Abstract

Leite Fat Globule – EGF – Fator VIII (MFGE8), também chamado lactadherin, é uma proteína segregada, que se liga a fosfatidilserina e extracelularmente a aVp3 e a aVp5 integrinas. Em células humanas e de ratinho que expressam estas integrinas, tais como as células endoteliais, os fagócitos e alguns tumores, MFGE8 /lactadherin foi mostrado para promover a sobrevivência, a epitelial e mesenquimal fagocitose. Uma função de protumoral MFGE8 foi consequentemente documentado por alguns tipos de cancros humanos, incluindo o melanoma, um subtipo de cancros da mama, e carcinoma da bexiga. A inibição das funções de MFGE8 poderia, portanto, representam um novo tipo de terapia de cancros humanos. Aqui, mostramos por imuno-histoquímica em uma coleção de cancros do ovário humanos que MFGE8 é sobre-expresso em 45% destes tumores, e confirmamos que ele é especificamente sobre-expresso no subtipo triplo-negativo dos cancros da mama humanos. Nós estabelecemos novos

in vitro

ensaios para medir o efeito de MFGE8 na sobrevivência, adesão e migração de ovário humano e linhas de células de câncer de mama triplo-negativo. Usando estes ensaios, foi possível identificar novos anticorpos monoclonais específicos de MFGE8, que bloqueou eficientemente estes três efeitos de promoção de tumor de MFGE8. Nossos resultados sugerem a utilização futura de anticorpos como novas terapias anti-câncer em subgrupos de carcinoma de ovário, e pacientes com carcinoma de mama triplo-negativo MFGE8 de bloqueio

Citation:. Tibaldi L, Leyman S, Nicolas A, Notebaert S, Dewulf M, Ngo TH, et al. (2013) New anticorpos bloqueadores Impedir adesão, migração e sobrevivência das células do cancro do ovário, com destaque para MFGE8 como um alvo terapêutico potencial do ovário humano Carcinoma. PLoS ONE 8 (8): e72708. doi: 10.1371 /journal.pone.0072708

editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia

Recebido: 18 Janeiro, 2013; Aceito: 15 de julho de 2013; Publicação: 16 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tibaldi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Institut Curie, INSERM, Association pour La Recherche contre le Cancer, um prêmio da Fondation de France, e um contrato de colaboração de dois anos entre o Institut Curie, INSERM, e ThromboGenics NV, Leuven, Bélgica (www.thrombogenics.com) . ThromboGenics NV delinearam a estratégia para a geração de anticorpos, realizada a imunização ratos, verificou a especificidade dos novos anticorpos MFGE8 anti-humanos, sequenciado suas regiões variáveis, e participou na concepção dos testes para a seleção dos anticorpos candidatos chumbo.

Competir interesses: os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: parte deste trabalho foi subsidiado através do financiamento para a equipe de Clotilde Théry incluindo salário de Lorenzo Tibaldi, como um contrato de colaboração entre Institut Curie, INSERM, e ThromboGenics NV, Bélgica. Shirley Leyman, Sofie Notebaert, Thu Hoa Ngo e Claudia Zuany-Amorim são empregados por ThromboGenics NV. O pedido PCT internacional que abrange os anticorpos descritos, co-propriedade de ThromboGenics NV, Institut Curie e INSERM, foi arquivado sob o número PCT /EP2013 /056057. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS ONE sobre partilha de dados e materiais com laboratórios acadêmicos.

Introdução

Para desenvolver-se como um tumor full-blown, uma célula deve não só adquirem propriedades das células-autônoma de proliferação e resistência à morte programada, mas também estabelecerem interacções com o seu microambiente permitindo sua proliferação sustentada, e evitando a eliminação [1]. Os fibroblastos, células endoteliais que formam os vasos sanguíneos e células do sistema imunológico todos os sinais de intercâmbio com as células transformadas através de interacções ligando-receptor directos, bem como através de factores solúveis e vesículas de membrana extracelular que actuam a uma distância a partir das células tumorais. Os tumores podem portanto segregam factores de crescimento actuando de forma autócrina para sustentar a sobrevivência, mas também de uma forma parácrina sobre as outras células do seu microambiente

