Abstract

A alta taxa de mortalidade por câncer de ovário pode ser atribuída ao diagnóstico em estágio final e falta de tratamento eficaz. Apesar do enorme esforço para desenvolver terapias mais bem direcionados, a quimioterapia à base de platina continua a ser o padrão de tratamento para pacientes com câncer ovariano, e resistência ocorre em uma taxa elevada. Um dos a taxa de fatores limitantes para a tradução de novas descobertas de drogas em tratamentos clínicos tem sido a falta de modelos pré-clínicos de cancro adequados, com alto valor preditivo. Nós gerado anteriormente camundongo geneticamente modificado (GEM) modelos baseados na perturbação da

Tp53

e

Rb

com ou sem

Brca1

ou

Brca2

que se desenvolvem serosa câncer epitelial de ovário (SEOC) muito parecida com a doença humana em histológico e os níveis moleculares. Aqui, descrevemos uma adaptação destes modelos GEM para aloenxertos ortotópicos que uniformemente desenvolver tumores com curta latência e são ideais para estudos pré-clínicos de rotina. tumores ovarianos deficientes em

Brca1

responder ao tratamento com cisplatina e olaparib, um inibidor de PARP, enquanto que

Brca1

tumores do tipo -wild não respondem ao tratamento, recapitulando as sensibilidades relativas observadas nos doentes. Estes modelos de rato proporcionar a oportunidade para avaliação de terapêuticas eficazes, incluindo a previsão de respostas diferenciais em

Brca1

tipo -wild e

Brca1

tumores e desenvolvimento de biomarcadores relevantes. -deficient

Citação: Szabova L, Bupp S, Kamal M, chefe de família DB, Hernandez L, Schlomer JJ, et al. (2014) Caminho-específicos Engineered mouse aloenxerto Models Funcionalmente Recapitule serosa humana epitelial cancro do ovário. PLoS ONE 9 (4): e95649. doi: 10.1371 /journal.pone.0095649

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 10 de fevereiro de 2014; Aceito: 28 de março de 2014; Publicação: 18 de abril de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este projecto foi financiado em conjunto com os fundos federais do National Cancer Institute, National Institutes of Health, com o número do contrato HHSN261200800001E. O conteúdo desta publicação não reflecte necessariamente a posição nem as políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, nem a menção de nomes comerciais, produtos comerciais ou organizações implica o endosso pelo Governo dos EUA. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é o segundo câncer ginecológico mais comum e a causa mais frequente de mortes relacionadas ao câncer ginecológico nos EUA [1], com mais de 50% apresentando câncer epitelial de ovário como serosa (SEOC). A maioria dos SEOCs avançados se espalharam para além do ovário no momento do diagnóstico, e a sua gestão envolve cirúrgica de-volume, seguida por quimioterapia com uma combinação de platina e taxanos drogas [2], [3]. Apesar de as taxas de resposta inicialmente elevados, a maioria dos pacientes recaída com uma sobrevida livre de progressão mediana de 18 meses [4], tornando a busca de novas terapias imperativas

.

Ao longo dos últimos anos, muito progresso tem sido feito na identificação de marca registrada lesões genéticas associadas com SEOC. O estudo Cancer Genome Atlas (TCGA) de uma grande coorte SEOC alto grau revelou que mutações no

TP53

predominaram, ocorrendo em pelo menos 96% dos tumores [5]. Alterações na rede de RB foram observadas em 67% dos casos, e cerca de 20% dos tumores tinha linha germinal ou mutações somáticas no

BRCA1 /2

com um adicional de 11% depois de ter perdido a expressão BRCA1 através de silenciamento epigenético [5] .

