Abstract

caquexia Câncer é uma condição debilitante, impulsionado pela inflamação sistêmica e estresse oxidativo. Este estudo investigou o ácido eicosapentaenóico (EPA) em combinação com oxipurinol como tratamento num modelo de ratinho de caquexia do cancro. Os ratos com câncer caquexia foram randomizados em 4 grupos de tratamento (EPA (0,4 g /kg /dia), oxipurinol (1 mmol /L Ad-Lib), combinação, ou controle), e sacrificados após 29 dias. Análise do dano oxidativo ao DNA, análise de mRNA de pró-oxidante, antioxidante e componentes da via proteolíticas, juntamente com atividade enzimática de pró e antioxidantes foram concluídas no músculo gastrocnêmio. O grupo de controlo apresentado anteriormente aparecimento de tumores em comparação com EPA e grupos oxipurinol (P 0,001). O grupo EPA mantida peso do corpo por um período prolongado (20 dias), em comparação com o oxipurinol (5 dias) e os grupos (P 0,05) combinação (8 dias). EPA (18,2 ± /ml 3,2 pg) e combinação (18,4 ± 3,7 pg /ml) grupos tinham significativamente mais elevados níveis de 8-OH-dG que o grupo controle (12,9 ± 1,4 pg /ml, P ≤ 0,05), indicando aumento do dano oxidativo ao ADN. níveis de mRNA de GPx1, MuRF1 e MAFbx estavam seguindo maior tratamento EPA relação ao controle (P ≤ 0,05). Considerando oxipurinol foi associado com maior GPx1, MnSOD, CAT, XDH, MuRF1, MAFbx e mRNA UBB em relação ao controle (P ≤ 0,05). Actividade de SOD total foi maior no grupo oxipurinol (32,2 ± 1,5 U /ml) em comparação com o controlo (27,0 ± 1,3 U /ml, P 0,01), a actividade da GPx foi menor no grupo EPA (8,76 ± 2,0 U /ml) em comparação com o controlo (14,0 ± 1,9 U /ml, P 0,05), e a actividade de catalase foi menor no grupo de combinação (14,4 ± 2,8 U /ml) em comparação com o controlo (20,9 ± 2,0 U /ml, P 0,01). Não houve alteração na actividade de XO. O aumento da taxa de declínio de peso em murganhos tratados com oxipurinol indica que XO pode jogar um papel protector durante a progressão da caquexia do cancro, e a sua inibição é prejudicial para os resultados. Em combinação com EPA, houve pouca melhora significativa do controle, indicando oxipurinol é improvável que seja um composto tratamento viável na caquexia associada ao câncer

Citation:. Vaughan VC, Sullivan-Gunn M, Hinch E, Martin P, Lewandowski PA (2012) ácido eicosapentaenóico e Oxipurinol no tratamento da perda de massa muscular em um mouse modelo de cancro da caquexia. PLoS ONE 7 (9): e45900. doi: 10.1371 /journal.pone.0045900

editor: Atsushi Asakura, da Universidade de Minnesota Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de maio de 2012; Aceito: 27 de agosto de 2012; Publicação: 20 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Vaughan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. VV é o destinatário do Victorian Cancer Agency Paliativos e Scholarship Cuidados de suporte através da Agência Cancer Victorian financiado pelo Governo do Estado de Victoria, na Austrália, e a Bolsa de Apoio Bellberry através Bellberry Ltd. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Muitas formas de câncer apresentam um complexo. perfil metabólico caracteriza-se por perda de tecido de massa corporal magra e tecido adiposo, conhecido como caquexia do cancro. Aproximadamente metade de todos os pacientes com cancro desenvolver caquexia [1], com a crescente prevalência tão alta quanto 86% nos últimos 1-2 semanas de vida [2], e 20% das mortes por cancro atribuíveis a caquexia [3]. Pacientes que sofrem de caquexia pode perder até 30% do seu peso corporal original, com 45% dos pacientes a perderem mais de 10% do seu peso original sobre a progressão da doença [4].