Leite glóbulo de gordura -. EGF – factor VIII (MFGE8), também chamada lactadherin, é um desses factores segregados com funções potenciais pleiotrópicos. Originalmente clonado como uma das principais proteínas de glóbulos de gordura do leite [2,3], o bovino, humano (MFGE8) e proteínas de rato (Mfge8) foram mostrados para conter dois domínios funcionais distintos: os domínios EGF-semelhantes, incluindo uma ligação contendo RGD sequência a aVp3 e avp5 integrinas, e Fator VIII-like (ou discoidin) domínios de ligação a fosfolipídios (fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina). MFGE8 /Lactadherin é, assim, ligado não covalentemente a lípidos em vesículas extracelulares, e interage com as células alvo que expressam aVp3 /5 integrinas. MFGE8 ligação a células endoteliais foi mostrado para promover a sobrevivência dependente de VEGF e a angiogénese [4], bem como a fagocitose de células apoptóticas [5]. No ratinho, Mfge8 promove a fagocitose de células apoptóticas por macrófagos [6], e inclina-las a segregar citoquinas tolerogénicos [7]. Em algumas próprias células tumorais, MFGE8 foi mostrado para induzir epitelial para mesenquimal [8,9], e /ou para aumentar a resistência à apoptose induzida pela droga [10,11].

Todos estes resultados salientam como MFEG8 um alvo promissor para inibidores que podem ser desenvolvidos para limitar a progressão do tumor. Em alguns tipos de cancros humanos, um papel pró-tumoral da MFGE8 foi demonstrada, com base em alta superexpressão durante a progressão do tumor, e /ou no tratamento de modelos do rato: destes cancros incluem carcinoma de bexiga (o nosso próprio trabalho [12]), melanoma [8], e o subtipo triplo negativo de cancro da mama [13]. No entanto, em alguns outros cancros, tais como receptores hormonais (RH) e /ou cancros da mama humanos que expressam HER2 [13], MFGE8 não é sobre-expresso, e parece que, em vez de prevenir a progressão do tumor. Assim, a geração de novas ferramentas para inibir as funções pleiotrópicas de MFGE8, bem como identificar os alvos cancerosas humanas certas de tais ferramentas, deve ser realizada simultaneamente, se esperamos alcançar eficientes novas terapias.

Aqui, analisando MFGE8 expressão em grandes conjuntos de biópsias de tumores humanos, e estabelecendo novos ensaios funcionais para medir os efeitos da MFGE8 e de novos anticorpos MFGE8-bloqueio sobre a fisiologia das células tumorais, identificamos carcinoma de ovário, e confirmou o carcinoma de mama triplo-negativo como alvos promissores que poderiam se beneficiar de terapias MFGE8 inibidoras.

resultados

MFGE8 superexpressão em cancros do ovário

em um trabalho anterior, utilizando dados de expressão de mRNA disponíveis, compiladas no website Oncomine (

www.oncomine.org

), foi observada uma regulação positiva significativa do

MFGE8

gene no nível transcriptomic em um subgrupo de cancros humanos, incluindo adenocarcinomas seroso do ovário [12]. Dada a necessidade de novos tratamentos para esse tipo de câncer, que muitas vezes apresenta em estágio avançado, decidimos explorar mais os papéis de MFGE8 no carcinoma do ovário. Para confirmar a observação de

MFGE8

sobre-expressão do mRNA ao nível da proteína, foram utilizados dois microarranjos de tumor gerados internamente, contendo 50 biópsias de pacientes com cancro do ovário de todos os graus e tipos (Tabela S1). A imuno-histoquímica para detectar MFGE8 nestes tumores foi realizada utilizando o nosso anticorpo anteriormente descrito policlonal de coelho anti-MFGE8 [4], e a análise das colorações foi realizada por um patologista. Como relatado anteriormente [4,12], MFGE8 foi detectado nos vasos sanguíneos presentes dentro dos tumores (seta na Figura 1a). Além disso, as células tumorais MFGE8-positivos próprios foram observados em várias biópsias. Como se mostra na Figura 1a, o nível de expressão global da proteína foi variável entre tumores individuais, variando de ausente (0), a muito forte em todo o tumor (3). Classificação dos tumores de acordo com o nível de proteína MFGE8 (Figura 1b) mostrou que 45% (22/48) altamente expressa MFGE8 (nível 2-3). tumores MFGE8-sobre-expressam eram de todos os tipos (1 a 3, Figura 1b), de todos os tipos, e de uma variedade de estado metastático (Tabela S1), assim MFGE8 sobre-expressão pode não ser usado como um prognóstico ou um marcador de diagnóstico de cancro do ovário. A elevada proporção de tumores com superexpressão MFGE8, no entanto, levou-nos a explorar ainda mais o seu valor como um alvo terapêutico para cancros do ovário

