Sumário

num modelo de xenoenxerto em que, as células de cancro renal vivos foram implantados sob a cápsula renal em ratos, revelaram um aumento de 30 vezes no volume do tumor ao longo de um período de 26 dias e este foi acompanhada com um aumento de 32 vezes no nível de lactosilceramida (LacCer). Os ratos alimentados com D-treo-1-fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1-propanol (D-PDMP), um inibidor da sintase da glucosilceramida sintase e lactosilceramida (LCS: p-1,4-GalT-V), mostrou marcada redução no volume do tumor. Isto foi acompanhado por uma diminuição na massa de lactosilceramida e um aumento no nível de glucosilceramida (GlcCer). estudos sobre os mecanismos revelou que D-PDMP inibiu a proliferação celular e angiogênese ao inibir p44MAPK, p-AKT-1 via e-alvo mamífero da rapamicina (mTOR). Ao ligar síntese glicoesfingolipídio com o crescimento de tumores, progressão e regressão do cancro renal pode ser avaliada. Assim, inibindo a síntese de glicosfingolípidos pode ser um alvo genuíno para prevenir a progressão de outros tipos de cancro

citação:. Chatterjee S, Alsaeedi N, Hou J, Bandaru VVR, Wu L, Halushka MK, et ai. (2013) A utilização de um Inibidor de glicolípido para melhorar cancro renal num modelo de ratinho. PLoS ONE 8 (5): e63726. doi: 10.1371 /journal.pone.0063726

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Setembro, 2012; Aceito: 05 de abril de 2013; Publicado em: 09 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chatterjee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi financiado através Tedco, Estado de subvenção Maryland, apoio institucional da Universidade Johns Hopkins e um dos Institutos Nacionais de Saúde concede PO-1-HL-107153-01. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. SC serve no conselho científico da Amalyte Pharmaceuticals e não receber honorários por seus serviços e essas informações são armazenadas nos registros eOPC institucionais. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Todos os outros autores não têm interesses financeiros concorrentes

Introdução

Estudos recentes sugerem que esfingolipídeos pode induzir fenótipos como a proliferação, adesão e angiogênese-as marcas no crescimento de tumores e metástases [1] -. [ ,,,0],6]. A aplicação de drogas que inibem a síntese de glicoesfingolipídeos de proporcionar uma oportunidade para examinar o papel destes compostos em modelos animais de doença humana. Aqui demonstramos que o ligando síntese glicosfingolípidos e a sua inibição em um modelo de ratinho de cancro renal, é possível observar a presença de interacções entre fármaco e glicosfingolípidos enzimas metabolizantes e para prever o início da progressão da doença /tumores e a regressão do tumor. Bloqueando a glicosilação de ceramida para tratar o câncer tem sido documentada em células e em modelos animais [2], [3].

Os tumores exigem a formação de novos vasos sanguíneos a partir de pré-existentes (angiogénese) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) tem um papel crítico na indução da angiogénese em uma variedade de tumores [4], [5]. Portanto, racionalizada que a segmentação células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos tumorais, que são enriquecidos com uma isoforma de LCS pode ter várias vantagens teóricas, como a segmentação de entrega de drogas em vários tipos de câncer. O nosso raciocínio decorre nossas descobertas anteriores, em que o VEGF foi mostrada para estimular LCS: actividade β-1,4-GalT-V em células endoteliais arteriais humanos para produzir LacCer, e que resultou na activação do “oxigénio sensível” percurso que conduz à sinalização angiogénese [4]. Além disso, a utilização de pequenos ARN interferente (siRNA) para fazer com que o LCS: p-1,4-GalT-V ablação gene ou a manipulação farmacológica pela utilização de D-PDMP, um inibidor da uridina difosfato de ceramida glicosiltransferase glicose (UGCG), e a angiogénese induzida por VEGF LCS [7], marcadamente atenuados [5]. Além disso, observou-se que D-PDMP pode significativamente (

P Art 0,0005) mitigar VEGF /β-FGF angiogênese induzida

in vivo

em ratinhos nus [4] e inibir metástases experimentais de murino carcinoma do pulmão de Lewis [8].