O estresse oxidativo pode desempenhar um papel integral no caquexia associada ao câncer, com evidência de dano oxidativo e altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) encontrados em muitos estados de cancro [5]. O papel das ROS no desenvolvimento da caquexia associada ao câncer, e os mecanismos que causam a doença permanecem largamente desconhecidos, apesar de vários avanços na identificação de fatores circulatórios e caminhos que estão ativos. Uma mudança no equilíbrio entre oxidantes reactivos e antioxidantes podem induzir um estado de estresse oxidativo, que é prejudicial para a célula, e pode ser um dos factores-chave para o desenvolvimento da caquexia.

superóxido dismutase (SOD) é uma enzima responsável pela dismutação do ânion superóxido (o

2

– ·) em peróxido de hidrogênio e oxigênio. A actividade da SOD tem sido mostrado para ser diminuída no estado caquético [6], [7], indicando que existe uma incapacidade para compensar aumentos de ROS, e, por conseguinte, uma incapacidade para proteger a célula do stress oxidativo no estado caquético . As enzimas antioxidantes catalase e glutationa peroxidase (GPx) que decompõem o peróxido de hidrogénio para o oxigénio e a água também foram encontrados a ter uma menor actividade nos estudos de caquexia do cancro [8], indicando que os sistemas podem ser os principais contribuintes para o stress oxidativo e danos observados nas caquexia do cancro.

Embora alguns dos processos envolvidos na produção excessiva de ROS têm sido estudadas em profundidade na caquexia do cancro, existem outras que foram mostrados para desempenhar um papel na insulto oxidativo em outras doenças, que têm ainda a ser estudado em detalhe na caquexia do cancro. xantina oxidoredutase é uma enzima com duas formas distintas que são responsáveis ​​por catalisar a conversão da hipoxantina em xantina, e xantina em ácido úrico [9]. Xantina desidrogenase (XDH) é expresso

in vivo

, e utiliza NAD + como um receptor de elétrons para a reação de redução, formando NADH. Na presença de mediadores pró-inflamatórios, XDH prontamente cliva em xantina oxidase (XO), que em vez disso usa o oxigénio molecular para a conversão da hipoxantina em xantina, e a xantina em ácido úrico, produzindo o ó altamente reactivo

2

– ·, ou peróxido de hidrogénio [9]

dados apresentados como média ± SEM

enquanto XO não é normalmente presentes em níveis elevados no músculo esquelético, níveis elevados são comumente vistos.. danos no tecido muscular e a lesão de isquemia-reperfusão [10]. Altos níveis de XO também foram observados no sangue de alguns doentes com cancro, em comparação com os pacientes sem cancro [11], e é sido sugerido que os animais caquéticos, respondem favoravelmente ao tratamento com inibidores da XO [12]. A abundância de factores pró-inflamatórias presentes na caquexia pode levar a um aumento da clivagem de XDH para a forma XO, explicando os níveis circulantes mais elevados de XO. Aumento dos níveis de XO, então, levar ao excesso de produção de ROS, e contribuir para o estresse oxidativo em caquexia associada ao câncer.

Dados apresentados como média ± SEM.

Oxipurinol é um não-competitivo, inibidor irreversível da XO, considerada mais potente do que o alopurinol, da qual é um metabolito [10]. Actualmente oxipurinol é utilizada como um tratamento para condições em que XO representa um contribuinte, e tem sido demonstrado para diminuir o desperdício de tecido e aumentar a função cardíaca em animais de caquexia [12], [13]. A diminuição na produção de purina e os requisitos do metabolismo associadas podem levar a redução de expressão XDH e atividade, portanto, a jusante desta enzima. ácido úrico, produzido pela XO, aumenta a conversão do ácido araquidónico em seus metabolitos biologicamente activos [14]. Isto por sua vez aumenta a activação da NADPH-oxidase, perpetuando a cascata de sinalização que resulta na activação da transcrição aumentada dos componentes do sistema ubiquitina-proteassoma.

Dados apresentados como média ± SEM.

a significativamente diferente em relação ao controle,

b significativamente diferente em comparação com EPA,

c significativamente diferente em comparação com oxipurinol (P 0,05).