(a) Exemplos de MFGE8 humano imuno-histoquímica em cortes de carcinoma de ovário mostrando:. Sem coloração de células tumorais (pontuação 0), mas células endoteliais MFGE8-positivos (seta preta) no painel esquerdo. Áreas de expressão fraco (w) e de expressão médio (m) de MFGE8 na mesma seção, portanto, classificada como grau 2 no painel do meio. expressão forte MFGE8 (s) em todo o tumor, classificados como pontuação 3 (painel da direita). (B) avaliação da expressão MFGE8 (eixo y) em 48 biópsias do tumor dos ovários de pacientes do Institut Curie, como uma função de (eixo X-) o grau do tumor. Não foi observada diferença estatisticamente significativa na distribuição dos tumores com superexpressão MFGE8 (escore 2-3) ou não (escore 0-1) no grau 2 versus 3 tumores de grau.

desenvolvimento de ensaios in vitro para quantificar os efeitos de MFGE8 sobre células de cancro do ovário

Desde MFGE8 tem sido demonstrado em vários tipos de células, incluindo algumas células de tumor, para promover a adesão, a sobrevivência e /ou epitelial-mesenquimal-a transição possivelmente levando a migração, criámos novo

in vitro

ensaios para medir esses resultados fisiológicos no contexto do carcinoma de ovário. Na maioria dos estudos, estes efeitos de MFGE8 foram atribuídas à sua ligação em avp3 e /ou avp5 integrinas nas células alvo. Para seleccionar linhas de células para avaliar o efeito de terapias anti-MFGE8, analisou-se primeiro o nível de

MFGE8

e seus receptores em uma colecção de linhas de células de cancro do ovário humano expressão de ARNm. resultados públicos da linha celular Broad-Novartis Cancer Encyclopedia foram utilizados para este fim (https://www.broadinstitute.org/ccle/home). Fora das linhas de células 38 tumor (Figura 2A), apenas 5 não expressou

MFGE8

acima do nível de confiança ((MAS5 “Ausente” bandeira correspondente a um sinal de expressão Affymetrix U133plus2.0 (Log

2 .) inferior a 6.1 para este conjunto de sondas) Foi confirmada a secreção de proteínas MFGE8 por análise ELISA do meio condicionado de duas das linhas de células que expressam ARNm: SKOV-3 e IGROV-1, e identificou-se uma outra linha de células de carcinoma do ovário, SHIN- 3 [14], que não segregam níveis detectáveis ​​de MFGE8

in vitro

(Figura 2b). as 38 linhas celulares de tumor expressa os genes que codificam para aV (

ITGAV

, sinal de expressão acima em 10 maior parte dos casos, os dados não mostrados), e cadeias β5 integrina (

ITGB5

, Figura 2c). em contraste, o sinal de Affymetrix para a cadeia de integrina β3 (

ITGB3

) foi apenas perto da confiança nível (sinal expressão = 4,8 para este conjunto de sondas) para a maioria das linhas celulares (23/38 = 60,5%), incluindo células SKOV-3 e IGROV-1, sugerindo fraca ou nenhuma expressão desta integrina. por citometria de fluxo, no entanto, tanto SKOV-3 e IGROV-1 apresentada aVp3 em adição a avp5 na sua superfície, enquanto que SHIN-1 é indicado apenas avp5 (Figura 2d). Nós, portanto, escolheu a linha de células SKOV-3 como um exemplo representativo de uma grande parte das linhas de células de cancro do ovário (médio-alto

MFGE8

, detectável

ITGB3

e

ITGB5

), e um suscetível a responder a MFGE8 uma vez que expressa os receptores conhecidos para MFGE8, para desenvolver

in vitro

ensaios funcionais.

(a) Análise dos níveis de expressão de mRNA ( log

2 (sinal U133plus2.0 Affymetrix)) de

MFGE8

no resultado públicas de dados de microarrays da linha celular Broad-Novartis Cancer Encyclopedia. O limiar de nível de expressão por trás da qual ele poderia ser considerado como ruído (MAS5 “Ausência” estatuto de bandeira, o gene não é expresso) é de 6,1 para este conjunto de sondas. Setas pretas indicam as linhas de células SKOV-3 e IGROV-1. (B) Quantificação da MFGE8 por ELISA em células SKOV-3, IGROV-1 e Shin-3 meio condicionado (24 h). Segregada MFGE8 é expressa em ng /mL por 10

6 células cultivadas. A média de duas experiências + SD. (C) Análise dos níveis de expressão de mRNA (Log

2 (sinal Affymetrix U133plus2.0)) de

ITGB3

(vermelho) e

ITGB5

(verde) no resultado públicas de dados microarray da linha de células da Novartis largo-cancro Enciclopédia. O limiar de nível de expressão por trás da qual ele poderia ser considerado como ruído (MAS5 “Ausência” estatuto de bandeira, o gene não é expresso) é de 4,8 para o

ITGB3

de sondas. (D) Análise FACS de aVp3 (painel superior) e avp5 (painel inferior) integrinas expressão na superfície de células SKOV-3, células de IGROV-1 e Shin-3. anticorpo específico (linha azul). controlo de isotipo (linha vermelha).