O objetivo deste estudo foi determinar se a inibição da síntese de glicoesfingolipídio também inibir a proliferação celular /reduzir o volume tumoral

in vitro

e

in vivo

. Este estudo atingiu o objectivo que a inibição da síntese glicoesfingolipídio também inibir a proliferação celular /reduzir o volume tumoral

in vitro

e

in vivo

.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pelo animal Care Medicine Institucional e Use Committee Johns Hopkins, licença # MO03M615. Os esforços relevantes tomadas para amenizar o sofrimento dos animais, incluindo anestesia (cetamina e xilazina) e pós-cirurgia de follow-up (verificação periódica em animais por até 8 horas pós-cirurgia). pomada antibiótica foi administrado no local da incisão e uma pomada óptica foi aplicada para evitar que os olhos sequem durante a cirurgia.

Experimentos com camundongos

O câncer renal do rato (RENCA) suspensão de células foi carregado para uma seringa de 1 ml. Os ratinhos receptores (ratos Balb /c) foram pré-anestesiados com injecção i.p. injecção (100 uL) de uma solução de estoque de cetamina /xilazina (8 mg /kg), fixado a uma placa ligada à terra com a pele do dorso rapada e preparada de um modo estéril. Foi feita uma incisão no flanco esquerdo e o rim esquerdo e exteriorizado. 100 uL de suspensão de células de tumor (1 × 10

6 células /inóculo) foi injectado no espaço subcapsular do rim esquerdo. O rim foi então colocada na posição original e a incisão foi fechada com grampos de metal estéril seguras. Tratamento experimental começou 2 dias após a implantação do tumor subcapsular. Os ratinhos foram alimentados por sonda esofágica oral de D-PDMP (3 e 10 mg /kg de peso corporal) por dia. D-PDMP foi solubilizada em 5% de Tween-80 em solução salina. Dez ratos (N = 10) foram usadas em cada grupo.

O grupo placebo de ratinhos possuindo o implante de tumor receberam diariamente, um volume igual de 100 uL de veículo. Após este procedimento, os animais foram monitorizados diariamente. Ponto final deste conjunto de experiências foi a avaliação do crescimento tumoral no rim. monitorização do crescimento do tumor em animais implantados ortotopicamente no rim foi realizada por palpação manual de duas vezes por semana. Após 4 semanas, 26-28 (dia pós-implantação do tumor), os animais foram sacrificados com CO

2 e autopsiados. medida de crescimento do tumor foi efectuada por avaliação directa peso do tumor no final da experiência.

Estudos histológicos

tumores primários foram enviados para a histologia (N = 4). As secções de tecido foram coradas com hematoxilina e -eosin com anticorpos contra CD31 (um importante marcador de angiogênese) e caspase-3 (um importante marcador de apoptose). anticorpo Lactosilceramida (CD17) foi adquirido da Ancell Laboratories e foi utilizado para identificar a localização de LacCer no tecido renal. Os tecidos foram colhidos de os outros 4 ratos e utilizados em Biochemical /ensaios moleculares descritos no texto.

Extracção de D-PDMP e esfingolípidos

extracção das amostras foi realizada utilizando uma Bligh e Dyer modificada procedimento como descrito anteriormente [9]. Cada amostra foi homogeneizada a temperatura ambiente em 10 volumes de água desionizada. Três volumes de 100% CH

3OH contendo HCOONH 53 mM

4, 17 ng /ml C

12:00 ceramida, e 17 ng /ml C

12:00 esfingomielina (normas internas, IS ) foi adicionado, e a mistura foi submetida a vórtice. Quatro volumes de CHCl

3 foram adicionados, agitadas, e então centrifugada a 1000 ×

g

durante 10 minutos. 100 ul da CHCl

3 camada foi separada, seca sob uma corrente de azoto, e o resíduo foi dissolvido em metanol a 100% contendo 10 ng /ml de C

2:00 ceramida como um padrão interno para quantificação de D -PDMP. Em seguida, as amostras foram transferidas para pastilhas frasco para injectáveis ​​de análise /MS /MS LC; 10 ul foi injectado no LC /MS /MS. Todos os solventes e produtos químicos eram de grau HPLC. Lipid extracções foram realizadas utilizando tubos de vidro de borossilicato revestido com pipetas e, para reduzir a adesão de lípidos de superfícies.