BRCA1 e BRCA2 jogar papéis importantes na recombinação homóloga (HR), e perda de qualquer proteína leva à deficiência na dupla interrupção fita de DNA Repair (DSB) [6]. Em células HR-deficiente, LAP são reparados por mecanismos propenso a erros, o que pode conduzir a instabilidade genómica. inibição química de cadeia simples (ss) DNA reparação de quebras nas células deficientes em RH pode levar a letalidade sintética devido à ausência simultânea de duas vias de reparação do ADN [7], [8]. Na clínica, poli (ADP) inibidores da polimerase -ribose (PARPi) são submetidos a avaliação como um método de explorar a letalidade sintética para a intervenção terapêutica. A PARP-1 é necessária para a identificação de quebras de ADNcs (SSB) e recrutamento de proteínas de reparação de locais danificados em [9]. A inibição deste processo em células deficientes em BRCA-leva à acumulação de LAP, devido a garfos de replicação em colapso, e, finalmente, à morte da célula [10] – [12]. Com base nestas descobertas, PARPi foram testadas em ensaios clínicos como as terapias de combinação única ou em pacientes com tumores sólidos avançados [13] – [15]. Recentemente, o PARPi activo por via oral, olaparib (AZD2281), apresentou atividade antitumoral clínica em câncer de ovário e de mama associado a BRCA [15] – [19].

Até agora, os ensaios clínicos de novos agentes terapêuticos têm contado com estudos pré-clínicos realizados em linhas celulares e modelos de xenoenxertos da linha de células imunocomprometidos. elevadas taxas de insucesso subsequentes testes em humanos sugerem a necessidade de modelos pré-clínicos com melhor valor preditivo [20]. modelos de rato geneticamente modificadas (GEMMs) tem vantagens importantes sobre os modelos de xenoenxerto de linha de células, em que os tumores são accionados por acontecimentos genéticos definidos e surgem devido à acumulação de eventos estocásticos adicionais dentro do órgão de interesse e são, portanto, sujeitos a microambiente relevante e receber respostas de células. Vários GEMMs epiteliais de cancro do ovário que desenvolvem tumores que se assemelham a doença humana foram relatadas [21] – [25]; No entanto, estes modelos não foram adaptados para o uso eficiente em estudos pré-clínicos, e poucos recapitular a gama completa de recursos genéticos e biológicos da SEOC humano.

Anteriormente, relatou GEMMs que desenvolvem câncer de ovário com a genética e biológica características de SEOCs humanos [26]. Voltado para o epitélio de superfície do ovário, cancelamento da supressão do tumor RB (TS) iniciou doença, e

Tp53

aberração (mutação missense ou supressão) facilitou a progressão da doença para a disseminação peritoneal agressivo e metástase. tumores do ovário a partir desses modelos, incluindo aqueles com deficiência em qualquer um

Brca1

ou

Brca2

, representam todos os 4 subclasses de transcrição de SEOC humano. Aqui, nós utilizamos esses modelos para criar modelos de transplante imunocompetentes ortotópicos e gerar grupos sincronizados de ratos adequados para estudos pré-clínicos. Para determinar se esses modelos são tratáveis ​​para o uso em estudos de eficácia de rotina e se suas respostas terapêuticas reflectir os resultados observados nos ensaios humanos, foi realizado um tratamento único ou a combinação com a quimioterapia platina padrão e olaparib. Como observado em pacientes, a resposta ao tratamento foi dependente

Brca1

de estado, demonstrando assim a utilidade destes modelos para avaliar a eficácia potencial de novas terapias para o câncer de ovário.

Material e Métodos

animais experimentais

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo animal estudo aprovado pelo Comitê Institucional de animal Care and Use of Frederick Laboratório Nacional de Pesquisa do Câncer e do National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório. FNLCR é credenciado pela AAALAC Internacional e segue a Política de Serviço de Saúde Pública para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. cuidados com os animais foi fornecido de acordo com os procedimentos descritos no “Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório” (National Research Council, 1996; National Academy Press, Washington, DC). Os animais foram mantidos numa instalação de barreira em FNLCR sob HEPA filtração em gaiolas micro isoladoras e alimentados com dieta de roedores autoclavada de laboratório (LabDiet, St. Louis, MO). Todos os procedimentos com animais foram realizadas sob anestesia com inalação de 1-2,5% de isoflurano. O ponto final para os ratos foi a alteração na saúde geral, especificamente 20% de perda de peso corporal, a incapacidade de comer, beber, ou deambular, postura arqueada, dificuldade em respirar ou sinais de hipotermia, bem como sinais de ascite com distensão abdominal e do tumor palpável de cerca de 2 cm de tamanho. Os animais que apresentaram sinais clínicos, o crescimento do tumor sólido de 2 centímetros, ou tornou-se moribunda antes da expansão máxima ascite (duplicação aproximada da largura do abdome) foram prontamente sacrificados por inalação de CO2.