Nós desenvolvemos 3 tipos de ensaios para investigar os efeitos da MFGE8 na adesão, migração e sobrevivência das células tumorais. O sistema xCELLigence (ACEA Biosciences), um dispositivo que permite em tempo real a medição de se ligar a um substrato celular, foi utilizada para quantificar a aderência de curto prazo para humano recombinante MFGE8 (Figura 3a-e), e a migração Transwell de longo prazo para MFGE8 em a presença de soro fetal de vitelo (FCS 0,1%) (Figura 3F-h). Clássica à base de quantificação de fluorescência do número de células foi utilizado para avaliar a sobrevivência a longo prazo em condições de fome (Figura 3i, j).

(a-e) Ensaio de adesão de células SKOV-3 de MFGE8 usando o sistema xCELLigence . (A) Exemplo de índice de célula (Cl) como uma função de tempo, em PBS ou MFGE8 humana (huMFGE8), na presença de anti-huMFGE8 ou IgG de controlo. linhas verticais azuis e vermelhas indicam os pontos temporais utilizadas para calcular valores de inclinação. (B) Adesão de SKOV-3 de MFGE8, em comparação com o PBS (Ctrl), quantificada pelo valor do declive entre 0 e 2 h. (C) Inibição de adesão a 5 ug /mL MFGE8 por 10 ug /ml de anti-huMFGE8 (hMc3) ou um controlo negativo (rituximab, Ritux). (D) Efeito sobre a adesão de 5 ug /mL MFGE8 (Ctrl) de soros anti-huMFGE8 policlonal (1/100) específico para o domínio de RGD (anti RGD), o domínio C1 (anti C1) ou o domínio de RGD de rato Mfge8 (anti RGD mouse). (E) A inibição da adesão de 5 ug /mL MFGE8 (Ctrl) por anticorpos anti-aVp3 e /ou -αvβ5 anticorpos de integrina (5 ug /mL de cada vez). (F-g) Ensaio de migração de células SKOV-3, utilizando xCELLigence. As células foram semeadas na câmara superior, e MFGE8 e anticorpos na câmara baixa do CIM-placas. (F) Exemplo de índice de células (eixo Y) como uma função do tempo (eixo dos x), em condições semelhantes às que (a). linhas verticais azuis e vermelhas indicam os pontos temporais utilizadas para calcular valores de inclinação. (G) efeito dose-dependente de MFGE8 sobre células SKOV-3 de migração, como comparado com PBS (Ctrl), quantificada pelo valor de inclinação de 0 a 18 horas. (H) A inibição da migração para 5 ug /mL huMFGE8 por 10 ug /ml de anti-huMFGE8 hMc3, como comparado com o controlo negativo (Ritux). (I-j) Ensaio de Sobrevivência de SKOV-3 cultivadas durante 96 horas na presença de soro a 0,1%. O número de células é quantificado em unidades arbitrárias de fluorescência (u.a.), em comparação com a condição de controle correspondente a 100%. (I) efeito dose-dependente de MFGE8 na sobrevivência SKOV-3. 100% = nível basal de A.U. na ausência de MFGE8 exógeno (Ctrl). (J) A inibição da sobrevivência na presença de 10 ug /mL huMFGE8, por 10 ug /ml do anticorpo ou hMc3 negativo. 100% = nível basal de A.U. na presença de MFGE8. Os dados são representados como a caixa-and-suiças gráficos que mostram o mínimo (menor margem de erro), 25

percentil-mediana-75

th valores percentuais e máximo (superior barra de erro). N = 4 (a não ser 3j: N = 5). *** = P 0,001; ** = P 0,01; * = P 0,05 comparado com Ctrl = PBS em 3b, g; a 0,312 ug /ml em MFGE8 3i; ou Ctrl = MFGE8 em 3c, d, e, h, j ..