A análise por LC /MS /MS para esfingolípidos e D-PDMP

de identificação de espécies de Esfingolipídeos e D-PDMP foi realizada usando uma cromatografia líquida de espectrómetro de ionização por electrospray de massa em tandem 3000 PE Sciex, operado no modo positivo (LC-ESI /MS /MS; Applied Biosystems, Thornhill, Ontário, Canadá), e de acordo com métodos reportados em estudos anteriores [ ,,,0],10]. O sistema consiste em duas bombas conectadas a um HTC PAL auto-injector (Análise CTC, Zwingen, Suíça) equipado com um circuito de amostra de 50 ul da Perkin Elmer LC. taxa de fluxo foi de 400 ul /min durante ceramidas e 1 ml /min durante esfingomielinas. O fluxo da amostra injector conduzido a uma coluna de 2,6 uM C durante ceramidas e D-PDMP, e um 5 um C

18 coluna para esfingomielinas (Phenomenex, Torrance, CA). A coluna foi pré-equilibrada durante 0,1 minutos com o solvente A consistiu em que CH

3OH: dH

2O (85:15, v /v) com 5 mM HCO

2NH

4, eo amostra foi eluída com o solvente B que consistia de CH

3OH: HCOOH (99:1, v /v) com 5 mM HCO

2NH

4. A amostra eluida foi introduzido automaticamente na fonte de iões. parâmetros do instrumento para a LC-ESI /MS /MS foram optimizadas individualmente para cada uma das espécies de ceramida, ceramida-1-fosfato, esfingosina, esfinganina, sphigosine-1-fosfato, esfingomielina, e D-PDMP por monitorização de reacção múltipla. Ceramidas e esfingomielinas foram quantificados pela área sob a curva (AUC) de contagens por segundo (CPS) normalizados para os padrões internos (ceramida C

0:00 e esfingomielina C

0:00). As concentrações de D-PDMP foram determinados através da criação de uma curva padrão que foi construído utilizando as proporções dos padrões de referência (D-PDMP; 0,1-100 ug /ml) a IS (ceramida C

02:00; 10 ng /ml) representada contra os rácios de referência e está a partir de amostras experimentais. Todas as soluções de estoque foram armazenadas a -20 ° C e estável ao longo de 6 meses.

glicosiltransferase e ensaios de actividade glycosylhydrolase

LCS actividade em preparações de rim foi medida utilizando um protocolo detalhado anteriormente [11] com o alterações posteriores. Resumidamente, rapidamente congelados de tecido de rim foram homogeneizados em tampão Tris-HCl (pH 7,4) contendo Triton-X-100 e centrifugado a 10000 rpm durante 15 min. A massa de proteína no sobrenadante foi medida e 100 ug de proteína de amostra foi utilizado em ensaios enzimáticos, em triplicado. 14C-UDP-galactose (American radiomarcador Company, St. Louis, MO) serviu como o dador de galactose. E glucosilceramida (Matreya Chemicals, PA) serviu como o aceitador neste ensaio. 14C-LacCer gerado a partir deste ensaio foi quantificada por espectrofotometria de cintilação. A glucosilceramida sintase actividade foi medida usando ceramida como o aceitador e [3H] UDP-glicose como o dador de glucose. A glucosilceramida actividade hidrolase foi medida utilizando [3H] glucosilceramida (American radiomarcador Company), como o substrato de acordo com protocolos anteriormente publicados.

estudos Western immunoblot

rins foram colhidas a partir de controlo, placebo, 3 MPK e 10 MPK de D-PDMP alimentados oralmente e diariamente a ratinhos. Os tecidos de rins foram homogeneizados em tampão de RIPA (Sigma Aldrich), colocada em gelo durante 15 minutos, centrifugada a 13000 rpm, e os sobrenadantes foram recolhidos. Para determinar a concentração de proteína, foi utilizado Ensaio de Bradford. Para um gel de 4-15% (Bio-Rad Pronto gel), 45-90 ng de amostras de proteína e 10 uL de padrão de proteína de baixo peso molecular (Bio-Rad Precision Plus Dual cor) foram carregados. Após electroforese em gel, durante 1,5 h, as membranas PVDF Immuno-Blot (Bio-Rad) foram embebidos em metanol frio, dH