O catabolismo progressiva do músculo, em caquexia do cancro sugere um papel fundamental em sistemas de degradação de proteínas, tais como a via proteolítica da ubiquitina (UPP). A UPP foi encontrado para ser regulada para cima, tanto em modelos experimentais e em pacientes com caquexia [15], [16], indicando contribuição para a perda muscular e resultados negativos associados. Antes de proteínas são degradados pela UPP, eles devem ser orientados por conjugado com múltiplas moléculas de ubiquitina. A fim de que esta conjugação a ocorrer, ubiquitina deve primeiro ser activados por uma enzima activadora de ubiquitina (E1), e, em seguida, transferido para o sítio activo de uma proteína transportadora da ubiquitina (E2). O E2 ligado reconhece ubiquitina conjugar enzimas (E3 E3 ligase ou proteínas), que permitem que as reacções de conjugação a ter lugar, que formam uma cadeia de ubiquitinas ligados uns aos outros e o substrato de proteína. Apenas quando a ubiquitina é apontado para uma proteína seleccionada que pode, então, ser reconhecido pelo proteassoma, e processado em péptidos mais pequenos [17]. Várias proteína-ligases E3 foram mostrados para ser activa durante a proteólise em atrofia muscular, em particular, específicas do músculo F-box (MAFbx) /atrogina-1 e o anel específico do músculo dedo 1 (MURF-1) [18].

dados apresentados como média ± SEM.

a significativamente diferente em relação ao controle,

b significativamente diferente em comparação com EPA,

c significativamente diferente em comparação com oxipurinol (P 0,05).

ácido eicosapentaenóico (EPA) é um ácido que ocorre naturalmente graxo ômega-3, encontrado em peixes oleosos e certas algas, amplamente considerado como tendo grande potencial como antigenotóxico, antioxidante e agente quimiopreventivo. Administração de EPA tem sido demonstrado que o aumento da actividade da SOD varrimento ROS [19], retardar o desenvolvimento de alguns cancros, e aumentar o ganho de peso e a qualidade de vida em pacientes com cancro pancreático [20]. Nos últimos anos, a EPA foi testado como um tratamento para a caquexia do cancro devido aos seus vários papéis como um agonista de SOD e na regulação da expressão a montante e a actividade da UPP [20] – [22]. EPA substitui o ácido araquidónico em membranas de fosfolípidos quando consumida em níveis elevados [23], e também tem mostrado inibir a produção de 15-HETE a partir de ácido araquidónico, que tem sido implicado na regulação UPP em modelos murinos de caquexia [24], [25] . Alguns ensaios animais de EPA têm sido bem sucedidas, como tem a sua combinação com outras abordagens terapêuticas em pacientes humanos, tais como a suplementação de leucina, dieta rica em proteínas e exercício [26], [27].

O actual estudo teve como objetivo determinar se a inibição da xantina oxidase por oxipurinol teve um efeito benéfico no tratamento de perda de massa muscular em caquexia associada ao câncer. Além disso, os investigadores procuraram determinar se EPA em combinação com oxipurinol era um tratamento multimodal eficaz para a perda de massa muscular em caquexia associada ao câncer. Postula-se que o efeito inibitório de oxipurinol em XO combinado com o efeito agonista de EPA em SOD iria reduzir a presença de excesso de S

2

– · no músculo caquéticos, levando a uma redução na insulto oxidativo e lesão resultante ou desperdiçar quando comparados com os controles caquéticos.

dados apresentados como média ± SEM.

a significativamente diferente em relação ao controle,

b significativamente diferente em comparação com EPA,

c significativamente diferente em comparação com oxipurinol (P 0,05).

Resultados

Modelo animal

Quatro animais do grupo controle e cada um dos oxipurinol e combinação grupos de tratamento foram abatidos antes da conclusão do julgamento devido a preocupações éticas, e não foram incluídos na análise estatística.