informações estirpe de ratinhos detalhada e geração de adenovirally modelos SEOC induzidas foram descritos anteriormente [26]. Bege nu [Cr: NIH-bg-nu-Xid], atímicos nu [atímicos NCr-nu /nu] e FVB [FVB /NCr] ratos fêmeas foram obtidos a partir do Programa de Produção Animal, FNLCR ou a partir de Jackson Laboratories [FVB /NJ ].

transplante de tumor ortotópico

para realizar o transplante do tumor ortotópico, a região lombar das fêmeas FVB (5-8 semanas de idade) foi raspada, os animais foram anestesiados e a pele foi assepticamente preparada para a cirurgia . A incisão na pele foi feita longitudinais laterais na região do flanco que se sobrepõe ao ovário direito e outra pequena incisão foi feita no peritoneu. O ovário exposta, com a almofada de gordura ao redor, foi exteriorizado e um fragmento de tumor pequeno de doadores (cerca de 2 mm) foi inserido sob a bursa através de uma pequena lágrima cirúrgico. Os ovários foram substituídos volta para a cavidade abdominal, o peritônio foi suturada ea pele fechada com grampos metálicos.

As culturas de células

linha de células de carcinoma de ovário humano HeyA8 foi um presente do Dr. Elise Kohn , NCI, e foi originalmente descrito em [27]; linhas 1A9 e presentes resistentes à cisplatina 1A9CP80 eram de Dr. Tito Fojo (NCI), e foram derivados como em [28], [29];

BRCA1

linha mutante UWB1.289 foi obtida a partir de ATCC (Manassas, VA). Todas as linhas de ovário foram cultivadas em meio RPMI (Life Technologies, Grand Island, NY) com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Pittsburg, PA) e antibióticos padrão; 1A9CP80 meio celular foi suplementado com cisplatina 80 mM (Tocris, Bristol, Reino Unido). Um procedimento detalhado para o estabelecimento de linhas celulares de cancro de ovário murino é fornecida em dados S1.

In vitro

ensaios de citotoxicidade

A viabilidade das células de cancro do ovário em anexo foi avaliada usando XTT como descrito [30]. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1-2.000 células /50 ul /poço e incubou-se durante 24 h. A cisplatina (Tocris, Bristol, Reino Unido) e olaparibe (AZD2281, Selleck Chemicals, Houston, TX) foram preparadas em sulfóxido de dimetilo (DMSO) existências e aplicado a células plaqueadas a partir de soluções de trabalho recentemente preparadas diluídos em série em meio. As células foram reabastecidos com as drogas frescas após 3 dias e a viabilidade foi determinada após 7 dias por incubação com culturas de XTT e medindo a absorvância usando leitor de placa Tecan F200 (Research Triangle Park, NC). A densidade celular em poços tratados foi exprimida como percentagem do controlo. As experiências incluíram amostras em triplicado e foram repetidas pelo menos três vezes. Os valores IC50 (concentrações que produzem perda de viabilidade em 50% das células) foram calculados por regressão linear.

Estudos pré-clínicos em ratos

Para

in vivo

estudos, cisplatina (Tocris , Bristol, Reino Unido) foi reconstituída em solução de 0,9% de solução salina estéril e injectada intraperitonealmente, e olaparibe (AZD2281, Selleck Chemicals, Houston, TX) foi administrado por via oral em veículo [PBS contendo 10% de DMSO (Sigma, St. Luis, MO) e 10% (2-Hidroxipropil) -ciclodextrina (Sigma, St. Luis, MO)]. Para os estudos farmacodinâmicos ratinhos com tumores ovarianos ortotópicos estabelecidos (~ 0,5 cm de diâmetro) foram tratadas com: 1) cisplatina (5 mg /kg), n = 3; 2; 3 e 3 para a linha 29255; 32233; 39877 e 30200; respectivamente, 2) olaparibe (50 mg /kg), n = 1; 3; 2 e 3 para a linha 29255; 32233; 39877 e 30200; respectivamente 3) cisplatina (5 mg /kg) seguido por olaparibe (50 mg /kg) 1 hora mais tarde, n = 3; 2; 2 e 2 para a linha 29255; 32233; 39877 e 30200; respectivamente ou 4) do veículo, n = 2; 2; 2 e 1 para a linha 29255; 32233; 39877 e 30200; respectivamente, no dia 1. Os grupos 2 e 4 receberam outra dose de olaparibe e Grupo 4 mais uma dose de veículo, 24 horas mais tarde. Todos os animais foram sacrificados no dia 2, duas horas após a última dosagem. Os tecidos tumorais foram coletados e os níveis de PAR foram medidos usando o PARP HT

in vivo

Farmacodinâmica Ensaio II (Trevigen, Gaithersburg, MD). Os lisados ​​de tumor foram preparados de acordo com as instruções do fabricante e 2 ug de proteínas totais foram analisados.