2O, e tampão de transferência (Bio-Rad). Em seguida, o gel foi transferido para uma membrana de PVDF (Bio-Rad), a 30 V durante a noite. As membranas foram bloqueadas em 3% de leite, 1 × TBST (0,05% de Tween-20), incubadas em anticorpos primários contra: p-1,4-GalT-V, beta actina, UGCG (Santa Cruz Biotechnology), GAPDH (gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase, EUA Biológica), p44MAPK (Thr202 e Tyr204), p-AKT-1 (Thr308) (Cell Signaling Technologies) e mTOR (Sigma-Aldrich) em TBS 1 × com diluição 1:200 e 0,5% de BSA e incubadas em anticorpo secundário, de cabra anti-IgG de coelho conjugado com HRP (Sigma Aldrich) em leite a 5%, 1 x com TBST 1:1000 diluição. Todos os anticorpos primários necessários incubação durante a noite a 4 ° C, enquanto que os anticorpos secundários exigido 1 h de incubação à temperatura ambiente. Em seguida, as membranas foram lavadas em TBST durante 1 × 5-10 minutos e repetida 2 vezes e desenvolvidos utilizando o kit ECL (Amersham ECL Plus ™ Western Blotting Detection Reagents).

assistido por computador CAD quantificação da caspase-3 e CD31 células positivas

Todos os imunohistoquimicamente lâminas coradas foram digitalizados usando um Aperio CS ScanScope (Vista, CA). Para a análise de caspase-3, o evento raro e algoritmos nucleares do Kit Aperio Caixa de ferramentas foram utilizados. O detector evento raro identificadas células positivas caspase, que foram confirmados por mão-de curadoria. Este valor foi dividido pela contagem total de células da superfície determinada pelo algoritmo nuclear. área de CD31 foi identificado dividindo uma área de máscara positiva CD31 pela área da máscara tumor viável para cada slide, como da mesma forma descrita [12].

Estudos estatísticos

Os dados são expressos como a média ± desvio padrão e como uma medida de erro padrão da média ±. A diferença significativa entre o controle, placebo, e grupo experimental foi avaliada por meio do estudante

t

teste e uma maneira ANOVA. comparação sábio par foi feito para determinar a significância entre os diferentes tratamentos. As diferenças foram consideradas significativas para

P

. 0,05

Resultados

Observamos que D-PDMP mas não L-PDMP inibiu o crescimento de células RENCA (veja a figura S1 ). Portanto, a hipótese de que a inibição da actividade LCS e reduzindo a carga LacCer pode muito bem reduzir o câncer renal em camundongos. Neste estudo, utilizou-D-PDMP uma vez que não é tóxico e é absorvido pelo rim, cérebro e fígado, quando administrados por via oral a ratinhos [13]. Além disso, ele é rapidamente eliminado pelo sistema do citocromo P450 como t

1/2 é -50 minutos, [13]. Embora D-PDMP foi sintetizado para mitigar a doença de Gaucher pela inibição da atividade UGCG, mostramos que ele também inibiu a produção de LCS atividade-LacCer e, assim, a angiogênese

in vitro

e

in vivo

, ratinhos nus em [5]. Aqui, demonstramos que a inibição da actividade LCS e produção LacCer especificamente são centrais para os eventos de sinalização, tais como a angiogénese e a proliferação que levam a uma redução marcada do volume tumoral num modelo de ratinho de cancro renal.

Uma semana após a aplicação, o tumor primário foi macroscopicamente visível; após 10 dias a metástase espontânea desenvolvido nos gânglios linfáticos regionais, pulmão, peritoneu, e no fígado, permitindo que o modelo RENCA para ser encenada semelhante para carcinoma de células renais humanos. O tempo médio de sobrevivência de ratos RENCA de rolamento é de 32 dias em 10 células