Ratos no grupo controle apresentou aparecimento do tumor a partir de 6 ± 0,3 dias (Figura 1), enquanto a idade e peso combinado EPA (10 ± 0,7 dias) e oxipurinol (9 ± 0,6 dias) grupos de tratamento tiveram uma significativa atraso no aparecimento do tumor por comparação (P 0,001). O grupo EPA também tinham significativamente retardada início em relação ao grupo da combinação (7 ± 0,7 dias, P 0,001). O tratamento do tumor oxipurinol início atrasado em comparação com a combinação (P 0,01) do grupo. Não houve diferença estatística no tamanho do tumor final entre EPA (338 ± 67 milímetros

3) e controle (308 ± 28 milímetros

3) grupos, enquanto Oxipurinol (489 ± 78 milímetros

3) e combinação (515 ± 41 milímetros

3) grupos de tratamento mostraram aumento do tamanho final do tumor em comparação com o controlo (p 0,01) grupos e EPA (P 0,05).

perda de peso foi calculado como uma porcentagem de peso inicial, corrigida para a massa tumoral (Figura 2). O grupo de controlo experimentaram perda de peso significativa em relação ao peso inicial a partir do dia 12 em diante (P 0,05). O grupo EPA aumento no peso corporal durante a fase de pré-caquéticos, antes da estabilização de peso, e manteve esse estado pré-caquéticos até o dia 22, quando os pesos começou a declinar, com a perda de peso significativa a partir do dia 25. O grupo oxipurinol experimentou declínio gradual de peso de pico a partir do dia 3, antes de uma acentuada diminuição de peso no dia 13. a perda de peso foi significativo neste grupo a partir do dia 14 e diminuiu gradualmente até ao endpoint. O grupo combinação recuperado de uma forte queda no peso corporal no dia 4, aumentando significativamente no peso corporal da inicial, e foram estáveis ​​antes de experimentar a perda de peso significativa a partir do dia 17 (excluindo o dia 19; P 0,01). O grupo controle apresentou variação de peso médio de -9,06% a eutanásia, o grupo EPA -4,91%, oxipurinol -9,11% eo grupo combinação -5,03%, não houve diferenças significativas no peso-perda percentual entre os grupos no eutanásia. O grupo de tratamento EPA exibido perda de peso-significativamente menor do que no grupo controle (P 0,05) por um período prolongado (Dias 3-15, 17-23, o total de 20 dias) em comparação com tanto o oxipurinol (dias 3, 4, 7, 8, 10, o total de 5 dias) e combinação (dias 6-12, 19, o total de 8 dias) os grupos de tratamento. Enquanto houve uma correlação muito forte entre o tamanho do tumor e perda de peso no grupo controle (r

2 = 0,94), menor variação foi explicada pela correlação entre a perda de peso e tamanho do tumor na EPA (r

2 = 0,72), oxipurinol (r

2 = 0,72), e uma combinação de (r

2 = 0,70) grupos de tratamento.

no grupo de tratamento EPA, quadríceps, sóleo, TA e gastrocnêmio músculos constituiu um significativamente maior percentagem de peso corporal total do que o grupo controle no ponto final (P ≤ 0,05; Figura 3). No grupo de tratamento oxipurinol, TA e gastrocnémio foram também uma percentagem significativamente mais elevada do peso corporal total em comparação com o grupo de controlo no ponto final (p≤0,05). Pesos de sóleo, TA e gastrocnêmio também foram maiores do que o grupo controle nos animais submetidos ao tratamento combinado (P ≤ 0,05). peso Quadricep aumentou no grupo de tratamento EPA em relação a ambos os Oxipurinol e combinação tratamentos, no entanto TA e plantarus foram também diminuiu em relação a grupos Oxipurinol e combinação, respectivamente.

Estresse Oxidativo

8-OH- níveis da dG no músculo gastrocnêmio do grupo controle foi de 12,9 ± 1,4 pg /ml. EPA (18,2 ± 3,2 pg /ml) e combinação (18,4 ± 3,7 pg /ml) grupos tinham níveis significativamente mais elevados do que o grupo controle (P ≤ 0,05; Figura 4), indicando aumento do estresse oxidativo nestes grupos. O grupo oxipurinol não apresentam significativamente mais elevados níveis de 8-OH-DG relação ao controle (14,9 ± 1,5 pg /ml, P≤0.07).