O dispositivo xCELLigence mede continuamente mudanças na impedância induzidas pelas células quando se deparam com eletrodos que cobrem a parte inferior de uma microplaca de cultura (ePlate ). O nível de sinal de impedância é proporcional ao número de células e a intensidade da sua interacção com o substrato, e este sinal pode, assim, ser convertido para um valor de índice de células arbitrária (Figura 3a, F). A eficiência da ligação de células é calculado como o declive da impedância observado nas primeiras duas horas após a sementeira de células (Figura 3a-e). Para medir a adesão de células SKOV-3 a MFGE8, MFGE8 humana recombinante foi revestida sobre os micropoços xCELLigence, em condições semelhantes às que tinham anteriormente utilizado para analisar a ligação de células endoteliais humanas para MFGE8 [4]. A Figura 3b mostra que MFGE8 permitido ligação das células ao substrato de um modo dependente da dose. Foram testados os efeitos dos anticorpos anteriormente descritos específicos para MFGE8 humana neste ensaio: soro de coelho gerado no nosso laboratório, reconhece respectivamente, quer o domínio de ligação de integrina RGD contendo [4] ou o domínio de C1 humano discoidin MFGE8 (C. Théry, dados não publicados), e uma versão humanizada do anticorpo monoclonal Mc3 descrito por Ceriani et al [15], (hMc3) [16] também reconhecendo o domínio de ligação a integrina da MFGE8. Tanto o anticorpo hMC3 (Figura 3c) e o domínio de coelho anti-RGD (Figura 3D) a adesão de células fortemente inibido, enquanto que nem um anticorpo humanizado de controlo (Ritux, Figura 3c), nem o anticorpo anti-C1 de soro domínio coelho, nem um soro de coelho à RGD-domain de rato Mfge8 (anti anti RGD rato C1 ou, Figura 3d) inibiu-lo. Finalmente, anticorpos bloqueadores de aVp3 ou avp5 inibiu a ligação, e seus efeitos foram aditivos (Figura 3e). Assim, a adesão das células SKOV-3 de MFGE8 é mediada pela interacção dos aVp3 /5 que expressam as células com o domínio contendo RGD de MFGE8.

O dispositivo xCELLigence foi usado no próximo com micropoços revestidos câmara de Boyden-eléctrodos ( as placas CIM), que permite a medição da impedância produzido após a migração das células para o lado inferior de uma poro do filtro de 8 um separar a parte superior da câmara inferior (Figura 3F). A capacidade das células para migrar para o compartimento de MFGE8 contendo inferior, na presença de uma pequena quantidade idêntica de FCS em ambos os compartimentos (0,1%), foi calculada como o declive do índice de célula entre 0 e 18 horas após a sementeira de células no câmara superior (Figura 3F-h). Figura 3G e 3H mostram que MFGE8 induzida SKOV-3 migração de uma forma dependente da dose, e que, como para o ensaio de adesão, hMC3 inibida especificamente este efeito.

O terceiro ensaio mediu o efeito sobre a sobrevivência de MFGE8 de células SKOV-3 em cultura em condições de fome (0,1% de FCS). A presença de MFGE8 induziu um aumento dependente da dose de sobrevivência SKOV-3, detectáveis ​​quatro dias após a sementeira (Figura 3i), que, embora não muito forte, foi reprodutível. Este efeito também foi especificamente bloqueada pelo anticorpo hMC3 MFGE8 específico do (Figura 3-J).

Geração de anticorpos monoclonais anti-MFGE8 novos com propriedades anti-tumorais

Para validar o nosso novo robusta e reproduzível

in vitro

ensaios como ferramentas para identificar novos agentes bloqueadores MFGE8, nós utilizado para rastrear uma grande conjunto de novos anticorpos anti-MFGE8 gerados pela imunização de camundongos nossos Mfge8 deficientes [4,17] com MFGE8 recombinante. Em todos os ensaios, as condições experimentais foram comparadas com as células cultivadas na presença de MFGE8, considerados como sinal de 100%. Os anticorpos monoclonais exibindo ligação específica para MFGE8 humano

In vitro

, e nenhuma ligação a outras proteínas com domínios estruturais comuns (isto é, vitronectina e Factor VIII) foram testados no ensaio de adesão de células SKOV-3. Os diferentes anticorpos exibidos actividades inibidoras de diferentes neste ensaio. A Figura 4a mostra exemplos de resultados do rastreio inicial (realizada uma vez) para 10 candidatos. Foram selecionados cinco anticorpos que apresentavam actividades semelhantes ao hMc3 anticorpo de referência quando utilizados a 50 ou 10 ug /mL.