6 RENCA são injetados. Para determinar se a alteração no perfil glicoesfingolipídio é uma característica importante no cancro renal, comparamos o nível desses lipídios no rim controle (não tendo RENCA) versus placebo ratos renal (tendo RENCA). Simultaneamente, foram examinados os efeitos da alimentação D-PDMP em níveis de volume do tumor e de lipídios no tecido renal. Observou-se que a implantação de células RENCA no espaço subcapsular no rim esquerdo (ratinhos placebo, e nenhum tratamento) contribuiu para aumento de ~ 30 vezes no volume do tumor, ao longo de um período de ~26 dias (Figura 1A). O peso corporal, não se alterou (Figura 1B) e 20% dos ratinhos no grupo de placebo morreram. alimentação oral de 3 MPK D-PDMP e 10 MPK D-PDMP para o período experimental reduziu o volume do tumor de ~ 50% do placebo tumores do mouse nos rins. Esta diminuição da dose independente D-PDMP no volume do tumor pode, em parte, ser explicados pela nossa observação de que o nível de D-PDMP (medido utilizando LC-MS /MS) no tecido renal foi semelhante (Figura 1C) como for foram rapidamente excretados. em tandem detalhada LC-MS /MS revelou que C24, C16 e C22 foram as principais espécies moleculares de ácidos gordos em ceramida, mono e di hexosylceramide e esfingomielina em controlo, placebo, e tecido renal ratinhos D-PDMP-alimentado. E C20, C18 e C26 foram as esfingolipídeos ácidos graxos contendo menores (Figura S2). O nível total de ceramida aumentou -2,5 vezes no rim do rato placebo versus controle. Curiosamente, alimentando 3 MPK D-PDMP não alterou o nível de ceramida no rim, em comparação com o placebo (Figura 2A). No entanto, em 10 ratinhos MPK D-PDMP alimentados, o nível de ceramida diminuiu para controlar o nível de. Assim, apesar de D-PDMP é reivindicado como sendo um inibidor específico da UGCG e contribuindo assim para um aumento nos níveis de ceramida, no presente estudo, não elevar os níveis tecidulares de ceramida no rim do rato. E esta observação está de acordo com um relatório anterior que mostrou que D-PDMP (100 MPK) diminuiu ceramida renal level~9% 5 horas mais tarde [13]. Injectar 40 MPK D-PDMP duas vezes por dia durante 4 dias, também resultou num decréscimo de 23% em ceramida no rim [13]. Em outro estudo usando o iminoaçúcar N- (5-adamantinane-1′-il-metoxi) pentil-1-deoxynoijirimycin (AMP-DNM), um inibidor de UGCG também não aumentar os níveis de ceramida no fígado e mantido o nível plasmático de ceramida ao nível basal em hiperlipidemia dieta induzida em apoE – /- ratos [14]. As razões para uma diminuição mediada D-PDMP no nível de ceramida no rim do rato não está claro a partir deste estudo. Dado que a ceramida é um precursor directo da síntese de esfingomielina, que o previsto um nível mais elevado de esfingomielina em ratinhos tratados com D-PDMP. No entanto, o nível de esfingomielina no nosso estudo e em um estudo anterior [13] não se alterou de forma significativa (Figura 2H). Isto poderia ser porque enquanto um maior conjunto de ceramida poderia induzir um aumento na síntese esfingomielina; No entanto, uma vez que D-PDMP também aumenta a actividade da esf ingomielinase, que pode ajudar a manter a homeostase esfingomielina [13]. Ceramida podem também ser hidrolisados ​​para gerar a esfingosina e seus derivados (figura 2C-E). Por exemplo, os nossos estudos adicionais revelaram que o nível de ceramida-1-fosfato (Figura 2B), esfingosina (Figura 2C), esf ingosina-1-fosfato (Figura 2D) e esfinganina (Figura 2E) variou no rim do rato placebo, em comparação com o controlo e após o tratamento com D-PDMP. Em particular, o aumento de 20 vezes no nível de esfingosina-1-fosfato em rato placebo versus controlo foi observado. O tratamento com 3-D MPK PDMP não diminuir o nível de esfingosina-1-fosfato em comparação com o placebo do rim do rato. No entanto, após a alimentação 10 MPK D-PDMP, observou-se uma diminuição de 50% no nível deste lipídico. O nível de monohexosil ceramidas foi elevada de 5 vezes no rato do placebo comparativamente com o de rim de ratinho de controlo, mas não se alterou após a alimentação 3 MPK D-PDMP (Figura 2F). Surpreendentemente, o nível do referido lípido aumentaram ligeiramente após a alimentação 10 MPK de D-PDMP. Esta observação pode ser interpretada para indicar uma diminuição de compensação do nível de LacCer em ratinhos tratados com 10 MPK de D-PDMP que diminuiu a actividade de sintase LacCer. Assim, um resultado inesperado deste estudo é que a longo prazo (26 dias) de alimentação de D-PDMP não diminuir o nível de monoglycosylceramides no rim do rato, embora D-PDMP foi mostrado anteriormente para servir como um inibidor da síntese de glucosilceramida. O maior aumento no nível de dihexosylceramide, ~32 vezes, ocorreram no rim do placebo comparativamente com o controlo. No entanto, o nível de lactosilceramida diminuição dependente da dose em ratinhos alimentados com 3 MPK e 10 MPK de D-PDMP (Figura 2G). Isto foi acompanhado por uma diminuição dependente da dose D-PDMP na actividade de LacCer sintase (Figura 3C), mas não GlcCer sintase (Figura 3A). Em contraste, observou-se que a actividade da hidrolase de glucosilceramida diminuído, com um aumento na dose de D-PDMP de 3 mpk e 10 MPK (Figura 3B). A atividade reduzida de glicosidase glicosilceramida em ratinhos tratados com 10 MPK D-PDMP (Figura 3B) pode ter contribuído para um aumento do nível de GlcCer (Figura 2F). Curiosamente, o nível de esf ingomielina não se alterou em controlo, placebo, e de rim de rato D-PDMP-alimentada (figura 2H). Em resumo, o aumento do volume do tumor em ratinhos portadores de rim RENCA e a sua redução por tratamento com D-PDMP melhor correlacionada com os níveis de massa LacCer, em comparação com qualquer outro esfingolípidos investigados neste estudo.

