foram coletadas de crianças saudáveis ​​(n1 = 6), adultos saudáveis ​​(n2 = 41) e pacientes com câncer colorretal (CRCs) (n

3 = 34) para

SST

análise de expressão de mRNA, usando HGU133 microarrays Plus2.0. Os resultados foram validados tanto o original (n

1 = 6; n

2 = 6; n

3 = 6) e amostras independentes ((N

1 = 6; n

2 = 6; n

3 = 6) por PCR em tempo real células expressando SST foram detectados por imuno-histoquímica em amostras de biópsia do cólon (N

1 = 14;. N

2 = 20; N

3 = . 23) O efeito de octreotida sobre o crescimento celular foi testado em linha de células Caco-2 percentagem SST metilação em amostras de biópsias (N

1 = 5;. N

2 = 5; n

3 = 9) foi definida utilizando digestão com enzimas de restrição sensíveis à metilação

resultados

no caso de envelhecimento normal ARNm SST expressão não se alterou, mas diminuiu no cancro (p 0,05). A proporção de SST imunorreactivo. células foi significativamente maior em crianças (0,70% ± 0,79%) em comparação com CRC (0% ± 0%) (P 0,05). octreotida aumentou significativamente a percentagem de células apoptóticas Caco-2

SST

mostrou significativamente. maior nível de metilação em amostras de tumor (30,2% ± 11,6%) em comparação com indivíduos saudáveis ​​jovens (3,5% ± 1,9%) (p 0,05).

Conclusões

na mucosa do cólon canceroso a reduzida produção SST pode contribuir para a proliferação celular descontrolada. A nossa observação de que em células de cancro do cólon octreotida aumentou significativamente a morte celular e a proliferação celular atenuada SST sugere que pode actuar como um regulador da cinética das células epiteliais. A inibição da expressão de SST no CRC pode ser epigenetically regulada por hipermetilação do promotor

Citation:. Leiszter K, Sipos F, Galamb O, Krenács T, Veres G, Wichmann B, et al. Reduzida (2015) Promotor Hipermetilação-Related somatostatina Produção promove a proliferação celular descontrolada no câncer colorretal. PLoS ONE 10 (2): e0118332. doi: 10.1371 /journal.pone.0118332

Editor do Academic: Robert Dante, Institut national de la santé et de la recherche médicale, França |

Recebido: 04 de agosto de 2014; Aceito: 13 de janeiro de 2015; Publicação: 27 de fevereiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Leiszter et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability: dados mais relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. arquivos de dados de microarrays estão disponíveis no banco de dados Gene Expession Omnibus (GSE10714, GSE37364 e GSE37267)

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores têm declarou que não existem interesses conflitantes.

Introdução

a somatostatina (SST), um peptídeo regulatório inibitória, tem efeito notável sobre a função gastrointestinal. Ele suprime a motilidade gastrointestinal e contração da vesícula biliar, inibe a secreção exócrina intestino, regula a absorção de nutrientes e do fluxo sanguíneo intestinal, e diminui a proliferação epitelial [1-5]. Além disso SST inibe a liberação de hormônio (por exemplo, GH, TSH, insulina, hormônios intestinais), serve como neurotransmissor e neuromodulador, e contribui para o equilíbrio de água [1,4,6]. Além destes endócrino fisiológica e parácrinos /efeitos autócrinos, SST pode inibir diretamente a proliferação celular e induz a apoptose através de receptores de somatostatina (SSTR) de sinalização [4,7]. Portanto, os níveis de somatostatina reduzidas, que encontramos em um estudo piloto pode ter relevância na tumorigênese gastrointestinal incluindo o cancro colorectal, que é uma das principais causas de morte relacionada ao câncer [8].