e para a eficácia de tratamento a longo prazo estudos animais com tumores palpáveis ​​(~ 0,5 cm de diâmetro) foram analisados ​​e divididos aleatoriamente em 4 grupos de tratamento, como descrito acima, com base no volume do tumor para atingir aproximadamente o mesmo volume de distribuição em todos os grupos. A cisplatina foi administrada por via intraperitoneal uma vez por semana. Olaparibe e veículo foram administrados por via oral durante 5 dias consecutivos por semana. Animais em estudos de eficácia foram tratados durante 2 ou 3 semanas, fotografada para determinar mudanças no volume do tumor e sacrificados 2 horas após a administração olaparib /veículo. Animais em estudo a dosagem de longo prazo foram tratados por até 10 semanas e fotografada quinzenal com ultra-som (US) para determinar os volumes tumorais. Eles foram monitorados após a interrupção do tratamento para o desenvolvimento do tumor e foram sacrificados uma vez moribunda devido à carga tumoral. O tecido tumoral foi coletado para análise histológica e imunohistoquímica (IHC).

Gene expressão profiling

perfil de expressão gênica e comparação de conjuntos de dados de murino e humanos foi realizada como descrito anteriormente [26]. Os dados para análise da principal murino expressão gênica e derivados tumores SEOC ortotópicos estão disponíveis ao público em Gene Expression Omnibus banco de dados com o número de adesão GSE51927.

Dados S1 conter material e métodos para a criação de linhas de células de tumores primários de murino, implantes de células, medições de imagem e volume tumoral, recolha de tecidos, análise patológica e IHC, análise quantitativa de manchas IHC, coloração de imunofluorescência de células humanas e de murino e análise quantitativa PCR de

Brca1

status.

resultados

Transplante reter recursos biológicos e genéticos de SEOCs primários

modelos GEM SEOC foram induzidas por injecção de um vector Cre adenoviral na bursa ovário de ratos que abrigam várias combinações de alelos Cre-dependentes. Conforme descrito anteriormente [26], quando a função RB-TS foi inativado via expressão de

TgK18

T121

alelo e foi combinada com

Tp53

exclusão ou missense mutação (

p53

R172H

), cânceres evoluiu ao longo de 8-12 meses para produzir a doença metastática alto grau. Perda de

Brca1 ou

2

combinado com RB-TS inactivação não resultou na progressão da doença para além de fase I sem aberração Tp53 concomitante, e não influenciar sensivelmente a biologia da progressão da doença quando combinado com perturbação da

Rb

e

Tp53

. No entanto,

Brca1

ou

Status Brca2

claramente impactos certa resultados terapêuticos em seres humanos; portanto, era importante manter modelos com e sem tipo selvagem

Brca1 Compra de estudos pré-clínicos. Os modelos

de novo

SEOC são excelentes para compreender a etiologia da doença e para a descoberta de biomarcadores, no entanto, eles apresentam uma longa latência para doença avançada, fazendo o tempo de produção de coorte para estudos pré-clínicos desafiadoras. Além disso, devido à presença da p53

alelo R172H (um alelo nulo antes da recombinação), modelos GEM SEOC podem desenvolver tumores fora do ovário, tais como linfomas e sarcomas [26], reduzindo o tamanho da coorte previsível. Estas características tornam os modelos sub-óptimas para estudos terapêuticos pré-clínicos.