Gene Expression

A expressão gênica no músculo gastrocnêmio é mostrada na Tabela 1. a GPx1 componente antioxidante aumentou 3,1 vezes no grupo de EPA e 4,1 vezes no grupo oxipurinol em comparação com o controlo (P 0,01), assim como a expressão da ubiquitina MuRF1 E3-ligases e MAFbx, 2,5 vezes no grupo EPA, e 2,8 vezes e 3,6 vezes no grupo oxipurinol, respectivamente (P 0,05). Oxipurinol também o aumento da expressão de componentes antioxidante MnSOD em 1,9 vezes (P 0,05) e CAT em 2,4 vezes (P 0,01) comparado com o controlo, enquanto XDH aumentou 2,7 vezes (P 0,01) e um aumento de 1,3 vezes na foi observada; proteassoma subunidade UBB (0,05 P 0,05).

Enzyme Assays

Atividade de SOD total aumentou significativamente no grupo oxipurinol (32,2 ± 1,5 U /ml; Figura 5) em comparação com o controlo (27,0 ± 1,3 U /ml, P 0,01), a combinação de (25,0 ± 3,4 U /ml, P 0,01) e os grupos de EPA (28,3 ± 1,5 U /ml, P 0,05). Não houve alteração entre outros grupos. Actividade da GPx foi significativamente reduzida no grupo EPA (8,76 ± 2,0 U /ml) em comparação com ambos o controlo (14,0 ± 1,9 U /ml, P 0,05) e grupos de combinação (13,6 ± 2,0 U /ml, P 0,05) . A actividade da catalase foi reduzida no grupo combinado (14,4 ± 2,8 U /ml) em comparação com ambos o controlo (20,9 ± 2,0 U /ml, P 0,01) e grupos oxipurinol (24,3 ± 4,7 U /ml, P 0,05). Não houve outras alterações significativas entre os grupos. Não houve diferença significativa na atividade XO entre os grupos.

Discussão

EPA tem sido geralmente aceite que têm o potencial para ajudar no tratamento da caquexia associada ao câncer, em particular como parte de uma abordagem combinada para terapia de [26], [27], no entanto maior elucidação dos mecanismos exactos é necessária. No presente estudo, os animais tratados com EPA tinha retardou significativamente o desenvolvimento de tumores, e, por conseguinte, os resultados, que pode ter sido devido à acção anti-tumoral previamente descrita de EPA [28], em vez de acção anti-caquética sozinho melhorada. No entanto, enquanto que inibiu o crescimento tumoral pode explicar parcialmente a atenuação da perda de peso, a investigação anterior indica que o efeito anti-caquécticos de EPA é maior do que seria de esperar tendo em conta a magnitude da redução tumoral [29], e parece suscitar uma resposta distinta da efeito anti-tumoral [30], suportando a ideia de que o aumento da variação observada no grupo EPA neste estudo pode ser devida a outros que inibiu o crescimento tumoral factores. Estudos futuros se beneficiariam com os animais sendo abatidos na perda de peso ou tamanho do tumor limites, ao invés de datas arbitrárias, a fim de estabelecer se os animais tratados com experiência EPA de perda de peso semelhante aos animais não tratados com o tamanho do tumor semelhante e em massa, apesar de início tardio .

de cadeia longa n-3 PUFA, tais como EPA, são conhecidos por ser comprometida pelo stress oxidativo, formando hydroperoxidases lipídicos e radicais peroxilo de ácidos gordos que por sua vez podem danificar as membranas lipídicas [31]. A incorporação de EPA em membranas lipídicas de células em animais submetidos a suplementação [23] pode aumentar a susceptibilidade destas membranas a danos oxidativos, incluindo células e membranas nucleares, e expondo ainda mais o conteúdo de células, incluindo ADN, para o estado oxidativo aumentado, e pode explicar o aumento do dano oxidativo ao DNA indicado pelos níveis de 8-OH-dG no grupo EPA. 8-OH-dG é a forma predominante de lesão oxidativa induzida por radicais livres, e é vulgarmente utilizado como biomarcador para o stress oxidativo [32]. 8-OH-dG é produzido durante o dano oxidativo ao DNA, causado pela interacção entre os radicais hidroxilo bases de nucleótidos e de cadeias de ADN, e é considerado um marcador bem caracterizado e sensível de tal dano [32].