A somatostatina é produzido principalmente no sistema nervoso central e periférico, no pâncreas endócrino e nos intestinos; além disso, a secreção de SST menor também foi comprovada na tireóide, supra-renais, glândula submandibular, rins, próstata, placenta e as células do sistema imunológico. TSM é sintetizado a partir de uma grande molécula precursora chamado preprosomatostatina (preproSST) que é processada enzimaticamente para amadurecer produtos. Dois produtos de peptídeos bioativos do gene que codifica a SST são conhecidos, SST-14 e SST-28 [1]. SST-28 é sintetizada na mucosa intestinal, que é a maior fonte periférica do péptido e a maior SST produção de células no tracto gastrointestinal são Ô-células mucosas no epitélio intestinal, células D no antro gástrico e pâncreas, e neurônios intrínsecos nos plexos mioentéricos e submucoso ao longo do trato digestivo [3]. libertação de somatostatina pode ser estimulada e inibida por diversas hormonas, neurotransmissores, neuropéptidos, citocinas, factores de crescimento e nutrientes. Por exemplo, o crescimento hormona libertadora de GH (GHRH), hormona libertadora de corticotropina (CRH), neurotensina, bombesina, IL-1, IL-6 e TNF-α pode estimular a secreção de SST em vários tecidos. Por outro lado, o ácido aminobutírico γ (GABA), opiáceos, TGF-β e leptina são potenciais inibidores da libertação de SST. Nutrientes têm efeito específico do tecido sobre a produção de SST, e secreção intestino SST é desencadeada por luminal mas não circulam nutrientes [1].

Os cinco receptores de somatostatina conhecidos (SSTR1, SSTR2 /SSTR2A, SSTR2B /, SSTR3, SSTR4 , SSTR5) codificada por cinco genes humanos típicos são receptores acoplados à proteína G (GPCR), com sete segmentos transmembranares a-helicoidal. Após a ligação de SST aos seus receptores, várias funções celulares são modulados através de várias vias de sinalização dependentes de G-proteína. Diferentes vias de sinalização são activados dependendo do subtipo de receptor e localização do tecido. Todos os subtipos ESTR inibir a adenilato ciclase e produção de AMPc, regular proteínas fosfatases e ativar a proteína G regulada retificadora K família

+ canal (GIRK) após a ligação do ligando [1,2,5,9,10].

a manifestação dos efeitos antiproliferativos e pro-apoptóticos de SST sobre as células normais e tumorais depende do tipo do ligando de ligação de SSTR. SST e os seus análogos têm efeitos indirectos sobre o crescimento celular através da inibição da angiogénese, modular o sistema imunológico e inibir os factores de crescimento (por exemplo, IGF-1) e hormonas tróficas libertação. Além disso, pode induzir a apoptose, inibem o ciclo celular e modular o impacto de fatores de crescimento diretamente [11-14].

Em nossos estudos anteriores, temos resumiu as alterações macroscópicas, microscópicas e moleculares que afetam o trato gastrointestinal, em particular do intestino grosso durante o envelhecimento normal [15-17]. Nós demonstramos que o epitélio do cólon juvenil saudável e cancro colorrectal pode ser caracterizado com a proliferação celular aumentada e diminuída de apoptose em comparação com a mucosa do cólon adulto saudável. No entanto, enquanto a proliferação celular é estritamente regulado e bem equilibrada em crianças, que se torna descontrolada no CRC. Também revelaram que as alterações na expressão de mRNA durante o envelhecimento normal e carcinogénese colorrectal pode ser relacionada com o aumento, mas o crescimento celular de forma diferente regulamentado [18]. O objectivo deste estudo foi analisar a produção de somatostatina local no epitélio do cólon humano durante o envelhecimento normal e carcinogénese colorectal, tanto no ARNm e os níveis de expressão de proteína. Investigou-se também os efeitos do análogo da somatostatina octreótido na linha celular de adenocarcinoma colo-rectal humano (Caco-2). Desde hipermetilação do promotor pode epigenetically alterar a transcrição de genes tanto durante o envelhecimento e carcinogênese, testamos o estado de metilação de