Para adaptar esses modelos para ferramentas pré-clínicos eficazes preservando as características do estroma SEOC e imunocompetência, otimizamos o transplante ortotópico de fragmentos tumorais de SEOCs derivados do GEM primárias no ovário bursa de ratinhos receptores (Fig. 1A). De 35 tumores primários, 17 tumores foram passadas com sucesso em ratinhos receptores singénicos (Tabela 1). A taxa de absorção na passagem 1 variou de 20-100% entre as diferentes linhagens tumorais com acentuadas diferenças em taxa de adesão entre

Brca1

nula (

TgK18G

T121

tg /+ /Brca1

Δ /Δ /p53

Δ /Δ) Comprar e

Brca1

tipo selvagem

(TgK18G

T121

tg /+ /p53

Δ /Δ)

tumores (95% ± 5,0 vs 64,5 ± 5,6%, p 0,01). Para ambos os genótipos, a latência do desenvolvimento de fase terminal foi substancialmente reduzido de 9,95 ± 1,29 para 2,12 ± 0,61 meses, em comparação com o modelo de novo (Tabela 1). Subsequentes

in vivo

Passaging latências ainda mais reduzido e, muitas vezes melhoradas taxas de aceitação (Tabela 1). Também observamos diferenças na latência entre tumores passadas de

TgK18G

T121

tg /+ /Brca1

Δ /Δ /p53

Δ /Δ

v

s TgK18G

T121

tg /+ /p53

Δ /Δ

genótipos na primeira (P1) (2,8 ± 0,2 meses versus 3,6 ± 0,1 meses, p 0,01) e segunda (P2) passagem (1.8 ± 0,1 meses versus 2,7 ± 0,2 meses, p 0,01). De notar, também tentou estabelecer modelos de aloenxerto ortotópicos usando células cultivadas a partir de tumores primários ou ascite. Embora essas culturas podem ser facilmente estabelecidas

in vitro Comprar e provou ser útil para avaliar a citotoxicidade de drogas (ver abaixo), a implantação ortotópica

in vivo

foi muito menos bem sucedido na eficiência estabelecendo tumores com fidelidade exigida em comparação com o transplante direto de tecidos tumorais em receptores singénicos (Data S1).

a, modelos de órgãos de SEOC foram gerados por transplante de um fragmentos de tumores ovarianos do

de novo

modelos de SEOC sob a bursas de ratinhos imunocompetentes singénicos. linhas celulares de carcinoma do ovário primários foram gerados simultaneamente. A latência para o desenvolvimento do tumor em modelos ortotópicos encurtado substancialmente em relação à latência da

de novo

modelo. B, H E de tumores primários (PT) e a passagem 1 (P1) a partir de 4 tumores correspondentes linhas de tumor diferentes, indicando SEOC histologia em PT e transplantes de tumor derivado ortotópicos. A barra de escala representa 100 fim. C, Análise de componentes principais do epitélio normal ovário superfície, tumores ovarianos primários e passagens diferentes de tumores ortotópicos derivados. D, análise de agrupamento dos dados humanos e mouse mescladas usando conjuntos de genes classificador mostraram que os tumores passadas, à semelhança do tumor primário, representado todos os 4 subgrupos de SEOC humana originalmente derivados de estudo TCGA [5].

Para determinar se mudanças significativas no fenótipo tumoral foram associados com aumento do número passagem, histopathologies tumor primário e ortotópicos foram avaliados e classificados como SEOC papilar, SEOC papilar pouco diferenciado, ou carcinoma indiferenciado (ver dados S1). Houve alta concordância na classificação de dador e ao P1 e P2 tumores, apesar de uma tendência para a perda de bem diferenciado histologia SEOC foi observada com maior número de passagem (Fig. 1B, Tabela 1). Tal como acontece com o

de novo

SEOC modelo do rato e doenças humanas, uma percentagem substancial de ratos com tumores ortotópicos desenvolvido carcinomatose abdominal (média = 32%) ou metástases distantes (média = 40%).

Para monitorar tumores passadas a nível molecular, foram comparados os perfis de transcrição de um conjunto de dados publicados anteriormente [26] composta de epitélio de superfície do ovário e primário SEOCs normais com um conjunto recém-gerado de combinar SEOC primário e derivado tumores ortotópicos. Por análise de componentes principais (PCA), amostras normais claramente separados dos tumores, enquanto que os tumores passadas agrupado com tumores primários indicando sua semelhança com as de novo SEOCs (Fig. 1C). Além disso, análise de agrupamento dos dados humanos e mouse mescladas usando conjuntos de genes classificadores mostraram que os tumores passadas, à semelhança do tumor primário, representado todos os 4 subgrupos de SEOC humana originalmente identificados no estudo TCGA [5] (Fig. 1D). Portanto, os modelos de cancro do ovário transplantáveis ​​ortotópicos recapitular a doença humana em níveis moleculares e histopatológicos.