EPA tratamento causou uma diminuição na actividade da GPx em comparação com o grupo de controlo no ponto final. Esta diminuição da capacidade antioxidante também pode ser indicativo de uma exigência diminuiu para a ação antioxidante, devido a qualquer presença ROS reduzido ou aumentado de eliminação de ROS por outras enzimas. Também não houve mudança na SOD ou atividade catalase. Em conjunto, isto indica que a acção da EPA não é como um agonista da actividade antioxidante como hipótese, e que, ao ponto final, o potencial para uma maior acção antioxidante indicado pelo aumento da expressão do gene GPx1 está a ser humedecido neste grupo. Assim, apesar das alterações na expressão de genes que, na ausência de doença podem ter causado um aumento da actividade de enzimas antioxidantes, como da GPx, a presença de caquexia do cancro impedidos tais alterações funcionais ocorra. Ao completar o estudo, o grupo EPA tinha começado a diminuir em peso, e é, portanto, possível que um efeito anterior do APE, em função antioxidante causou o atraso no aparecimento de perda de peso; no entanto mais estudos tempo-curso são necessários para confirmar esta hipótese. A diminuição do peso corporal no grupo de EPA no fim do estudo era indicativo de caquexia do cancro estar presente.

Um estudo anterior indicou que a inibição da XO por tratamento oxipurinol reduzida perda de peso corporal total e corporal magra massa e reduziu a produção de ROS em relação aos controles [12]. No entanto, o estudo sugere que o tratamento oxipurinol pode causar efeitos adversos no modelo de roedores, em particular o rápido declínio do desempenho indicado em peso-perda observada no início da doença. A regulação dos componentes do UPP também sugere um deslocamento para a perda muscular nesse grupo. Com efeito, oxipurinol, em vez de diminuir a actividade da XO, não causou alteração global quando comparados com o grupo de controlo. Quando visto no contexto da expressão do gene aumentado de XDH, isso indica que pode haver um efeito inibidor, que está a ser compensada por um aumento da produção de XOR. O grupo de tratamento oxipurinol também exibiu uma tendência para o aumento do dano oxidativo em comparação com o controlo ( 0,07), indicando que pode haver um aumento da abundância de ROS. Maior atividade da SOD neste grupo em relação ao controle mostra aumento de eliminação de ROS, provavelmente em resposta a este aumento de dano oxidativo. Estas diferenças na resposta pode ser devida a uma baixa biodisponibilidade do oxipurinol no modo de administração utilizado neste estudo [13], e alternativa, preparações de potência mais elevada ou modos de administração deve ser considerado em estudos futuros. Os estudos futuros para o papel de XOR e metabolismo da purina na caquexia pode também beneficiar de inibição desta via, num ponto a montante do XOR. No entanto, devido às diferenças entre roedores e primatas metabolismo das purinas, é importante que esta via ser investigado plenamente em um modelo que permite paralelos clínicos a ser desenhado.

Durante a progressão estudo, o grupo de combinação exibida perda de peso características de fase similares tanto para a EPA e grupos oxipurinol. Por exemplo, o aumento de peso inicial de estabilização e reflecte o grupo EPA, o declínio acentuado aos 12 dias de espelhos que o grupo oxipurinol aos 14 dias. A quantidade de peso perdido pelo grupo de combinação é, na sua maior parte, não tão extremo como o grupo oxipurinol, mas o peso não é tão bem preservado como o grupo EPA. Estes padrões de perda de peso também são distintos dos do grupo de controlo, indicando que é a combinação dos dois grupos, em vez de uma ausência de efeito, fazendo com que este padrão de declínio. Uma interacção entre os dois tratamentos é ainda apoiado pelos dados de expressão de genes e a actividade de enzima, em que o efeito no grupo de combinação é significativamente diferente do efeito de qualquer dos tratamentos por si só.