gene SST

.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostras

Depois de consentimento informado, amostras de biópsia colorretais foram tomadas durante a intervenção endoscópica de rotina no 2º Departamento de Medicina interna e do Departamento de Pediatria da Universidade Semmelweis, Budapest, Hungria 1º. consentimento informado por escrito foi obtido com antecedência de todos os participantes adultos e para os familiares, cuidadores, ou responsáveis ​​sobre o nome dos menores /crianças aprovados pelos comitês de ética. Ao todo, 81 amostras de biópsia foram analisados ​​na análise de microarray (6 crianças saudáveis, 41 adultos saudáveis ​​e 34 CRCs de adultos) e 36 amostras de biópsia foram envolvidos em tempo real validação PCR (12 crianças saudáveis, 12 adultos saudáveis ​​e 12 CRCs de adultos) . Cinquenta e sete amostras de tecidos foram analisados ​​por imuno-histoquímica (14 crianças saudáveis, 20 adultos saudáveis ​​e 23 CRCs de adultos) e 15 biópsias de cólon foram investigadas usando enzimas de restrição análise de arranjo de metilação sensível à metilação (5 filhos saudáveis, 5 adultos saudáveis ​​e 9 CRCs de adultos). Setenta e cinco microarranjos (contendo as amostras de adultos) foram hibridados anteriormente; seus arquivos de dados foram usados ​​em estudos previamente publicados usando diferentes comparações [19-21] e estão disponíveis no banco de dados de Expressão Gênica Omnibus (série número de acesso: GSE10714 e GSE37364). Os conjuntos de dados dos recém-hibridizaram 6 microarrays são registrados no número de acesso de série GSE37267. crianças do grupo controle foram encaminhados ao ambulatório com prisão de ventre, sangramento retal ou dor abdominal crônica. Ileocolonoscopia era parte de seu procedimento de diagnóstico (para excluir a doença orgânica) e as amostras de biópsia mostrou aspecto macroscópico normal e histologia. Cada espécime foi verificada por meio de histopathologists. Para os estudos de ARNm (Microarray Analysis, Taqman RT-PCR) e análise de metilação matriz, as amostras de cólon foram armazenados em RNAlater Reagent (Qiagen Inc., Germantown, EUA) a -80 ° C antes da extracção do ácido nucleico. amostras de biópsia colorretais foram rotineiramente fixado em formol e embebido em cera de parafina para experimentos de imunohistoquímica

.

aprovações éticas (Nr .: 69/2008 e 202/2009) para este estudo foram emitidas pelo Comitê de Ciência Regional e Institucional Ética e Pesquisa da Universidade de Semmelweis (Budapeste, Hungria). especificação correlação clínica detalhada das amostras dos pacientes estão resumidos na

Tabela 1

.

análise de mRNA expressão microarray

De acordo com as instruções do fabricante, o RNA total foi extraído utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Germantown, EUA). A quantidade de ARN isolado foi caracterizado medindo a absorvância (NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer, NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, EUA) e a qualidade do RNA isolado foi testado com electroforese em gel capilar (2100 Bioanalyzer 6000 e ARN Pico Kit /Agilent Inc ., Santa Clara, CA, EUA /). De acordo com a descrição Affymetrix, sondas de cRNA biotinilados foram sintetizados 1-8 ug de RNA total com RIN (RNA Integridade Number) entre 7-10 e fragmentado usando o One-Cycle alvo rotulagem e controlo Kit (http: //www.affymetrix. com /support /download /manuais /expression_s2_manual.pdf). Dez microgramas de cada amostra de ARNc fragmentado foi hibridada em matriz HGU133 Plus2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) a 45 ° C durante 16 h. Os microarrays foram lavadas utilizando Estação Fluídica dispositivo 450, e coradas com coloração de amplificação de anticorpo de acordo com as instruções do fabricante. Os sinais fluorescentes foram detectadas por GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).

TaqMan em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) de validação

TaqMan polimerase de reacção em cadeia foi usado para medir a expressão do ARNm de codificação SST gene no originais (6 filhos histologicamente intactas, 6 adultos histologicamente intacta e 6 amostras adulto CRC) e conjuntos independentes de amostras (6 filhos histologicamente intactas, 6 adultos histologicamente intacto, 6 adulto amostras CRC). 18S RNA ribossomal (Hs03928990_g1 *) e GAPDH (Hs03929097_g1 *) foram usados ​​como gene de referência.