células de carcinoma de ovário murino exibir um perfil de sensibilidade droga similar ao linhas de células humanas

Para a comparação da resposta ao tratamento de drogas em murino e células de origem humana, nós medimos a citotoxicidade após exposição a cisplatina e olaparibe em células estabelecidas de carcinoma do ovário humano e culturas de células de tumor derivadas de rato SEOCs primárias e ascite (Fig. 1A). Enquanto a linha humana UWB1.289 expressa uma proteína truncada inactiva BRCA1, o estado BRCA1 em linhas humanos 1A9 (um subclone da linha A2780), e 1A9CP80 HeyA8 é desconhecido. Para determinar se estas linhas de células humanas foram capazes de recrutamento RAD51 e, portanto homóloga de reparação mediada por recombinação, avaliou-se a formação de focos induzida por radiação de γH2AX e RAD51. Enquanto γH2AX marca locais de LAP independentes de funcionalidade BRCA1, RAD51 recrutamento para LAP é dependente de BRCA1. células 1A9CP80 HeyA8 e submetida a irradiação de 10Gy e coradas 6 horas mais tarde, mostraram profunda formação de focos RAD51 e γH2AX. Em contraste, a ausência completa de focos RAD51 foi visto em células 1A9 e UWB1.289 (Fig S1.), Indicando a falta de funcionalidade de BRCA1

Como relatado anteriormente [27] -. [29] e UWB1.289 1A9 eram mais sensíveis ao tratamento com cisplatina, ao passo que os valores de IC50 de linhas 1A9CP80 e HeyA8 foram geralmente 2-2,5 vezes maior do que os seus homólogos sensíveis (Fig. 2a). olaparibe tratamento produziu o maior citotoxicidade em células 1A9, enquanto 1A9CP80, HeyA8 e UWB1.289 foram semelhantes e cerca de 2 vezes menos sensíveis (Fig. 2B).

Humano (A, B) e de murino (C- ), as células de cancro do ovário H foram expostas a cisplatina, olaparibe ou veículo durante 7 dias, após o que a viabilidade celular foi medida utilizando o reagente XTT. viabilidade proporcional foi calculada comparando as drogas com os controlos de veículo cuja viabilidade foi assumida como sendo 100%. C. Painel de linhas de células de murino foi selecionada com base em

Brca1

estatuto contendo

Brca1

-deficient (barra listrada) e as linhas de tipo -wild (barras cheias) manter semelhante

Brca1

expressão como os seus tumores de origem (D). Os valores de CI50 para as linhas celulares de cancro individuais são mostradas nas legendas (A, B, E, G, parêntesis atrás da designação linha celular). Comparação do IC50 para a cisplatina (F) e olaparib (H) no tipo selvagem (

TgK18G

T121

tg /+ /p53

Δ /Δ

; R5810T, R5838T) e mutante (

TgK18G

T121

tg /+ /Brca1

Δ /Δ /p53

Δ /Δ

; 39647T, 60577T, 60580T, 82394T) linhas de células de murino mostra diferença significativa entre os genótipos (t-teste, 333,7 ± 54,1 vs 146,0 ± 8,2, p 0,01 e 18,2 ± 1,4 vs 10,4 ± 1,2, p 0,05, respectivamente, para as drogas). O erro médio e padrão é mostrado.

Para ensaios de citotoxicidade comparativos, rato primários SEOC linhas celulares, que abrigam tanto do tipo selvagem

Brca1

ou o mutante de deleção, foram cultivadas. Como relatado anteriormente [31],

BRCA1

células -deficient crescem mal na cultura. Assim, porque a recombinação mediada por Cre in vivo não é 100%, existe uma forte

In vitro

selecção de células com capacidade insuficiente

Brca1

deleção em linhas celulares derivadas de predominantemente

Brca1

tumores deficientes em [31]. De 32 linhas de células selecionados, quatro linhas celulares que mantiveram o menor

Brca1

níveis de expressão (abaixo de 20%) em relação ao

Brca1

linhas de tipo selvagem foram escolhidos para representar

Brca1

-deficiência (Fig. 2C). Estes níveis de

Brca1

eram comparáveis ​​aos seus tumores parentais (Fig. 2 D).

deficiência Brca1

também foi confirmada por ensaio funcional, onde células irradiadas foram incapazes de recrutar RAD51 aos locais de LAP (Fig. S2).