(a) Efeito de 10 novos anticorpos anti-MFGE8 (10 ou 50 ug /ml) sobre a aderência para MFGE8 (ensaio de ades), em comparação com hMC3. 100% de adesão corresponde a 5 mg de revestimento /mL MFGE8 sem anticorpos (Ctrl). Exemplo das experiências de rastreio, realizada uma vez com cada um dos 40 novos anticorpos. Setas pretas indicam os anticorpos seleccionados para posterior caracterização. (B) Efeito dose-resposta dos anticorpos seleccionados 5, em comparação com hMC3 no ensaio de adesão. (C) Efeito dose-resposta dos anticorpos seleccionados 5, em comparação com hMC3 no ensaio de migração. 100% de migração corresponde a 5 ug /mL MFGE8 sem anticorpos. (D) Efeito dose-resposta dos anticorpos seleccionados 5, em comparação com hMC3 no ensaio de sobrevivência. 100% de sobrevivência corresponde a 10 ug /mL MFGE8 recombinante sem anticorpos. gráficos Box-e-suiças como na Figura 3. N = 4 (excepto em (c) para 215A9 -10 ug /mL e 311A7 -0,625 ug /ml: N = 3 e para hMc3: n = 2; em (b) para -5μg 215A9 /mL: N = 2). *** = P 0,001; ** = P 0,01; * = P . 0,05 em comparação com a concentração de anticorpo mais baixa (0,5 ou 0,625 ug /ml) para cada anticorpo individual no 4b, c, d

Para determinar a eficácia destes candidatos 5, quantidades decrescentes de anticorpo 50-0,5 ug /ml foram usadas no ensaio de ades (Figura 4B). Na presença de 10 ug /mL de hMc3 ou todos os clones, à excepção de 346B6, observou-se menos de 20% da adesão celular. No caso de 346B6 a 10 ug /mL, foi detectado 40% de adesão celular (média de 4 medidas). Na presença de 0,5 ug /mL de três clones (416H9, 311A7 e 399A12), foi observada a aderência de células 60%, enquanto que 90% de adesão foi obtido com hMc3 a esta concentração.

Quando testado numa dose configuração de resposta no ensaio de migração (Figura 4-C), todos os anticorpos diminuiu a migração quando utilizada na concentração mais elevada (20 ug /mL). Dois clones (416H9, 399A12) diminuiu significativamente a migração quando usado em 2,5 ug /mL.

Finalmente, os anticorpos foram testados no ensaio de sobrevivência na presença de 10 ug /mL MFGE8 (= 100% de sobrevivência na figura 4d). 346B6, o clone menos eficiente nos outros dois ensaios, não diminuiu a sobrevivência em qualquer concentração, dois outros induzida no máximo 30% de inibição (= sinal de sobrevivência de células de 70% permaneceu), quando utilizado na concentração mais elevada (2154A9 e 311A7), enquanto as duas últimas (416H9 e 399A12) foram tão eficientes como hMc3, e diminuição do número de células para menos de 50% das células tratadas apenas com MFGE8-(= 50% de sobrevivência).

o uso combinado de três ensaios complementares portanto, permite a seleção clara de 2 anticorpos, de 40, como potencialmente as ferramentas mais eficientes para inibir simultaneamente adesão, migração e sobrevivência de MFGE8- e aVp3 /5 expressando carcinoma de ovário.

Efeito da MFGE8 e MFGE8 bloqueador anticorpos sobre outras células de carcinoma do ovário

para determinar se os resultados obtidos com células SKOV-3 foram representativos de outras linhas de células de carcinoma do ovário, foram realizados os mesmos três ensaios utilizando IGROV-1 e Shin-3, que, como mostrado na Figura 2, expressa aVp3 e MFGE8 /5 integrinas em níveis semelhantes aos SKOV-3 (IGROV-1), ou não expressaram MFGE8 ou a integrina avp3 (SHIN-3). Três anticorpos representativo dos três tipos de eficiências observadas em células SKOV-3 foram utilizadas aqui: 399A12, 311A7 e 346B6, respectivamente eficiências de alta, média e baixa de bloqueio. No ensaio de adesão à base de xCELLigence (Figura 5a, b), SHIN-3 deu um menor sinal de impedância de 20 vezes do que, mas como em células SKOV-3 ou IGROV-1 (comparar valores de declive na Figura 5b e 5a) SKOV-3 , a adesão foi aumentada para ambas as linhas de células na presença de 5 ug /mL MFGE8, e inibida de um modo dependente da dose, pelos anticorpos 3. No ensaio de migração (Figura 5c, d), onde SHIN-3 exibiu um índice de migração semelhante ao SKOV-3 e IGROV-1, os três anticorpos também inibiram a migração de MFGE8-dependente de IGROV-1 e Shin-3 numa dose forma dependente, e com a mesma eficiência de alta, média e baixa como em células SKOV-3. Em contraste, o ensaio de sobrevivência (Figura 5e, f) mostrou um efeito diferente do MFGE8 nas três linhas de células: SHIN-3 não apresentaram qualquer aumento da sobrevivência na presença de MFGE8, nem qualquer efeito dos anticorpos MFGE8-bloqueio na presente ensaio, ao passo que IGROV-1 comportou-se como células SKOV-3.