Total de controles de extração de RNA, qualidade e quantidade foram realizados conforme descrito anteriormente. Utilizando o ADNc de Alta Capacidade Transcrição Reversa Kit com RNase Inhibitor, 1 ug de RNA total por amostra foi transcrito de forma reversa (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). A qualidade do ADNc foi verificada por SdhA-PCR em tempo real (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basileia, Suíça). Então modelo de cDNA 16,7 ng por amostra foi utilizado para

SST

(Hs00174949_m1 *) A análise da expressão de mRNA com Gene Expression TaqMan Mestre Mix (Life Technologies). As medições foram realizadas em LightCycler 480 (Roche) com o formato de detecção Mono Cor Hidrólise Probe /UPL Probe. Após desnaturação a 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de PCR foram realizadas (de amplificação a 95 ° C durante 15 seg, e a 60 ° C durante 1 min).

A imuno-histoquímica para a detecção de células produtoras de somatostatina

núcleos de 2 mm de diâmetro foram coletadas de áreas selecionadas de, blocos de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina preparados a partir de 20 amostras de cólon normais e 23 cânceres colorretais de pacientes adultos e inserido em blocos receptores tissue microarray (TMA). Além disso, 14 amostras de biópsias de cólon histologicamente intactos de crianças também foram examinados em nível de proteína. 5 mm de tecido de espessura foram cortadas de blocos de TMA e a partir de amostras de biopsia, e foram imunocoradas. bloqueio endógena de peroxidase (0,5% de peróxido de hidrogénio e uma mistura de metanol, 30 min, temperatura ambiente) e recuperação de antigénios (Target Retrieval Solution, Dako, Glostrup, Dinamarca, código: S1699, em tampão a pH 6, realizado num micro-ondas a 900 W durante 10 min e a 370 W durante 40 minutos) foram realizados em amostras desparafinado. bloqueio não específica com 1% de albumina de soro de bovino foi aplicada. detecção imuno-histoquímica de somatostatina foi realizado numa câmara humidif içada utilizando o anticorpo policlonal anti-humana de coelho (diluição 1:50, durante a noite, Thermo Scientific, Califórnia, EUA, código: RB-038-A). sistema HRP EnVision + (Labeled Polymer anti-coelho, de 40 minutos, Dako, código: K4003) sistema de substrato de peroxidase-cromogénio e diaminobenzidina-hidrogénio (Cytomation líquido DAB + Substrato cromogénio Sistema, 10 minutos, Dako, código: K3468) foram usadas para a conversão do sinal. Finalmente, hematoxilina co-coloração foi realizada.

Contagem de células somatostatina produzindo em slides digitais

Stained amostras de biópsia e tissue microarray (TMA) lâminas foram digitalizadas com um scanner digital de alta resolução (Pannoramic Scan, 3DHISTECH Ltd. Budapeste, Hungria), utilizando a digitalização fluorescente multicamadas com uma abertura numérica elevada (0,8) x20 lente objetiva e uma alta faixa dinâmica AxioCam Mrm Rev.3 câmera preto-e-branco conectado ao scanner. lâminas digitais foram acessadas através de um monitor de computador e analisados ​​utilizando o software Pannoramic Viewer (versão 1.11.43.0). O módulo de software de marcador Contador resultando em anotações permanentes sobre as células contadas foi usada para estimar a razão relativa SST produção e outras células epiteliais. Epitelial SST positividade apareceu todos como forte marcação citoplasmática marrom nos slides. Dependendo do tamanho da amostra, 500-1000 células epiteliais foram contados em longitudinais criptas bem orientadas.