Brca1

linhas celulares -deficient (39647, 60580, 60577 e 82394; todo

TgK18G

T121

tg /+ /p53

Δ /Δ /Brca1

Δ /Δ

genótipo) foram aproximadamente 2 vezes mais sensíveis a cisplatina que

Brca1

linhas tipo -wild (R5810 e R5838, ambos

TgK18G

T121

tg /+ /p53

Δ /Δ

genótipo; A Fig. 2E-F). Do mesmo modo, o tratamento com olaparibe mostrou uma maior potência in

Brca1

-deficient que

Brca1

linhas de células de tipo -wild (Fig. 2 L-H). Nossos resultados indicam que estas linhas celulares replicar sensibilidades relativas de tumores humanos em que

BRCA

mutações são encontradas mais frequentemente em platina-sensíveis do que a doença resistente à platina [32], [33].

Ortotópico modelos de transplante recapitular

BRCA

diferenças relacionados com em resposta ao tratamento observadas em pacientes

O ideal para o uso eficaz de qualquer modelo pré-clínico no desenvolvimento de terapêuticas humanas e biomarcadores associados ao tratamento, a previsibilidade das respostas humanas conhecidas deve ser estabelecida. Para este fim, avaliou as respostas na

Brca1

modelos tipo SEOC -deficient e -wild a cisplatina e olaparib. Em primeiro lugar, para determinar um esquema de dosagem óptima, examinámos a cinética de crescimento do tumor através de imagens seriadas de ressonância magnética (MR) (Fig. S3). Os animais receptores desenvolveram pequenos tumores ovarianos de 70 a 80 mm

3 (~ 0,5 cm de diâmetro) de 21 a 28 dias após a implantação (p. i.) seguido de crescimento tumoral rápido. Os animais se tornou moribunda devido a grandes tumores ovarianos e ascite por 40 a 60 dias após a inoculação Para os estudos de eficácia, o tratamento foi iniciado quando um pequeno ( 80 mm

3). Massa do tumor tinha desenvolvido a fim de imitar pacientes com carga tumoral residual após a cirurgia de-bulking (. Desenho do estudo descrito na Figura 3A)

a, esquemas de regime de dosagem e de imagem em estudos de eficácia. B, A inibição da formação de PAR em lisados ​​de tumor tratado com olaparibe para 2 (C). O erro médio e padrão é mostrado. D, imagens representativas MR antes e depois de 2 semanas de tratamento com veículo, olaparibe, cisplatina ou a combinação de cisplatina e olaparibe são mostrados. barra de escala representa 1 cm. setas brancas apontam para os tumores, setas verdes apontam para ovários contralateral. RM quantificação baseado das alterações do volume de tumor expressas como RTV seguinte duas semanas (E) e o regime de tratamento 3 semanas (F). As diferenças estatísticas entre os grupos foram analisados ​​por ANOVA one-way e teste de comparações múltiplas de Tukey. Cada ponto representa um animal. V; veículo, O; olaparib, C; cisplatina, O + C; olaparib e cisplatina.

Para determinar a actividade in vivo e modulação alvo por olaparib no modelo ortotópico, nós analisadas para níveis de PAR em tumores tratados. lisados ​​tumorais de todos os animais que receberam tratamento olaparib havia reduzido muito os níveis de PAR após a curto prazo (28 horas; p 0,01 para a linha 32233, p 0,001 para a linha 30200) e longo prazo (2 semanas; p 0,01 para a linha 29255 e 30200, p 0,0001 para a linha 39877) a dosagem em comparação com os ratinhos tratados com veículo ou cisplatina (Fig 3B e C), indicando que a exposição do tumor a olaparibe foi suficiente para a inibição de PARP.. Como esperado, não houve diferença nos níveis de PAR entre

Brca1

-deficient e selvagens tumores do tipo, de acordo com a formação PAR ocorrendo a montante do BRCA1, independente do estado do mecanismo de reparo HR.