Os ratinhos (BALB /C) foram pré-anestesiados e suspensão de células tumorais RENCA (10

6 células) foi injectado no espaço subcapsular do rim esquerdo. tratamento experimental começou dois dias após a implantação do tumor subcapsular. Os ratos alimentados por sonda esofágica oral de D-PDMP (3 e 10 mg /kg de peso corporal, MPK) diariamente. D-PDMP foi solubilizada em 5% de Tween-80 em solução salina. ratinhos placebo receberam o veículo (5% de Tween-80 em solução salina 100 ul apenas). Após 26 dias, os ratinhos foram sacrificados. O rim direito serviu como controle, e o rim esquerdo serviu como placebo ou drogas tratado com 3 e 10 MPK da D-PDMP. A: um aumento acentuado no volume do tumor do rato rim é drasticamente diminuída pela alimentação D-PDMP. B. D-PDMP (3 e 10 MPK) não reduzir o peso total do corpo nos ratos. C: O nível de D-PDMP em rim de ratinhos tratados com 3 e 10 MPK de D-PDMP foram semelhantes

O nível de vários esfingolípidos em tandem foram medidos por LC-MS /MS.. A: D-PDMP diminuiu o nível de ceramida, B: ceramida-1-fosfato, e D: esfingosina-1-fosfato. D-PDMP aumentou modestamente o nível de esfingosina; C, E: esfinganina e F: monohexosylceramide. L: D-PDMP dependente da dose diminuiu o nível de dihexosylceramide em ratinhos cancro renal. H: D-PDMP não alterou o nível de esfingomielina em cancro renal do rato. (* P 0,05, ** p 0,01 N = 4).

Medição da actividade de sintase lactosilceramida no rim do rato foi realizado utilizando UDP [14C] galactose como dador de galactose e GlcCer como o aceitadora, tal como descrito [11]. Observou-se que a alimentação de D-PDMP dependente da dose, reduziu a actividade desta enzima A: actividade de sintase glucosilceramida foi reduzida na mesma medida, independentemente de 3 MPK ou 10 MPK de D-PDMP foi alimentado a ratos com cancro renal, B: glucosylceramidehydrolase a actividade foi reduzida por tratamento de D-PDMP e C:. lactosilceramida actividade de sintase foi dependente da dose diminuiu em ratinhos alimentados com D-PDMP com cancro renal (N = 4; * p 0,05)

Próximo , usando um anticorpo monoclonal comercialmente disponível contra LacCer, verificou-se se LacCer foi um dos principais lípido acumulando no cancro renal. Nossos estudos de imuno-histoquímica revelou a acumulação de grandes quantidades de lactosilceramida dentro de vesículas citoplasmáticas (setas brancas) exclusivamente em células cancerosas (comparar Figura S3A; mancha DAPI vs. Figura S3B anticorpo CD17 células coradas). Anteriormente, mostrámos que nas células tubulares proximais renais tumorais humanas, a actividade da LCS é aumentada, e este é acompanhada com um aumento no nível de LacCer, em comparação com rins humanos normais [15]. Aumento do nível de LacCer também tem sido relatada em cancro renal humano [16]. Estes resultados sugerem que, no modelo de ratinho de cancro renal, o aumento da massa lactosilceramida está melhor correlacionado com o aumento do volume do tumor e a progressão da doença. Assim, a segmentação síntese de glicolípidos, em particular LCS e LacCer pode ser uma abordagem terapêutica genuíno para mitigar cancro renal.