Tratamento de Caco 2-células com octreotide somatostatina analógico e medição da população Sub-G1 por citometria de fluxo

cultura celular e tratamento. experimento cultura celular foi mantido num laboratório de cultura de células específica de agentes patogénicos. Caco-2 linha celular de adenocarcinoma epitelial humana foi obtida a partir de DSMZ (Braunschweig, Alemanha; N ° Cat ACC-169.). As células foram cultivadas até à confluência em meio MEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA; Cat. No. M 2279), suplementado com 20% de Soro fetal bovino (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA; Cat. No. F 24429) e 160 ug /ml de gentamicina (Sandoz GmbH, Schaftenau, Áustria). Subsequentemente, 70.000 células Caco-2 foram resolvidos para l poço para uma placa de tratamento de 24 cavidades em MEM suplementado com gentamicina e FCS. Após 24 horas meio foi mudado: MEM foi adicionado com gentamicina e com 0,1, 1,0, 2,5, 5,0 e 10,0 nmol /L de octreótido (Sandoz GmbH) sem FCS. A medição foi realizada em triplicado para cada concentração. Após 24, 48 e 72 horas de tratamento as células foram colhidas, lavadas duas vezes em PBS estéril e 0,5 ml finalmente ressuspensas em 1,0 mL de gelo frio de etanol a 70% e armazenadas a -20 ° C.

citometria de fluxo e sub-G1 detecção população. As amostras foram centrifugadas durante 3 minutos a 1300 rpm, em seguida, as células foram ressuspensas em 300 μ1 de tampão de extracção e 3 ul de ARNase (ribonuclease T1 Uma mistura de /, Thermo Fisher Scientific Báltico UAB, Vilnius) foi adicionado. Após 15 min de incubação à temperatura ambiente, 3 mL de jodide de propídio (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA; Cat No. 81845.) Foi adicionado. A medição FACS foi realizada em Becton Dickinson Sistemas Immunocytometry (Mountain View, Califórnia, EUA, número de série 81313).

sensível à metilação enzima de restrição análise de arranjo de metilação

As biópsias foram homogeneizados em 2 sulfato de sódio dodecil% para a extracção do ADN, e, em seguida, incubadas em tampão de proteinase K de digestão (4 mg /mL) a 60 ° C durante 16 horas. extracção de ADN foi realizada com o Modelo de PCR High Pure Preparation Kit (Roche Applied Science, Penzberg, Alemanha) segundo as instruções do fabricante. O ADN foi eluído em 2×100 ul RNase e água isenta de ADNase e armazenado a -20 ° C. perfis de metilação do DNA foram examinadas usando o sistema Array EpiTect Metil qPCR (Qiagen, Hilden, Alemanha). O ADN isolado foi incubada tanto com ADN de restrição sensível à metilação dependente de ADN ou enzimas durante 16 h a 37 ° C, em seguida, incubadas a 65 ° C para parar a actividade de metilase. Cada reacção de 120 pL continha 500 ng de ADN genómico. A seguir à digestão enzimática, as amostras foram analisadas por, PCR quantitativo com base em fluorescência utilizando LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Basileia, Suíça). A PCR foi realizada nas seguintes condições: 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos (97 ° C durante 15 seg; e 72 ° C durante 1 min, com aquisição de dados em tempo real). Para assegurar a amplificação dos produtos desejados, que funde análise da curva foi realizada a seguir à reacção de PCR em tempo real. O intervalo de aquisição de dados curva de fusão foi de 65 ° -95 ° C, segurando por 1 s em incrementos de C para a PCR detecção de produto de 0,04 °.

Estatística avaliação

Para a expressão de mRNA de perfil, a Affymetrix matrizes de expressão foram principalmente pré-processado pelo método de correção de fundo GCRMA com normalização quantil e sumarização polonês mediana. A expressão de

SST

de genes entre diferentes grupos da amostra foi analisada por ANOVA e pós-teste de Tukey HSD. Os dados estão disponíveis no banco de dados Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), números de acesso da série:. GSE10714, GSE37364 e GSE37267

Para PCR em tempo real validação de expressão SST 12 amostras foram analisadas nos seguintes grupos: crianças, saudáveis ​​/adultos normais e CRCs adultos. Para a normalização, 18S RNA ribossomal foi utilizado como controle interno arrumação e valores DCT foram representados na boxplots. Daí dados foi normal distribuído para análise estatística ANOVA e teste de Tukey HSD pós-teste foram aplicados, a fim de determinar a significância. Foram utilizados os seguintes critérios: Dobre change≤0.5 ou Fold change≥2 e valor de p 0,05