(a-b) Adesão de IGROV-1 (um) e Shin-3 (b) a 5 ug /mL MFGE8, em comparação com PBS, quantificada pelo valor de inclinação entre 0 e 2 h. O efeito de três anticorpos seleccionados entregue em duas doses (2,5 e 10 ug /mL) em poços revestidos com MFGE8 também é mostrada. (C-d) IGROV-1 (c) e Shin-3 (d) ensaio de migração para 5 ug /mL MFGE8 como na Figura 3-4, e inibição por anticorpos, tal como nos painéis a e b para a aderência. valores Pistas calculada entre 0 e 18 horas. (D-e) IGROV-1 (d) e Shin-3 (e) ensaio de sobrevivência na presença de 10 ug /mL MFGE8, como na Figura 3-4, e inibição por anticorpos ou 2,5 10 � /ml. 100% de sobrevivência corresponde a 10 ug /mL MFGE8 sem anticorpos. gráficos Box-e-suiças como na Figura 3. N = 4 (excepto em (b): 399A12 -2,5 ug /mL, 346B6 -10 ug /mL, 311A7 -10 ug /ml: n = 3; em (e, f) PBS e MFGE8: N = 5; em (f) MFGE8 + 311A7: N = 3). *** = P 0,001; ** = P 0,01; * = P . 0,05, em comparação com Ctrl = MFGE8

MFGE8 superexpressão em triplos cânceres de mama negativos

Finalmente, para determinar se os novos agentes MFGE8-bloqueadores, tais como os anticorpos identificados acima, poderia ser utilizada para o tratamento de outros tumores, analisou-se a expressão por imuno-histoquímica MFGE8 na nossa colecção de biópsias de tumor da mama a partir de doentes tratados gerados pelo Institut Curie (Tabela S2). MFGE8 foi mais fortemente expressa em pacientes com graus avançados do cancro da mama (Figura 6a), e mais especificamente no HR /subtipo triplo-negativa HER2 destes cancros (que são em maioria de grau 3): 13/20 = 65 % das biópsias de triple-negativo apresentaram níveis MFGE8 classificados como 2 ou 3, enquanto que apenas 5/36 = 13,8% do receptor de hormona (RH) e /ou tumores positivos para HER2 níveis indicadas 2 ou 3 de expressão MFGE8 (Figura 6b). Estas observações confirmam os resultados, assim, recentemente publicados por Yang e colegas [13].

(a-b) Pontuação da expressão MFGE8, analisados ​​por imuno-histoquímica, como na Figura 1, em 59 biópsias de tumor da mama a partir de doentes de Institut Curie, como uma função do grau do tumor (a) ou fenótipo em termos de Hormon Receptor (HR) ou a expressão de HER2 (b). ***: P = 0,0001 para a distribuição dos tumores com superexpressão (escore 2-3) ou não (escore 0-1) MFGE8 entre o grau 2 versus grau 3 tumores (a), ou entre HR + /HER2 contra tumores triplo-negativos ( b). (C) Análise dos níveis de expressão de ARNm (Log

2 (sinal Affymetrix U133plus2.0)) de

MFGE8

em resultados de dados públicas de microarray Affymetrix da linha de células da Novartis Largo-cancro Enciclopédia como na Figura 2 . seta preta indica a linha celular MDA-MB-231 (HR /HER2 fenótipo negativo triplo) seleccionado para experiências subsequentes. (D) Quantificação de MFGE8 por ELISA em MDA-MB-231 de meio condicionado (24 h). Segregada MFGE8 é expressa em ng /mL por 10