Para compreender as vias moleculares que contribuem para a redução do volume do tumor devido a D-PDMP alimentação em ratos, nós realizados ensaios de western immunoblot de diversos biomarcadores, mostrado por outros nós e [5], [17], [18], [19] para contribuir para a proliferação celular, angiogénese, e a apoptose. Os nossos estudos mecanicistas revelou que a D-PDMP afectada uma marcada redução no volume do tumor, diminuindo a expressão de várias moléculas de sinalização envolvidas nas vias de contribuir para a proliferação celular e angiogénese. Por exemplo, houve um aumento significativo na massa de LCS no rim do rato placebo em comparação com a do controlo e esta observação pode explicar um aumento acentuado no nível LacCer no rim placebo vs controlo. D-PDMP dependente da dose, diminuiu a massa de LCS (Figura 4A). Em contraste, o nível de UGCG foi aumentada em ratinhos alimentados com D-PDMP (Figura 4A). Os biomarcadores para a proliferação celular e angiogénese e.g. p44MAPK e p-AKT-1 foram todos diminuíram em rim de ratinhos alimentados com D-PDMP comparada com a de rim de placebo (Figura 4B). Estas observações sugerem que a D-PDMP afecta a proliferação celular e angiogénese por inibição da actividade de LCS e produção LacCer. Em paralelo

in vitro

estudos, observamos que D-PDMP mas não L-PDMP dose-dependente diminuiu a proliferação de células RENCA, possivelmente devido à prisão de células na fase G2-M da célula ciclo, após tratamento com D-PDMP [20] (Figura S1).

imunoblots representativos de extractos de tecido a partir de ratinhos BALB /c alimentados com veículo (placebo mais RENCA células /tumor) e 3 e 10 MPK de D- PDMP por 26 dias e renal controle e varrimentos densitométricos correspondente são mostrados. A: D-PDMP forma dependente da dose diminuiu a expressão da proteína de LacCer sintase (β-1,4-GalT-V) (N = 3-6), no cancro renal de rato, mas um pouco aumentada a expressão da proteína de UGCG (N = 2) em câncer renal mouse. B: imunotransferências de Western de marcadores de proliferação celular (p44MAPK, N = 3), a angiogénese (pAKT-1, N = 3; mTOR, N = 3 para o placebo e 10 MPK) e arrumação GAPDH proteína. Tratamento D-PDMP reduzida para os marcadores de proliferação celular e na angiogénese. Os dados foram analisados ​​por ANOVA one-way.

A avaliação histológica dos rins revelou extenso crescimento de RENCA agressivo, com necrose acentuada. Necrose, como uma percentagem do volume do tumor foi quantificada utilizando ferramentas de análise digital [21] e verificou-se ser de 38,8%, 28,4% e 33,2%, respectivamente, para o placebo, 10 MPK e 25 MPK ratinhos tratados (Figura S4A-H). Nós mostramos anteriormente que a D-PDMP pode eficazmente inibir a angiogénese induzida por VEGF

In vitro

em células endoteliais da veia umbilical humana e células endoteliais arteriais humanos [4], [5]. Além disso, em um estudo anterior, o VEGF + β-FGF angiogênese induzida foi atenuado pela D-PDMP em camundongos [4]. Isto foi medido por uma diminuição marcada na expressão de CD31 e angiogénese. Para determinar se uma diminuição no volume do tumor renal também era devido a uma redução no fornecimento de sangue por meio de diminuição da angiogénese, foi realizada a imunocoloração para CD31 (Figura S4I, J). Houve um decréscimo acentuado na área vascular CD31 positiva nas áreas viáveis ​​de tumor (0,3% versus 0,05% para o placebo versus 25 MPK tratados ratinhos) tal como determinado usando ferramentas de análise digital [21]. Anteriormente, a mTOR tem sido estabelecido como um marcador de angiogénese e tem sido um alvo validada para mitigar vários tipos de cancro. Observou-se que a D-PDMP diminuiu marcadamente a expressão de proteínas de mTOR (Figura 4B), sugerindo que, ao inibir a angiogénese, D-PDMP privados o tumor do abastecimento de sangue e, assim, contribui para uma redução no volume do tumor. Um resultado inesperado foi que a D-PDMP diminuiu significativamente o número de células apoptóticas medidos por caspase-3 imunocoloração. A percentagem de células positivas de caspase foram de 0,09%, 0,04% e 0,03% para o placebo, 10 MPK e 25 MPK murganhos tratados, respectivamente, conforme determinado por análise digital (Figura S4K-N) [21]. Assim, a nossa