Para a análise estatística dos resultados SST de positividade do teste de análise de variância e Tukey HSD pós-teste foram aplicados.. Em ambos os critérios de significância métodos foi de p . 0,05

teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar a proporção de células Caco-2 em diferentes fases do ciclo celular (Sub-G1, G1, S, G2 e M) de grupos tratados com octreotida e no grupo de controlo. p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Os resultados da análise de arranjo de metilação foram avaliados por análise de variância e teste de Tukey HSD pós-teste para determinar e comparar as proporções de

SST

metilação do promotor na. três grupos de amostras

.

Para a análise estatística foi aplicado R 3.1.0 ambiente de estatística. Boxplots representa dados mediana e desvio padrão com valores discrepantes.

Resultados

Alterações de expressão somatostatina em estados hiperproliferativos do cólon

Os níveis de expressão de mRNA somatostatina em amostras de biópsia colorretal de juvenil saudável, adulto e cancro colorectal foram detectados utilizando 213921_at Affymetrix de sondas ID (https://www.affymetrix.com/analysis/index.affx). a expressão de ARNm de SST não se alterou durante o envelhecimento normal como juvenil saudável comparado (CH) e adultos amostras (n), no entanto, a expressão de genes diminuiu significativamente no cancro colo-rectal (CRC) (p 0,05) em comparação com adulto normal (N) amostras

(Fig. 1)

.

validação de PCR em tempo real no original, o independente e os conjuntos combinados de amostras verificou-se a uma redução significativa

expressão SST

no CRC (p . 0,05)

(Fig 2)

, e aumento da produção SST em amostras saudáveis, independentemente da idade. A análise imuno-histoquímica confirmou a produção de somatostatina quase ausente em amostras de carcinoma colorectal, em comparação com a mucosa e jovem adulto saudável do cólon no nível de proteína (P 0,05)

(Figura 3, 4).

ARNm. a análise da expressão microarray de somatostatina gene (SST) em amostras de biópsia de cólon microscopicamente normais das crianças (Ch) e adultos (n) e na biópsia de câncer colorretal (CRCs). pontos vermelhos são os valores de expressão de mRNA normalizados, boxplots representam a mediana e desvio padrão.

SST

expressão diminuiu significativamente no CRC.

Validação de mudanças de expressão de mRNA de somatostatina (

SST

) gene em amostras de cólon normal histológicas de biópsias de crianças (Ch) e adultos (N) e na amostra de biopsia de cancro colorrectal (CRCs) utilizando em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR), em conjuntos de amostras combinadas. pontos vermelhos são os valores de expressão de RT-PCR normalizadas, boxplots representam a mediana e desvio padrão. RT-PCR análise verificou a diminuiu significativamente

expressão SST

no CRC.

A detecção de células produtoras de TSM (citoplasma marrom) durante o envelhecimento normal e no cancro colorectal (CRC). As imagens foram tiradas com microscópio digital: tecido criança normal (CH) (ampliação de 80 vezes), tecido adulto normal (N) (ampliação de 55 vezes) e de carcinoma (CRC) em adulto (ampliação de 20 vezes). Só muito baixo nível de proteína SST poderiam ser detectados em amostras de CRC.

Detecção de somatostatina (SST) a produção de células do epitélio do cólon humano normal das crianças (Ch) e de adultos (N) e colorretal cancros (CRCs). Os pontos vermelhos são a proporção da produção de SST células em comparação com a contagem de células epitelial total (%); boxplots representam a média e desvio padrão dos dados. produção SST diminuiu significativamente no CRC.

Os efeitos anti-proliferativa de análogo de somatostatina em células de câncer colorretal

octreotide somatostatina analógico foi adicionado ao células de adenocarcinoma colorretal (Caco-2) em diferentes concentrações. Aumentou significativamente a fragmentação do ADN (população Sub-G1) foi medida por citometria de fluxo após 48 horas em comparação com as células de controlo, de um modo dependente da concentração. Em casos de tratamento análogo da somatostatina em concentrações superiores a 0,1 nmol /L, a proporção de fracções sub-G1 apoptóticos foi significativamente maior (p 0,05) do que no grupo de controlo, enquanto que a proporção de células em outras fases do ciclo celular ( G1, S, G2, H) foi significativamente inferior. O maior fração apoptótica (Sub-G1) eo menor G1, S, G2, M população foram medidos em 5,0 nmol /l de concentração de octreotida. A citometria de fluxo resultados estão resumidos na

Tabela 2, Tabela 3 e

fig. 5

.