Dadas as mudanças significativas em muitos parâmetros do experimentado na o grupo de terapia de combinação em comparação com cada um dos componentes isoladamente, é possível que as vias alterados pela EPA e oxipurinol são ligados. Embora a EPA tem sido mostrado previamente para suprimir a inflamação induzida por cristais de urato em ratos Sprague-Dawley machos [33], esta não foi previamente mostrado num modelo de caquexia. Mais pesquisas são necessárias, mas o cruzamento destas duas vias em ácido araquidônico é o ponto mais provável de interação [14], [23], [24]. A inibição combinada da UPP pela EPA e oxipurinol é suportada pela redução na expressão do gene de Ubb, MuRF1, e MAFbx neste estudo (ver Tabela 1). acção inibido da via a montante da NADPH-oxidase pela EPA e oxipurinol é ainda suportada pela tendência para uma diminuição na expressão de NOX2 no grupo de tratamento de combinação em comparação com o controlo (P 0,06), e a diminuição da expressão de NOX2 no grupo de combinação em comparação com o grupo EPA indica que o efeito do composto da terapia de combinação é aumentando a inibição desta via, provavelmente através do mecanismo anteriormente proposto. Uma diminuição da produção de purina e exigências metabólicas associadas, desencadeada por retro-inibição da transferase amidophosphoribosyl [13], pode levar à redução da expressão de XDH observada no grupo de combinação. As mudanças significativas observadas no grupo de combinação também pode ser causado pelo aumento da absorção de oxipurinol devido à permeabilidade alterada das membranas celulares provocadas pela suplementação de EPA, e pode ser a causa da interacção aparente. Altered fluidez e a composição de fosfolípidos das membranas celulares foi observado após a n-3 PUFA suplementação [34], como modificar a absorção de fármacos hidrofóbicos. Dada a solubilidade relativamente elevada lipídico de oxipurinol [13], esta alteração permitiria a droga para passar facilmente através de difusão passiva.

Conclusão

EPA continua a mostrar a promessa como parte de um multi-modal tratamento para a caquexia, com uma mudança positiva em relação à manutenção da massa muscular magra, e atraso no início da perda de peso em animais submetidos a tratamento EPA em comparação com aqueles que receberam outros tratamentos. Mecanismos de proteção não eram mais ativos ao ponto final estudado, portanto, estudos de tempo do curso são necessários para determinar os responsáveis ​​pelos efeitos protetores observados. Oxipurinol parece causar um aumento na taxa de declínio de peso em ratinhos com caquexia cancerosa em comparação com todos os outros grupos de tratamento. Isto indica que XO pode jogar um papel protector durante a progressão da caquexia do cancro, e a sua inibição é prejudicial para os resultados. No entanto, a conservação da massa em certos músculos que implica oxipurinol pode ser benéfico na manutenção da massa muscular. Os efeitos aumentados no grupo de combinação em comparação com o EPA ou tratamentos oxipurinol sugerem uma intersecção de duas vias mecanísticas, ou em que há um aumento da absorção de oxipurinol na presença de suplementação de EPA, fazendo com que a interacção aparente. Novos estudos são necessários para elucidar completamente o efeito interativo de oxipurinol e EPA, eo papel do XO em caquexia associada ao câncer.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

O adenocarcinoma murino 16 a linha celular (MAC16) foi cultivada em meio RPMI com 10% de FBS e 0,5% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Mulgrave, Austrália). As células foram cultivadas até à confluência de 80%, centrifugou-se a 500

g

durante 5 minutos a 4 ° C, e isolado a partir do meio de crescimento. As células foram então ressuspensas em PBS estéril e arrastado para uma agulha de calibre 25 para injecção.

Modelo Animal

Todos os experimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Bem-estar do animal, em Universidade Deakin (número de aprovação A13 /2010). Feminino Balb /c

nu nu

camundongos com idade de 8 semanas (Centro de Recursos Animal, Canning Vale, Austrália) foram alojados em grupos de 5, com livre acesso à ração padrão e água ao longo do estudo, pesados ​​semanalmente para determinar o consumo . A temperatura ambiente foi controlado a 22 ° C ± 2 ° C, a 40-60% de humidade, com luz de um ciclo de 12 horas /escuridão. Os ratinhos foram injectados com células previamente preparados, em seguida, divididos aleatoriamente em 4 grupos, que consiste em tratamento EPA (EPAX, Aalesund, Noruega, 0,4 g /kg /dia, N = 9 [EPA]), o tratamento oxipurinol (Sigma-Aldritch, Castelo-Hill , Austrália; 1 mmol /L na água potável, n = 9), o tratamento de combinação (como por EPA e grupos oxipurinol n = 9), ou o grupo de controlo caquexia do cancro (n = 13). Os animais foram monitorizados diariamente para mudanças no peso corporal, e os tamanhos do tumor medido utilizando calibradores. Os ratinhos foram terminadas por injecção de pentobarbital de sódio (30 mg /kg) (Virbac Saúde Animal, Regents Park, Austrália) a 29 dias, quando a perda de peso atingiu 25%, ou o tamanho do tumor atingiu 1,000 milímetro