Foram avaliadas a eficácia de olaparib, cisplatina e sua combinação no

Brca1

modelos -deficient após duas semanas de tratamento (Fig. 3D, e), medindo volumes relativos dos tumores (RTV), as alterações de volume do tumor a partir da linha de base (pré-dose) para o ponto final tal como determinado por ressonância magnética. Cada ponto no gráfico representa um ratinho individual. Todos os 13 animais tratados com o veículo de 2 modelos de tumores independentes mostraram um crescimento tumoral rápido dentro de 2 semanas, com 3 animais a serem sacrificados antes do dia 14, devido à deterioração da saúde associados com o crescimento do tumor (Fig. 3D, E). O tratamento com olaparib resultou em redução modesta do crescimento do tumor no

modelo de tumor Brca1

-deficient 30200 e na redução significativa no modelo 39877 (p 0,01). No entanto, em ambos os casos, a redução na RTV era mais profunda quando tratados com cisplatina (p 0,001), e a combinação de cisplatina e olaparibe comparação com olaparibe sozinho (p 0,01) (Fig. 3D, E)

para investigar se a resposta ao tratamento foi dependente

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status, foi realizado um estudo de tratamento de 3 semanas no

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modelo -deficient 30200 e

Brca1 viajantes – tipo selvagem modelo 29255. Seis dos 9 ratinhos tratados com excipiente a partir de ambas as linhas ficaram moribundos antes do dia 21. a cisplatina mono- ou terapia de combinação foi igualmente eficaz nos pontos de tempo de 3 e 2 semanas. No entanto, o tratamento prolongado de

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tumores -deficient com olaparibe resultou numa maior redução de tumor em comparação com tumores tratados com veículo (2,037 ± 0,282 5,598 ± RTV vs 2,296 RTV, p 0,01) em 3, em comparação a um tratamento de 2 semanas (3,008 ± 0,509 3,710 ± 1,325 vs RTV, NS), sugerindo que um limiar de danos no DNA é necessária para a potência ideal. Em contraste, o

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modelo tipo de tumor -wild não responder a olaparib apesar da inibição PARP em tumores, indicando a importância da reparação HR danificado a eficácia olaparib (Fig. 3B, F). terapia com cisplatina foi igualmente ineficaz em

Brca1-

tipo tumores selvagens (Fig. 3F).

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respostas específicas de genótipo para drogas de platina, bem como olaparib também foram documentadas em pacientes [34] – [37], portanto, o modelo ortotópico é uma ferramenta útil para examinar essas respostas diferenciadas e prever resultados potenciais.

alterações histopatológicas resultantes olaparibe e tratamento com cisplatina reflectir diferenças observadas nos volumes tumorais

para avaliar o efeito do tratamento com droga, ao nível celular, H e-secções de tumor coradas foram analisadas por alterações histológicas (Fig. 4AA-l). Em ambos

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-deficient modelos, o tratamento com olaparibe resultou em SEOC menos diferenciadas com tamanho aumentado nuclear e pleomorfismo em comparação com a bem a moderadamente diferenciadas estruturas papilares dos tumores ovarianos em ratinhos tratados com veículo (Fig. 4A uma , b). Em contraste, a cisplatina monoterapia teve um efeito mais profundo sobre a histologia do tumor (Fig. 4AC), produzindo SEOC papilar fracamente diferenciado ou carcinoma indiferenciado com um aumento no estroma do tumor, focos necróticos, e células apoptóticas com um elevado grau de pleiomorphism nuclear e a presença de células gigantes multinucleadas de tumor atípicos. O tratamento do

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modelos -deficient com a combinação de cisplatina e olaparibe resultou em histologia muito semelhante ao da cisplatina sozinha tumores tratados (Fig. 4AD). Em contraste, foram observados efeitos mínimos de tratamento de drogas no

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modelo de tumor tipo -wild indicando uma concordância geral de alterações histopatológicas e volume tumoral após o tratamento de drogas (Fig. S4).

A, um exemplo de histologia e IHC da

TgK18G

T121

tg /+ /Brca1

Δ /Δ /p53

Δ /Δ

tumores tratados com cisplatina e /ou olaparib (a -eu). A linha de tumor 39877 era sensível ao tratamento com droga, o que resultou na diminuição da proliferação (Ki67) (A e-h) e aumento do dano do DNA (γ-H2AX) (I-l).