Porcentagem de células no controle e grupos tratados com octreotida com valores de médias e desvios padrão. colunas azuis representam as células em fase de Sub-G1 e as proporções de células em G1 + S + G2 + M fase são ilustrados por colunas vermelhas. Em concentrações superiores a 0,1 nmol /l de octreotida adicional, a proporção da fracção sub-G1 apoptose foi significativamente maior (p 0,05) do que no grupo de controlo, enquanto que a proporção de células em outras fases do ciclo celular (G1 + S + G2 + M) foi significativamente inferior. O maior fração apoptótica (Sub-G1) ea menor (G1 + S + G2 + M) da população foram medidos em 5,0 nmol concentração /l octreotide.

DNA promotor SST alterações de metilação em estados hiperproliferativos do cólon

metilação do promotor do gene da somatostatina aumentou durante o envelhecimento normal e carcinogênese. A menor

SST

metilação do promotor foi encontrada no epitélio do cólon juvenil (3,5% ± 1,9%), que pode ser caracterizado pelo aumento da proliferação controlada, célula. No entanto, no cancro colo-rectal em que o aumento do crescimento celular desregulado é,

SST

metilação foi significativamente maior (30,2% ± 11,6%) (p 0,05). O mais alto estado de metilação foi detectado no CRC

(Fig. 6)

.

Avaliação da metilação do promotor de

gene SST

em amostras de biópsia colorretais normais das crianças (Ch) e dos adultos (N) e em cancros colo (CRCs) usando a enzima de restrição análise de arranjo de metilação sensível à metilação. pontos vermelhos são os valores metilação do promotor de

SST

(%); boxplots representam a média e desvio padrão. O promotor metilação aumenta durante o envelhecimento normal e carcinogênese, ea taxa de metilação mais elevada foi detectada nas amostras tumorais.

Discussão

O câncer colorretal é um dos tumores malignos mais frequentes com pobres resultado em casos avançados. A sua incidência é baixa sob a idade de 50, no entanto, ele aumenta rapidamente nos grupos etários mais velhos. Nos países desenvolvidos, a média de idade no momento do diagnóstico é cerca de 70 anos [8] e, na maioria dos casos CRC é diagnosticada com idade superior a 65 [22]. Portanto, a idade pode ser considerada como um factor de risco dominante para a carcinogénese colorrectal [23]. Anteriormente, demonstrou que a proliferação celular elevado é uma característica comum de epitélio colorrectal tanto na infância e no cancro, com a diferença significativa do controlo da proliferação celular no cancro [18]. Neste estudo foi demonstrado tanto em níveis de ARNm e de proteína que a somatostatina expressão não diferem significativamente no epitélio do cólon idosos saudáveis ​​em comparação com amostras de menores, no entanto, é praticamente ausente no cancro colo-rectal. A região promotora de

gene SST

foi encontrado para ser hipermetilado em biópsias de CRC, que pode ser parcialmente revertida por desmetilação em linhas celulares de cancro. Uma vez que o tratamento com o análogo de somatostatina octreótido resultou em proliferação celular reduzida e apoptose elevada numa linha celular de adenocarcinoma colo-rectal humano, os nossos resultados sugerem que a falta de produção de SST local pode contribuir para a proliferação celular elevado e descontrolado no CRC.

gastrointestinal (GI) hormonas (por exemplo, a somatostatina, colecistoquinina (CCK), gastrina, bombesina (BBS) /péptido de libertação da gastrina (GRP), neurotensina (NT), péptido YY (PYY), péptido tipo glucagon 2 (GLP-2) ) são secretadas por células endócrinas, que estão localizados na mucosa intestinal e do pâncreas. Estes mensageiros químicos regular intestinal e secreção pancreática, a digestão, a absorção, a motilidade e a proliferação celular. A somatostatina é um péptido regulador-inibidora, que pode ser considerado como uma hormona de desactivação universal e, além disso, pode inibir o crescimento celular em tecidos normais e neoplásicos. SST tem endócrina e parácrina /efeitos autócrinos, e pode se ligar aos seus receptores da superfície celular G acoplados à proteína (SSTR1-5) iniciar vias de transdução de sinal [24].