6 células cultivadas. A média de duas experiências + SD. (E) Análise FACS de aVp3 (painel da esquerda) e avp5 (painel da direita) integrina expressão na superfície de células MDA-MB-231. anticorpo específico (linha azul). controlo de isotipo (linha vermelha). (F) Ensaio de MDA-MB-231 de adesão de 5 ug /mL MFGE8, como na Figura 3-5, e a inibição por 10 ug /mL hMC3, representados como valores de inclinação entre 0 e 1 hora. (G) ensaio de migração de células MDA-MB-231 a 5 ug /mL MFGE8 como na Figura 3-5, e a inibição pelo anticorpo de 10 ug /mL 215A9. Dados representados como valores de declive calculado entre 0 e 18 horas. (H) MDA-MB-231 ensaio de sobrevivência na presença de 10 ug /mL MFGE8, como na Figura 3-5, e a inibição por 10 ug /mL 399A12. 100% de sobrevivência corresponde a 5 ug /mL MFGE8 sem anticorpos. gráficos Box-e-suiças como na Figura 3. N = 4 (excepto em (g): PBS n = 6, MFGE8 215A9 + n = 5, e em (h): Ctrl n = 6, MFGE8: n = 5) . ***: P 0,001, **:. P 0,01, em comparação com Ctrl = MFGE8

Consistentemente, análise da linha de células Broad-Novartis Cancer dados de linhas celulares de cancro da mama expressão Enciclopédia mostrou expressão de

MFGE8

acima do nível de confiança (Log

sinal de 2 Affymetrix U133plus2.0 de MAS5 flag “ausência” = 6,1 para

MFGE8

) na maioria dos triplo-negativo células da mama (24/29 = 82%), enquanto apenas 2/23 = 9% da FC e /ou células HER2 + expressaram o gene (Figura 6c). Finalmente, testou-se os efeitos de MFGE8 e os anticorpos de bloqueio na adesão, migração e sobrevivência da linha de células MDA-MB-231 triplo-negativo, que segrega MFGE8 e expressa aVp3 e avp5 integrinas como SKOV-3 e IGROV-1 (Figura 6d, e). Como mostrado na Figura 6F-H, MDA-MB-231 de adesão exibida induzida MFGE8 (Figura 6F), a migração (Figura 6g), e sobrevivência (Figura 6H). Além disso, os anticorpos anti-MFGE8 exibido efeitos semelhantes em células MDA-MB-231, como o fizeram sobre células SKOV-3.

Os nossos resultados confirmam assim MFGE8 como um alvo promissor para uma estratégia à base de anticorpo com o objectivo de bloquear tumoral o crescimento dos cânceres de mama triplo-negativos

Discussão

Os resultados aqui apresentados destacar um novo tipo de câncer como um potencial alvo para terapias MFGE8 de bloqueio:. carcinoma de ovário. Além disso, descrevemos novos ensaios adaptável a triagem em larga escala, e para linhas celulares de cancro de origens diferentes de tecidos, o que permitirá a identificação dos agentes MFGE8-bloqueadores mais úteis a serem utilizados na próxima pré-clínica

in vivo

os ensaios de crescimento do tumor.

a análise combinada de 3 efeitos fisiológicos da MFGE8 /lactadherin sobre as células tumorais, ou seja, adesão, migração e sobrevivência, permitiu-nos para classificar 5 anticorpos específicos para MFGE8 diferentes e compará-los com a referência anticorpo hMc3. Mc3 foi descrito há 30 anos pela sua capacidade de se ligar a antigénios circulantes de células epiteliais mamarias em doentes com cancro [18]. Foi logo após mostrado para inibir o crescimento de tumores da mama humanos em ratinhos nus, isoladamente [15] ou, de forma mais eficiente, como um conjugado com

131I [19]. O antigénio reconhecido por Mc3 foi clonado como MFGE8 (no momento chamado BA46) alguns anos mais tarde, [3], e mapeamento de epítopos identificado o domínio EGF contendo RGD como alvo de Mc3, enquanto que outro anticorpo, MC8, reconhecido um epítopo na domínio C2 e não tenha apresentado atividade antitumoral

in vivo

[20]. Nos nossos três ensaios, Mc3 inibida eficientemente os efeitos da MFGE8 recombinante, sugerindo que o domínio de RGD e sua interacção com aVp3 /5 integrinas são necessários para adesão, migração através Transwell, e a sobrevivência das células. Uma vez que foi observado que, entre os nossos anti-soros de coelho anti-MFGE8 dois, apenas o reconhecimento RGD blocos do domínio de adesão, podemos excluir um papel de outros domínios de MFGE8 neste tipo de função. Mas não podemos excluir que a migração ea sobrevivência também pode ser mediada por outros tipos de interações de MFGE8 com a célula-alvo, possivelmente através de outro receptor, como sugerido pela ligação esperma ao ovo mediado por SED1 (outro nome de MFGE8) [21].