3, o que ocorrer primeiro. tecidos musculares, incluindo gastrocnêmio, sóleo, plantarus, tibial anterior (TA), e quadríceps, foram removidos e pesados. Todas as amostras foram rapidamente congeladas e armazenadas a -80

oC para análise posterior.

Oxidative stress

Um kit de ELISA foi usado para medir o subproduto da oxidação de ADN de 8-hidroxi-2-desoxi guanosina (8-OH-2DG) (StressMarq Biosciences, Victoria, Canadá) como um marcador de estresse oxidativo [32]. O DNA foi extraído a partir de 10 mg do músculo do gastrocnémio usando um kit de isolamento de ADN (Promega, Sydney, Austrália). Cada amostra foi, em seguida, diluiu-se de modo a que 50 ug de ADN foi utilizado no ensaio de 8-OH-2DG. O imunoensaio competitivo envolve a ligação de livre 8-OH-2DG a um anticorpo revestido placa de 96 poços. A concentração de ensaio e a amostra de 8-OH-2DG foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante.

Gene Expression

O ARN total foi extraído a partir de 10 mg de músculo gastrocnémio congelados usando o reagente TRI (astral Scientific, Sydney, Austrália) de acordo com a especificação do fabricante. A concentração de ARN total foi determinada por medição de A260 /A280. Um micrograma de RNA total foi transcrito de modo reverso em cDNA usando inversa de AMV transcriptase kit de síntese de ADNc de primeira cadeia de acordo com o protocolo do fabricante (Marligen Biosciences, Sydney, Austrália). PCR em tempo real foi realizado utilizando um sistema de detecção de IQ5 Bio-Rad, com reacções realizadas utilizando SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Sydney, Austrália). Os iniciadores foram concebidos utilizando o iniciador 3, e obtido a partir de Geneworks (Hindmarsh, Austrália; Ver Tabela 2). A amplificação das amostras de cDNA foi realizada utilizando o IQ SYBR verde ™ seguindo os protocolos do fabricante (BioRad, Sydney, Austrália) dados de emissão fluorescente foi capturado e os níveis de mRNA foram analisados ​​utilizando o valor limiar crítico (CT) [35]. ciclos térmicos e detecção de fluorescência foram realizadas utilizando o sistema de detecção de sequência IQ5 BioRad (BioRad, Sydney, Austrália). As amostras foram normalizados para a concentração de cDNA determinadas com OliGreen (Invitrogen, Mulgrave, Austrália) [36]

Protein Enzima Análise de Actividade

Gastrocnemius amostras de tecido muscular (20 mg) foram homogeneizadas e centrifugadas a 10.000

g

a 4 ° C durante 10 minutos. A concentração de proteína foi determinada através do método de Bradford (BioRad, Sydney, Austrália). SOD Total, glutationa peroxidase (GPx), a catalase e atividade XO foram medidos com kits de ensaio de enzima comercial conforme as instruções do fabricante (Sapphire Bioscience, Waterloo, Austrália; Invitrogen, Mulgrave, Austrália).

Estatísticas

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS Statistics versão 17.0 (IBM, Chicago, EUA) ou GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, EUA), com resultados expressos como média ± erro padrão da média (SEM) e considerou estatisticamente significativa se a P 0,05, salvo indicação em contrário. Os dados foram analisados ​​usando ANOVA de duas vias, com um teste post-hoc de Tukey análise realizada para determinar as diferenças entre grupos onde apropriado. Correlação foi analisada usando dados Perda de peso Pearsons teste foram analisados ​​utilizando ANOVA com a análise de Bonferroni post-hoc.