in vivo

estudos sugerem que a D-PDMP não reduz o volume do tumor através da indução de apoptose em ratos rim.

Discussão

As seguintes observações podem ser extraídas nosso presente estudo implicando o papel de glicoesfingolípidos em biologia do tumor renal. Em primeiro lugar, existe uma correlação forte e estatisticamente significativa entre o aumento do volume do tumor renal do rato e um aumento paralelo na massa de LacCer. Em segundo lugar, a inibição da actividade de glicosiltransferase glicosfingolípidos, e particularmente a diminuição da actividade e da massa da LacCer sintase estava correlacionada com uma diminuição no volume do tumor. Em terceiro lugar, embora a D-PDMP é conhecido por ser um inibidor de UGCG, que não aumentar os níveis de ceramida nos rins. Dado que a ceramida é implicada na apoptose, os nossos estudos sugerem que a D-PDMP não reduz o volume do tumor por indução de apoptose pela via de ceramida em ratinhos rim. Em vez disso, o D-PDMP inibiu uma via de sinalização induzida por LacCer contribuindo, assim, a uma inibição da proliferação celular e na angiogénese tumoral. Colectivamente, estes estudos sugerem que a inibição da glicosiltransferase glicolípido pode inibir a proliferação /angiogénese em tecidos por meio de mecanismos independentes da apoptose.

No presente estudo, um aumento de ~ 30 vezes no volume do tumor no rim do rato placebo (comparado ao de controle) foi acompanhada por um aumento igual vezes em massa LacCer. Alimentando D PDMP volume do tumor marcadamente reduzido através da diminuição da actividade enzimática do LCS, massa LCS, e consequentemente de massa LacCer, e as proteínas angiogénicas, tais como p-AKT-1 e mTOR. Em nossos estudos anteriores, observou-se que o uso de siRNA para LCS

in vitro em células endoteliais humanas

[5] e

in vivo em camundongos glioblastoma

[22] eo uso de D- PDMP neste estudo pode reduzir o volume do tumor através da mitigação angiogênese. Assim, a segmentação síntese de glicolípidos em geral e, em particular, LacCer sintase [5], [22] é uma nova abordagem para mitigar cancro renal em ratinhos. Nós também têm relatado anteriormente que a L-PDMP, que activa LacCer sintase em células endoteliais pode também induzir angiogenensis de uma maneira dose-dependente [7] e também a proliferação de células RENCA no presente estudo (ver Apêndice). Assim, a activação /inactivação de LacCer sintase por agonistas /antagonistas podem também regular a angiogénese

in vitro

e

in vivo

.

Os nossos estudos e as dos outros [13] demonstraram que a D-PDMP não é tóxico quando administrado em doses dez vezes maior do que a concentração utilizada no presente estudo. O peso corporal neste estudo não diferiram em placebo vs. ratos tratados com D-PDMP. O peso do tumor diminuiu de aproximadamente 50% em 3 MPK e 10 MPK ratinhos alimentados comparação com o placebo. No entanto, quando os ratinhos foram alimentados com maiores quantidades de D-PDMP; 25 e 50 MPK, não reduzir ainda mais o volume do tumor (dados não apresentados). Num estudo anterior, verificou-se que a t

1/2 de D-PDMP em ratinhos sangue é ~ 50 min [13]. Por conseguinte, é possível que além de um limite de 10 MPK, a maior parte deste composto é rapidamente removido por excreção e, portanto, não foi observada uma maior redução no volume do tumor. Anteriormente, D-PDMP tem sido amplamente utilizado para examinar o papel de glicosfingolípidos e glycosytransferases em proliferação liso arterial célula muscular [1], [23] relacionada, [24], a cicatrização de feridas [1], [23], [24],