Neste estudo, descobriram que a proporção de somatostatina produzir células é inferior a 1% em epitélio de jovens e adultos do cólon histologicamente normal, e significativamente reduzida em amostras tumorais. Estudos imuno-histoquímicos anteriores demonstraram dupla localização de somatostatina ser tanto em células endócrinas D-nervos e no intestino grosso [25]. Além disso,

Parsons et al

. também descobriram baixo número relativo de células positivas TSM no epitélio do cólon [26]. Em nosso grupo de trabalho

Galamb et al

. genes anteriormente identificados (por exemplo,

AMN, PTGDR

) com a diminuição da expressão durante a tumorigénese colorectal [20,27]. Da mesma forma para estes marcadores, diminuiu significativamente a produção de SST pode também contribuir para a formação de cancro colo-rectal.

Devido aos efeitos de SST no tracto GI, análogos SST pode ser aplicada de forma eficaz em distúrbios intestinais não-neoplásicas, tais como aguda das varizes sangramento, fístula pancreática, síndrome de dumping, ou em alguns casos de diarréia crônica e pseudoconstipação [28].

Aplicação de análogos de SST é generalizada em relação ao diagnóstico e terapia de tumores neuroendócrinos [29-31]. O diagnóstico desses tumores pode ser difícil e demorado, que pode piorar a possibilidade de uma intervenção terapêutica eficaz [30]. análogos de somatostatina marcados radioactivamente pode evidenciar a localização de tumores primários e metastáticos que expressam receptores de somatostatina que não pode ser detectada com técnicas de imagiologia convencionais devido ao seu tamanho pequeno, [32]. Além disso, a somatostatina e os seus derivados têm vários efeitos positivos no tratamento de neoplasmas neuroendócrinos. A inibição da hipersecreção hormonal pode proporcionar alívio sintomático e encolhimento do tumor [7]. análogos SST pode inibir a produção de GH e IGF, factores promotores de crescimento de cancro [33]. Eles podem inibir a angiogénese [34,35], podem desempenhar um papel immunemodulatory [36,37], e pode causar a paragem do ciclo celular e induzir a apoptose através de receptores de somatostatina [11,14]. análogos de TSM pode ser drogas mais seguras para o uso a longo prazo do que quimioterapias citotóxicas, porque eles têm menos e mais leves efeitos colaterais como queixas gastrointestinais, colelitíase e efeitos sobre o metabolismo da glicose [30].

SST cintilografia análogo pode ser aplicado para diagnóstico de desordens imuno-mediadas (por exemplo, linfomas, doença granulomatosa ou artrite reumatóide) [38-41] e tumores não-neuroendócrinos, bem como [42]. Há várias experiências de cultura de células, modelos animais e estudos clínicos que investigaram os efeitos positivos dos análogos de TSM em tumores malignos, incluindo linfomas, cancro da mama e cancro da próstata [43-47].

Em um estudo clínico o efeito de octreotida foi investigada em pacientes de quimioterapia refratária com câncer gástrico. melhoria significativa na sobrevivência foi observada no grupo tratado, em comparação com o grupo de cuidados melhor-suporte [48]. O impacto positivo do tratamento com análogos de SST em carcinoma hepatocelular (HCC) não é clara. Em alguns casos a administração de octreotida melhorou a sobrevida mediana pacientes não tratados em comparação [49,50], mas estudo subsequente no maior população não mostrou benefício de sobrevivência para pacientes com CHC avançado tratados com octreotide de ação prolongada em comparação com o placebo [51].